CS260913B1 - Biosensor for lactate determination - Google Patents

Biosensor for lactate determination Download PDF

Info

Publication number
CS260913B1
CS260913B1 CS854194A CS419485A CS260913B1 CS 260913 B1 CS260913 B1 CS 260913B1 CS 854194 A CS854194 A CS 854194A CS 419485 A CS419485 A CS 419485A CS 260913 B1 CS260913 B1 CS 260913B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
biosensor
cavity
lactate
yeast cells
enzyme
Prior art date
Application number
CS854194A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CS419485A1 (en
Inventor
Jan Musil
Jaroslav Racek
Original Assignee
Jan Musil
Jaroslav Racek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jan Musil, Jaroslav Racek filed Critical Jan Musil
Priority to CS854194A priority Critical patent/CS260913B1/en
Publication of CS419485A1 publication Critical patent/CS419485A1/en
Publication of CS260913B1 publication Critical patent/CS260913B1/en

Links

Landscapes

  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Biosenzor pro stanovení laktátu typu Clarkovy elektrody spočívá v tom, že reakční plocha platinové elektrody je zanořena do dutiny těla biosenzoru, která je překryta semipermeabilní membránou, v dutině těla biosenzoru o objemu 20 až 50 ,ul jsou umístěny imobilizované kvasničné buňky.Lactate type biosensor Clark's electrode is that of reaction the platinum electrode surface is embedded into the body cavity of the biosensor that is covered semipermeable membrane, in the cavity biosensor bodies of 20 to 50 µl are immobilized yeast cells are placed.

Description

Vynález se týká biosenzoru typu Clarkovy elektrody pro stanovení laktátu v biologických tekutinách, například v krvi a krevním séru pro potřeby medicíny a v potravinářských výrobcích.The invention relates to a Clark electrode type biosensor for the determination of lactate in biological fluids such as blood and blood serum for medical purposes and in food products.

Dosavadní způsob stanovení laktátu v biologických tekutinách je založen na stanovení účinku laktátdehydrogenasy-c-oxidoreduktasy, E.c.1.1.2.3 - označované též jako - cytochrom Bj podle rovniceThe current method for the determination of lactate in biological fluids is based on the determination of the effect of lactate dehydrogenase-c-oxidoreductase, E.c.1.1.2.3 - also referred to as - cytochrome Bj according to the equation

L - laktát + 2{Fe(CN) J3' laktátdehydrogenág pyruvát + + 2|_Fe(CN)6j’- + 2HL-lactate + 2 {Fe (CN) J 3 'lactate dehydrogen pyruvate + + 2 | _ Fe (CN) 6 ' - + 2H

Měří se bud fotometricky úbytek ferrikyanidu anebo ampérometricky z velikosti elektrického proudu nutného k reoxidaci reakčního produktu ferrokyanidu vzniklého ve shora uvedené reakci. Anodou je Pt-elektroda Clarkova typu spojená v článek s referenční Ag/AgCl elektrodou. Na Pt-elektrodě probíhá děj podle rovnice:Either the loss of ferricyanide is measured photometrically or amperometric from the magnitude of the electrical current required to reoxidize the ferrocyanide reaction product formed in the above reaction. The anode is a Clark-type Pt-electrode connected in a cell to a reference Ag / AgCl electrode. At the Pt-electrode, the process follows the equation:

2[Fe (CN) 634~ -> 2[Fe(CN)633- + 2 e~ a měřený proud je úměrný koncentraci laktátu.2 [Fe (CN) 6 3 4 -> 2 [Fe (CN) 6 3 3 - + 2 e - and the measured current is proportional to the lactate concentration.

