CS259581B1 - Sposob purifikácie extracelulárnej endo-l,4-6-xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus - Google Patents

Abstract

Riešenie sa týká jednostuipňovej purifiká­ cie extracelulárnej endo-l,4-+xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus indukované] syntetickým induktonom metyl jS-D-xylopyranozidom. Podstatou riešenia je to, že enzym. sa z indukčnéhio média kvasiniek získá ako homogénna bielkovina v jednom purifikačnom stupni ionexovou chromatografiou na kolóne karboxymetyl derivátu sletované­ ho bakteriálneho dextranu (CM-Sephadex C-50] ekvilibrovaného v acetátovom pufri o pH 4,5 až 5,5 tak, že indukčně médium zbavené kvasiniek sa preleje cez připravenu kolonu nosiča, na ktorom sa enzým zachytí a z ktorého sa potom enzým uvolní elúciou stúpajúcim gradientem chloridu sódnelho po· 1,0 až 1,5 M koncentráciu. Enzým má použitie vo sféře základného a aplikovaného výskumu orientovaného na využitie lignocelulózových odpadov· a na uvol'- ňovanie celulóžových vlákien z rastlín ako sú l'an a kiotnope, účinkom enzýmových preparátov. Dá sa využiť i na přípravu vzácných 1,4-jS-xylooligoisacharidO'v z aryl /3-D- -xylopyranozidov.

Description

Vynález sa týká jednostupňovej purifikácie extracelulámej endo-l,4-j3-xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus indukovanéj syntetickým induktorom metyl jS-D-xylopyranozidoim (P. Biely, Z. Krátký a M. Vršanská, CS AO 206 914).