Dosud známé laktátové senzory založené na Clarkově elektrodě, jejíž povrch je překryt semipermeabilní membránou mají v prostoru mezi povrchem elektrody a semipermeabilni membránou umístěn enzym cytochromu B. Jejich hlavní nevýhoda spočívá v tom, že použitý enzym má pro daný účel jen omezeně vhodné vlastnosti. Dá se připravit izolaci z přirozeného materiálu. Výsledkem je však nestandardní preparát, závislý extrémně na druhu použitých buněk a podmínkách kultivace. Enzym sám je oligomer, skládá se ze 4 podjednotek, který v roztoku velmi snadno tvoří dvě enzymově aktivní frakce. To značně omezuje způsob purifikace enzymu, například gelovou filtrací. Kromě toho je enzym v roztoku velmi nestálý. Odaje se rozcházejí, zřejmě podle stupně specifické aktivity výchozího preparátu od méně než 24 hodin do několika dni. Ze všech těchto důvodů jsou senzory tohoto typu omezené jen na laboratorní výzkum a ne-jsou vyráběny pro praktické použití.The prior art lactic acid sensors based on Clark's electrode, the surface of which is covered by a semipermeable membrane, have a cytochrome B enzyme located in the space between the electrode surface and the semipermeable membrane. Insulation from natural material can be prepared. However, the result is a non-standard preparation, which is extremely dependent on the type of cells used and the culture conditions. The enzyme itself is an oligomer, consisting of 4 subunits, which very easily form two enzyme-active fractions in solution. This greatly limits the method of purification of the enzyme, for example by gel filtration. In addition, the enzyme in solution is very unstable. The aspirations differ, apparently according to the degree of specific activity of the starting preparation, from less than 24 hours to several days. For all these reasons, sensors of this type are limited to laboratory research and are not manufactured for practical use.

Uvedené nevýhody odstraňuje biosenzor typu Clarkovy elektrody podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že reakční plocha platinové elektrody je zanořena do dutiny těla biosenzoru, která je překryta semipermeabilní membránou. V dutině těla senzoru o objemu 20 až 50 fil jsou umístěny zmobilizované kvasničné buňky, které mohou být imobilizovány v hydrofilním gelu na bázi umělých nebo přirozených látek, například na bázi pólyethylenglykolů nebo agaru a carrageenanu. V dutině těla biosenzoru mohou být umístěny lyofilizované kvasničné buňky. V dutině těla biosenzoru může být umístěn dále enzym urikaza.These disadvantages are overcome by the Clark electrode type biosensor according to the invention, which is based on the fact that the reaction surface of the platinum electrode is immersed in a cavity of the biosensor body, which is covered by a semipermeable membrane. In the cavity of the 20 to 50 µl sensor body there are mobilized yeast cells which can be immobilized in a hydrophilic gel based on artificial or natural substances, for example based on polyethylene glycols or agar and carrageenan. Lyophilized yeast cells can be placed in the cavity of the biosensor body. The uricase enzyme may also be placed in the cavity of the biosensor body.

Umístěním živých buněk do dutiny těla senzoru je možno dosáhnout reprodukovatelného použití po dobu nejméně jednoho měsíce. Toho je dosaženo schopností kvasničních buněk udržet si aktivitu enzymu cytochromu B^ po dlouhou dobu, případně si ho v průběhu používání obnovovat a to i za podmínek používaných pro stanovení laktátu. Množství enzymu v suspenzi buněk přítomné, je vždy. nadbytečné a není tedy limitujícím faktorem pro měření.By placing living cells in the cavity of the sensor body, reproducible use can be achieved for at least one month. This is achieved by the ability of the yeast cells to retain the activity of the cytochrome B ^ enzyme for a long time or to restore it during use, even under the conditions used to determine the lactate. The amount of enzyme present in the cell suspension is always present. and is therefore not a limiting factor for measurement.

Takto uspořádaný buněčný laktátový senzor má zcela srovnatelné vlastnosti jako senzor enzymový. Výsledky s ním dosažené jsou naprosto stejné jako výsledky dosažené standardním spektrofotometrickým postupem a senzorem enzymovým. Suspenzi vhodných kvasničných buněk lze připravit poměrně jednoduchým způsobem z domácích zdrojů.The cell lactate sensor thus arranged has completely comparable properties to the enzyme sensor. The results obtained with it are exactly the same as those obtained by the standard spectrophotometric procedure and the enzyme sensor. A suspension of suitable yeast cells can be prepared in a relatively simple manner from domestic sources.

Biosenzor podle vynálezu je znázorněn na přiloženém výkresu. Je na bázi Clarkovy elektrody, která sestává z platinové elektrody 2 s reakční plochou 1. a referenční elektrody 5 Ag/AgCl umístěné v prostoru 6 vytvořeném v těle senzoru obsahujícím fosfátový pufr s chloridem draselným.The biosensor according to the invention is shown in the attached drawing. It is based on a Clark electrode, which consists of a platinum electrode 2 with a reaction surface 1 and a reference electrode 5 Ag / AgCl located in a space 6 formed in a sensor body containing a phosphate buffer with potassium chloride.