Endo-l,4-jS-xylanázy (EC 3.2.1.8) miikroorganizmov sú spravidla enzýmy sekretované buňkami do prostredia počas rastu na rastlinných xylanoeh, celulóze a iiných rastlinných materiáloch obsahujúcich heml.celulózu. Izolujú a purifikujú sa z pastových médií zbavených buniek producenta. V prvom kroku purifikácie sa rastové médium zahušťuje ultrafiltráciou, vakuovou destiláciou, lyofilizáciou alebo sušením. Zo zahuštěných preparátov sa bielkoviny zrážajú buď organickými rozpúšťadlami, alebo síranom amonným. Koncentrované extracelulárne bielkoviny alebo získané bielkovinné frakcie sa frakcioinujú gélovou filtráciou na sieťovaných polyméroch, alebo ionexovou chromatografiou na róznych druhoch anexov· a katexov ako sú například dietylamínoetyl a karboxymetyl deriváty celulózy a dextránov, a využívá sa tiež hydroxyapatit a mnohé iné nosiče. Prehlad použitých metod purifikácie xylanáz možno nájsť v článku R. F. H. Dekkera a G. N. Richarda (Adv. Carbotoydr. Chem. Biochem. 32, 277, 1976). Purifikácia xylanáz z rastových médií, v ktorých sa používá xylan alebo iný rastlinný materiál ako zdroj uhlíka, bývá komplikovaná skutočnosťou, že zdroj uhlíka sa mikroorganizmom nespotřebuje úplné a jeho zvyšky v rastovom médiu imterferujú s purifikáciiOiu enzýmu v důsledku enzým-suhstrátových interakcií. Příklad interferencie zvyšného xylanu možno nájsť i v případe purifikácie kvasničnej xylanázy (P. Biely, M. Vršanská, Z. Krátký, Eur. J. Biochem. 108, 313, 1980), ktorej je věnovaný tento vynález. Uvedeným ťažkostiam sa dá vyhnúř tak, že produkcia enzýmu v buňkách sa navodí nízkomolekulárnymi látkami, ktoré nie sú súčasne jeho substrátom. IJ niektorých mikroorganizmov ako sú Streptomyces (K. Nakanishi, T. Yasui a T. Kobayashi, J. Ferment. Technol. 54, 801, 1976), kvasinky Cryptococcus albidus (P. Biely, Z. Krátký a M. Vršanská, CS AO 206 914) a Cryptococcus flavus (T. Yasui, B. T. Nguyen a K. Nakanishi, J. Ferment. Technol. 62, 353, 1984) sa dá produkcia xylanázy indukovat metyl 0-D-xylopyranozidom. V případe Streptomyces hoili takto indukované xylanázy purifikovamé klasickými chromatografickými metodami v kombinácii s preparatívnou izoelektricikou fokusáciou (M. Marui, K. Nakanishi a T. Yasui, Agr. Biol. Chem. 49, 3 399, 1985). Výhoda indukcie xylanázy nízkomoilekulárnym induktorom sa pri jej purifikácii prvýkrát využila v případe enzýmu kvasiniek Cryptococcus flavus. Purifikácia enzýmu sa dosiahla v jednom stupni chromatografiou vákuove zahuštěného média na kolóne SP-Sephadexu C-25 (K. Nakanishi, H. Arai a T. Yasui, J. Ferment. Technol. 62, 361, 1984). K uvofneniu enzýmu z uvedeného katexu dochádza pri relativné nízkej koncentrácii chloridu sodného· (0,05 M), čo kladie poměrně vysoké nároky na odistránenie solí z indukčných médií, ktoré by bránili naviazaniu enzýmu na nosič. Extracelulárna xylanáza kvasiniek Cryptococcus albidus, patriaca medzi najlepšie preštudované enzýmy tohto druhu (P. Biely, Z. Krátký a M. Vršanská, Eur. J. Biochem. 119, 559, 1981). sa z indukčných médií s metyl jS-D-xylopyranozidom v minulosti nepurifikovala. Spůsob purifikácie takto indukovaného enzýmu je predmetom tototo vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že extraceulárna eindo-l,4-/3-xylanáza kvasiniek Cryptococcus albidus indukovaná metyl-/S-D-xylopyranozidom tak ako sa popisuje v CS AO 206 914 sa z Indukčného média kvasiniek získá ako homogénina bielkovina v jednom puriflikačnom stupni ionexovou chromatografiou na kolóne karboxymetyl derivátu sletovaného bakteriálneho dextranu (CM-Sephadex C-50, Pharmacia Uppsala, Švédsko) ekvilibrovanom v acetátovom pufri, pH 4,5 až 5,5 tak, že indukčně médium zbavené kvasiniek centrifugáciou sa priamo, alebo po zahuštění vákuovou destiláciou alebo ultrafiltráciou preleje cez pripravenú kolonu nosič a, na ktorom sa enzým zachytí a z ktorého sa potom enzým uvolní elúciou lineárnym gradientem chloridu sodného po 1,0 až 1,5 M koincentráciu. V případe použitia 0,05 M acetátového pufru o pH 5,0 sa enzým vytěsní z kolony ako ostrá bielkovinná frakcia pri 0,45 M koncentrácii chloridu sodného, ktorá sa bud priamo, alebo po zahuštění destiláciou alebo ultrafiltráciou, připadne odsolení dialýzou alebo ultrafiltráciou použije ako zdroj purifikovanej xylanázy.

Výhodou tohto spůsobu purifikácie extracelulárnej endo-l,4-/3-xylanázy Cryptococcus albidus je to, že — je jednoduchý a rýchly predovšetkým v porovnaní s postupom purifikácie enzýmu z rastových médií obsahujúcich rastlinné xylany ako zdroj uhlíka, — enzým sa vytěsňuje z ionexového nosiča vysokou koncentráciou soli (0,45 M chlorid sódny), čo umožňuje enzým viazať na ionexe priamo prelievaním indukčných médiíí zbavených buniek cez ním náplňené kolony; koncentrácia solí v indukčných médiách je nižšia než koncentrácia potřebná na vytesnenie adsorbovaného enzýmu, — enzým sa získá ako elektroforeticky homogénny preparát, ktorý poskytuje počas izoelefctricikej foikusácie v rozmedzí pH 3 až 7, tri až štyri bielkovinné zóny vykazujúce súčasne enzymová aktivitu úměrně k zastúpeniu jednotlivých bielkovín.