Reakční plocha 1. platinové elektrody 2 je zanořena do dutiny 2 těla senzoru, která je překryta semipermeabilní membránou 4_. V dutině 3 těla senzoru o objemu 20 až 50 /ll jsou umístěny imobilizované kvasničné buňky.The reaction surface 1 of the platinum electrode 2 is immersed in a cavity 2 of the sensor body which is covered by a semipermeable membrane 4. Immobilized yeast cells are placed in the cavity 3 of the 20 to 50 µl sensor body.

Na platinové elektrodě probíhá reoxidace ferrokyanidu vzniklého reakcí L-laktátu a ferrikyanidu za přítomnosti laktátdehydrogenázy obsažené v imobilizovaných kvasinkách.At the platinum electrode, re-oxidation of the ferrocyanide formed by the reaction of L-lactate and ferriyanide occurs in the presence of lactate dehydrogenase contained in immobilized yeast.

Biosenzor lze připravit následovně:The biosensor can be prepared as follows:

1. Postup s prostou suspenzí buněk.1. A simple cell suspension procedure.

Suspenze krvinek typu Hansenula anomala byla pomnožena na Sabouraudově agaru a za přítomnosti laktátu za aerobních podmínek po dobu 48 hodin tak, aby absorbance buněčné suspenze činila při 740 nm v 1-cm vrstvě A = 2,1. Suspenze buněk byla zahuštěna odstředěním (10 minut při 1 000 g). Sediment byl resuspendován v kultivačním médiu. K přípravě biosenzoru bylo použito 20 ^ul této suspenze, které byly vneseny do vybrání v povrchu platinové elektrody a překryty fólií z acetylcelulózy tak, aby pod fólií nebyla bublinka vzduchu.Hansenula anomala cell suspension was expanded on Sabouraud agar and lactate in aerobic conditions for 48 hours so that the absorbance of the cell suspension was at 740 nm in a 1-cm layer A = 2.1. The cell suspension was concentrated by centrifugation (10 min at 1000 g). The sediment was resuspended in culture medium. 20 µl of this suspension was used to prepare the biosensor, which was introduced into a recess in the platinum electrode surface and covered with an acetylcellulose film so that no air bubble was below the film.

• Takto připravený biosenzor je uchováván v roztoku 2 mmol.l ferrikyanidu draselného rozpuštěném ve fosfátovém pufru (0,2 mmol.l 1; pH = 7,2) při teplotě 4 °C. Vlastní stanovení laktátu v krevním séru se provádí takto: 0,3 ml séra krevního se vnese do komůrky naplněné.• biosensor thus prepared is stored in a solution of 2 mM potassium ferricyanide dissolved in a phosphate buffer (0.2 mM 1, pH = 7.2) at 4 ° C. The determination of lactate in blood serum is carried out as follows: 0.3 ml of blood serum is placed in a chamber filled.

ml fosfátového pufru (0,2 mmol.l H pH = 7,2) s obsahem ferrikyanidu draselného (2 mmol.l-!). Obsah komůrky je promícháván magnetickým míchadlem a teplota udržována na 25 °C vodou protékající pláštěm komůrky.ml phosphate buffer (0.2 mM H pH 7.2) containing potassium ferricyanide (2 mM -). The contents of the chamber are agitated with a magnetic stirrer and the temperature is maintained at 25 ° C with water flowing through the chamber jacket.

Během jedné minuty se mění intenzita proudu na citlivém ampérometru. Koncentrace laktátu 1 mmol.l odpovídá proudu 0,55 jUA.The intensity of the current on the sensitive ammeter changes within one minute. The lactate concentration of 1 mmol.l corresponds to a current of 0.55 µA.

2. Postup se suspenzí kvasničnýoh buněk imobilizovaných agarem2. Procedure with suspension of yeast cells immobilized by agar

Příprava kvasinek se provádí jak uvedeno v postupu 1. Po zahuštění se k suspenzi přidá za tepla roztok agaru tak, aby jeho konečná koncentrace nepřekročila 1 %. Po zhomogenizování se směs nechá ztuhnout. Pro přípravu senzoru se použije část gelu o tvaru, odpovídajícím vybrání v platinové elektrodě.Preparation of the yeast is carried out as described in Procedure 1. After concentration, the agar solution is added to the suspension while warming, so that its final concentration does not exceed 1%. After homogenization, the mixture is allowed to solidify. For the preparation of the sensor, a portion of a gel having a shape corresponding to a recess in the platinum electrode is used.

Za jinak nezměněných pracovních podmínek se stanovení laktátu provádí v plné žilní krvi, která byla odebrána za přidání kapky roztoku fluoridu sodného (2 mg/ml).Under otherwise unchanged operating conditions, the lactate determination is performed in whole venous blood, which was collected by adding a drop of sodium fluoride solution (2 mg / ml).

3. Postup se suspenzí živých kvasničných buněk s přidaným enzymem urikazou.3. Procedure with a suspension of viable yeast cells with uricase enzyme added.

Příprava kvasinek se provádí jak je uvedeno v postupu 1. Po zahuštění se k buněčné suspenzi přidá enzym urikaza. Po rovnoměrném rozptýlení enzymu se k vlastní přípravě senzoru používá takto modifikované suspenze v množství 20 ^ul.Yeast preparation is carried out as described in Procedure 1. After concentration, uricase enzyme is added to the cell suspension. After uniformly dispersing the enzyme, 20 µl of the modified suspension is used to prepare the sensor.

Biosenzor podle vynálezu lze použit při stanovení laktátu v krvi. Vzestup koncentrace laktátu v krvi je včasným příznakem rozvoje šoku u osob s rozsáhlými popáleninami, polytraumaty a s těžkou infekcí. Včasné rozpoznání nástupu šoku dovoluje přijmout potřebná opatření k jeho zástavě.The biosensor according to the invention can be used in the determination of lactate in blood. Increased blood lactate concentration is an early symptom of the development of shock in persons with extensive burns, polytrauma and severe infection. Early detection of the onset of shock allows taking the necessary measures to stop it.

Vzestup koncentrace laktátu v krvi nad hranici 4,5 až 8,9 mmol.l 1 přežívá jen 33 % nemocných (vzestup koncentrace nad 9 až 10 mmol.l přežívá již jen méně než 15 %). Proto je tento senzor vhodný k rychlému zjištění koncentrace laktátu v krvi u hromadně se vyskytnuvších úrazů (shora uvedeného typu) jaké mohou nastat za míru, ale zejména při použití prostředků hromadného ničení ve válečném konfliktu. Použití senzoru umožní rychlé třídění nemocných s cílem poskytnout pomoc těm, kteří mají naději na přežití.Only 33% of patients survive the increase of blood lactate concentration above the level of 4.5 to 8.9 mmol.l 1 (the increase of the concentration above 9 to 10 mmol.l survives only less than 15%). Therefore, this sensor is suitable for rapid detection of blood lactate concentration in mass accidents (of the above mentioned type) which may occur in peace, but especially when using means of mass destruction in war conflict. The use of the sensor will allow rapid sorting of patients in order to help those who have a chance of survival.

U špičkových sportovců stanovení laktátu slouží pro zjištění jejich trénovanosti, případně jejich výběr pro určité disciplíny. U dostihových koní pro zjištění jejich trénovanosti. Biosenzor podle vynálezu lze použít při stanovení laktátu v biologických tekutinách, například potravinářského průmyslu, při produkci výrobků založených na bázi mléčného kvašeni.For top athletes, lactate determination is used to determine their training or their selection for certain disciplines. For racehorses to determine their training. The biosensor according to the invention can be used in the determination of lactate in biological fluids, for example the food industry, in the production of lactic acid-based products.