δ

Příklad 1

Kvasinky Cryptococcus albidus CCY 17-4-1 (CCY, Československá zbierka kvasiniek, Chemický ústav CChV SAV, Bratislava} vyrastené na tekutej syntetickej pode obsahujúcej 0,67 % ikvasničnej dusíkatej bázy, 0,2 % L-asparagínu, 0,5 % dihydrogenfosforečnanu draselného, 1,0 % D-xylózy na rotačnej trepačke pri 27 °C počas 24—48 hodin sa odstredia a přenesu do· rovnakého syntetického média ako je uvedené vyššie iba s tým rozdielom, že D-xylóza sa nahradí metyl /3-D-xylopyranozidoim v koncentrácii 0,5 mg/ml. Po 24 až 48 hodinovej inkubácii na rotačnej trepačke pri 27 °C sa suspenzia kvasiniek centrifuguje a supernatant obsahu júci v 1 ml přibližné 1,4 jednotiek xylanázy sa zahustí na rotačnej vákuovej odparke pri 35 °C na 1/5 až 1/10 povodného objemu, zdialyzuje sa oproti destilované j vodě pri 4 °C (20 hodin) a preleje sa cez kolonu CM-Sephadexu C-50 (1,8 X 20 cm) ekvilibrovaného 0,05 M acetátovým pufrom o pH 5,0. Po přetečení objemu vzorky sa kolona eluuje lineárnym gradientom chloridu sárneho v 0,05 M acetátovom pufri (240 ml) až po 1,5 M koncentráciu chloridu sodného. Zachytávajú sa 3,5 ml frakcie, ktoré sa analyzujú na enzýmovú aktivitu a bielkoviny. Na obr. 1 je znázorněná elúcia xylanázy z kolony CM-Sephadexiu C-50. V zachytávaných frakciách sa stanovili bielkoviny meraním absorbancle pri 280 nm (bodkovaná čiaraj, aktivita xylanázy (plná čiara cez body] a koncentrácia chloridu sódneho (přerušovaná čiara). Aktivně frakcie sa zlejú, dialyzujú proti destilovanej vodě (4 °C, 20 hodin) a použijú ako enzýmový preparát. Enzým sa získá v 35 %-nom výtažku o špecifickej aktivitě 42,6 jednotiek na mg bielkoviny (tabulka 1).

Tabulka 1

Purifikácia xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus indukovaínej metyl /S-D-xylopyranozidom

Stádium purifikácie	Objem	Celková aktivita	Celkové bielkoviny	Specifická aktivita	Výťažok
Indukčně	ml	jedn.’	mg	jedn./mg	%
médium Koncentrované indukčně	480	816	120	6,8	100
médium	80	760	104	7,3	93
CM-Sephadex	33	290	6,8	42,6	35,5

^aStanovenie enzýmovej aktivity a definícia jednotky enzýmovej aktivity je popísané v literatuře (P. Biely, M. Vršanská a Z. Krátký, Eur. J. Biochem. 108, 313, 1980).

Enzým indukovaný metyl /í-D-xylopyr,a,nozidom je totožný s enzýmom produkovaným kvasinkou Cryptococcus albidus počas rastu na xylane a purifikovaným podfa publikovaného postupu (P. Biely, M. Vršanská a Z. Krátký, Eur. J. Biochem. 108, 313, 1980). Oba preparáty dávajú jedi-nú a rovnako sa .pohybu júcu difúznu zónu bielkoviny a enzýmovej aktivity počas elektroforézy v polyakrylamidovom géli. Enzymy sa javia identické počas izoelektrickej fokusácie v tenkej vrstvě polyakrylamidového· gélu v rozmedzí pH 3 až 7. Niekoíko foriem bielíkovín detekovaných farbivom Comassie Brilliant Blue R-250 vykazovalo úměrně k množstvu bielkoviny enzýmovú aktivitu, ktorá sa detekovala kovalentne vyfarbeným xylanom (P. Biely, O. Markovič a D. Mislovičová, Anal. Biochem. 144, 147, 1985). Příklad 2

Supernatant s naindukovanou xynalázou získaný centrifugáciou suspenzie kvasiniek inkubovainých s metyl /3-D-xylopyranozidom tak ako je popísané v příklade 1 sa nezahusťuje, ale priamo prelieva cez kolonu CM-Sephadexu C-50. Zachytená xylanáza sa z kolóny vytěsní a ďalej spracuje tak, ako je uvedené v příklade 1. Výťažok a stupeň purifikácie enzýmu odpovedá hodnotám v tabufke 1.

Příklad 3

Enzým sa u kvasiniek indukuje tak, ako je popísané v příklade 1 a aplikuje sa na kolónu CM-Sephadexu C-50 tak, ako je uvedené v příklade 2. Xylanáza sa z kolóny vytěsní následovně: kolona sa najprv premyje 0,25 M roztokom chloridu sódneho v 0,05 M acetátoivom pufri o pH 5,0 (75 mol) a potom lineárnym gradientom chloridu sódneho po 1,0 M koncentráciu v rovnakom acetátovom pufri (150 ml). Xylanáza sa izoluje zahuštěním a odsolením frakcie vytesnenej pri 0,45 M koncentrácii chloridu sódneho. Výťažok a stupeň purifikácie enzýmu odpoivedá hodnotám v tabufke 1,

S S 7

Endo-l,4-/S-xylainázy sú v poslednom období predimetom Intenzívnebo štúdia v súvise s narastajúcim záujmom o využitia lignoeelulózových odpadov ako zdrojov sacíiaridov pre fermentačný prietmysel. Purififcovaná xylanáza kvasiniek Cryptococcus albidus sa dá v tomto zmysle využiť ako modelový enzym. Ďalšie použitie má vo sféře základného výskumu, hlavně pri štrukturálnych štúdiách xylanov a pri štúdiu úlohy xylanáz v procese izolácie celulózových

1 vlákien z rastlín ako sú konope a lan, účinkom komplexných enzýmových preparátov, ktorých súčastou sú aj xylanázy. Purifikovaná xylanáza kvasiniek Cryptococcus albidus sa dá využiť na přípravu poměrně vzácných l,4-j3-xyloologisacharidov z aryl β-D-xylopyranozidov transglykozylačnými reakciami, ktoiré enzým katalyzuje pri vysokých konce,ntráciách aryl xyíozidov (Z. Krátký, P. Biely a M. Vrštanská, CS AO 218 624).

Claims (4)

1. PREDMET

   1. Sposob purifikácie extracelulárnej endo-l,4-/3-xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus indukované] metyl β-D-xyIopyranozidom vyznačujúci sa tým, že indukčně médium s obsiahnutým enzýmom sa uvedie do styku s ionexom na báze karboxymetyl derivátu sieťovamého bakteriálneho dextranu, na ktorý sa enzým naadsorbuje a z ktorého sa potom uvolní stúpajúcim gradientom chloridu sodného až do 1,5 M koncentrácie.

   VYNÁLEZU
2. 2. Sposob podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa nosič na chromatografiu ekvilibruje acetátovým pufrom o pH 4,5 až 5,5.
3. 3. Sposob purifikácie podlá bodov 1 a 2 vyznačujúci sa tým, že sa použije 0,05 M acetátový pufer o pH 5,0 a enzým sa uvolní pri 0,45 M koncentrácií chloridu sodného.
4. 4. Sposob podlá bodov 1 až 3 vyznačujúci sa tým, že enzymový roztok sa ďalej zbaví solí a zahustí.

   1 list výkresov