Claims (4)

předmEt vynálezuobject of the invention 1. Biosenzor pro stanovení laktátu typu Clarkovy elektrody, vyznačující se tím, že reakční plocha (1) platinové elektrody (2) je zanořena do dutiny (3) těla biosenzoru, která je překryta semipermeabilni membránou (4), v dutině (3) těla biosenzoru o objemu 20 až 50 <«1 jsou umístěny imobilizované kvasničné buňky.Clark electrode type lactate biosensor, characterized in that the reaction surface (1) of the platinum electrode (2) is immersed in a cavity (3) of the biosensor body which is covered by a semipermeable membrane (4) in the body cavity (3) Immobilized yeast cells are placed in a biosensor with a volume of 20 to 50%. 2. Biosenzor podle bodu 1 vyznačující se tím, že v dutině (3) těla biosenzoru jsou umístěny kvasničné buňky imobilizované v hydrofilním gelu na bázi přirozených gelotvorných látek typu agaru, carrageenanu, nebo umělých látek na bázi polyethylenglykolů.A biosensor according to claim 1, characterized in that yeast cells immobilized in a hydrophilic gel based on natural gelling agents such as agar, carrageenan or polyethylene glycol based synthetic materials are placed in the cavity (3) of the biosensor body. 3. Biosenzor podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že v dutině (3) těla biosenzoru jsou umístěny lyofilizované kvasničné buňky.A biosensor according to claim 1 or 2, characterized in that lyophilized yeast cells are located in the cavity (3) of the biosensor body. 4. Biosenzor podle bodu 1 až 3 vyznačující se tím, že v dutině (3) těla senzoru je umístěn enzym urikaza.A biosensor according to claims 1 to 3, characterized in that uricase enzyme is located in the cavity (3) of the sensor body.
CS854194A 1985-06-11 1985-06-11 Biosensor for lactate determination CS260913B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS854194A CS260913B1 (en) 1985-06-11 1985-06-11 Biosensor for lactate determination

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS854194A CS260913B1 (en) 1985-06-11 1985-06-11 Biosensor for lactate determination

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS419485A1 CS419485A1 (en) 1988-06-15
CS260913B1 true CS260913B1 (en) 1989-01-12

Family

ID=5384133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS854194A CS260913B1 (en) 1985-06-11 1985-06-11 Biosensor for lactate determination

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS260913B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
CS419485A1 (en) 1988-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Updike et al. The enzyme electrode
EP0552223B1 (en) Use of benzene derivatives as charge transfer mediators
Gough The implantable glucose sensor: An example of bioengineering design
O'Brien et al. The α-glycerophosphate cycle in Drosophila melanogaster. I. Biochemical and developmental aspects
JP2006501802A (en) Method for preparing glucose oxidase enzyme having one or more desired properties and glucose oxidase enzyme having desired properties
EP2573171B1 (en) Mutant lactate oxidase with increased stability and product, methods and uses involving the same
Cota-Robles et al. Submicroscopic particles in extracts of Azotobacter agilis
EP0321558A4 (en) L-glutamine sensor
Riedel et al. An electrochemical method for determination of cell respiration
WATANABE et al. Microbial sensors for the detection of fish freshness
Niu et al. Bulk-modified amperometric biosensors for hypoxanthine based on sol–gel technique
Garg et al. Fibre-optic biosensor for the detection of xanthine for the evaluation of meat freshness
Galindo et al. Microbial sensor for penicillins using a recombinant strain of Escherichia coli
Liu et al. Quantitation of glucose concentration using a glucoseoxidase-catalase electrode by potentiometric measurement
Wingard Jr et al. Potentiometric measurement of glucose concentration with an immobilized glucose oxidase/catalase electrode
CS260913B1 (en) Biosensor for lactate determination
WO2005003750A1 (en) Pyrophosphoric acid detection sensor, method of detecting nucleic acid and method of discriminating base variety
Mizutani et al. Use of Polydimethylsiloxane for Constructing Amperometric Glucose‐Sensing Enzyme Electrode with Low Interference Level
Campanella et al. Determination of inorganic phosphate in drug formulations and biological fluids using a plant tissue electrode
Campanella et al. Enzyme-entrapping membranes for enzyme sensors
Cheillan et al. Molecular characteristics of the cholesterol oxidase and factors influencing its activity
Yeh et al. Electrophoretic separation of enzymes of individual flour beetles, Tribolium castaneum, on polyacrylamide gel
CN105628700B (en) Hydrogen peroxide detection kit based on bismuth-bovine serum albumin(BSA)-Platinum Nanoparticles
Malik et al. Purification and characterization of myosin from calf brain
McCollester et al. Membrane isolation and cytoskeletal breakdown: II. Enzyme studies revealing cytoskeletal stabilization by FAD