CS259581B1 - Sposob purifikácie extracelulárnej endo-l,4-6-xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus - Google Patents

Description

239381

Vynález sa týká jednostupňovej purifiká-cie extracelulámej endo-l,4-j3-xylanázy kva-siniek Cryptococcus albidus indukované]'syntetickým induiktorom metyl jS-D-xylopyra-nozidom (P. Biely, Z. Krátký a M. Vršanská,CS AO 206 914).

Endo-l,4-/3-xylanázy (EC 3.2.1.8) mikro-organizmov sú spravidla enzýmy sekretova-né buňkami do prostredia počas rastu narastlinných xylanoeh, celulóze a iiných rast-linných materiáloch obsahujúcich hemi.ce-lulózu. Izolujú a purifikujú sa z pastovýchmédií zbavených buniek producenta. V pr-vom kroku purifikácie sa rastové médiumzahušťuje ultrafiltráciou, vakuovou desti-láciou, lyofilizáciou alebo sušením. Zo za-huštěných preparátov sa bielkoviny zrážajúbuď organickými rozpúšťadlami, alebo síra-nom amonným. Koncentrované extracelu-lárne bielkoviny alebo získané bielkovinnéfrakcie sa frakcioinujú gélovou filtráciouna sieťovaných polyméroch, alebo ionexo-vou chromatografiou na róznych druhochanexov a katexov ako sú například dietyl-amínoetyl a karboxymetyl deriváty celuló-zy a dextránov, a využívá sa tiež hydroxy-apatit a mnohé iné nosiče. Prehlad použi-tých metod purifikácie xylanáz možno nájsťv článku R. F. H. Dekkera a G. N. Richar-da (Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 32,277, 1976). Purifikácia xylanáz z rastovýchmédií, v ktorých sa používá xylan alebo inýrastlinný materiál ako zdroj uhlíka, bývákomplikovaná skutočnosťou, že zdroj uhlí-ka sa mikrooirganizmom nespotřebuje úpl-né a jeho zvyšky v rastovom médiu interfe-rují! s purifikáciiOiu enzýmu v důsledku en-zým-substrátových interakci!. Příklad inter-ferencie zvyšného xylanu možno nájsť i vpřípade purifikácie kvasničnej xylanázy (P.Biely, M. Vršanská, Z. Krátký, Eur. J. Bio-chem. 108, 313, 1980), ktorej je věnovanýtento vynález. Uvedeným ťažkostiam sa dávyhnúí tak, že produkcia enzýmu v buň-kách sa navodí nízkomolekulárnymi látka-mi, ktoré nie sú súčasne jeho substrátom.IJ nieiktorých mikroorganizmov ako sú Strep-tomyces (K. Nakanishi, T. Yasui a T. Kobay-ashi, J. Ferment. Technol. 34, 801, 1976),kvasinky Cryptococcus albidus (P. Biely, Z.Krátký a M. Vršanská, CS AO 206 914) aCryptococcus flavus (T. Yasui, B. T. Nguyena K. Nakanishi, J. Ferment. Technol. 62,353, 1984) sa dá produkcia xylanázy indu-kovat metyl (3-D-xylopyranozidom. V přípa-de Streptomyces boili takto, indukované xy-lanázy purifikovamé klasickými chromato-grafickými metodami v kombinácii s pre-paratívnou izoelektrickou fokusáciou (M.Marui, K. Nakanishi a T. Yasui, Agr. Biol.Chem. 49, 3 399, 1985). Výhoda indukciexylanázy nízkomoilekulárnym induktoromsa pri jej purifikácii prvýkrát využila v pří-pade enzýmu kvasiniek Cryptococcus fla-vus. Purifikácia enzýmu sa dosiahla v jed-nom stupni chromatografiou vákuove za- huštěného média na kolóne SP-SephadexuC-25 (K. Nakanishi, H. Arai a T. Yasui, J.Ferment. Technol. 62, 361, 1984). K uvol-neniu enzýmu z uvedeného katexu dochád-za pri relativné nízkej koncentrácii chlo-ridu sodného, (0,05 M), čo kladie poměrněvysoké nároky na odstránenie solí z in-dukčných médií, ktoré by bránili naviaza-niu enzýmu na nosič. Extraceluláma xyla-náza kvasiniek Cryptococcus albidus, patri-aca medzi najlepšie preštudované enzýmytohto druhu (P. Biely, Z. Krátký a M. Vr-šanská, Eur. J. Biochem. 119, 559, 1981). saz indukčných médií s metyl (3-D-xylopyra-nozidom v minulosti nepurifikovala. Sposobpurifikácie takto indukovaného enzýmu jepredmetom tohto vynálezu.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že ex-traceulárna eindo-l,4-/3-xylanáza kvasiniekCryptococcus albidus indukovaná metyl-/S--D-xylopyranozidom tak ako sa popisuje vCS AO 206 914 sa z indukčného média kva-siniek získá ako homogénna bielkovina vjednom purifiikačnom stupni ionexovouchromatografiou na kolóne karboxymetylderivátu sletovaného bakteriálneho dextra-nu (CM-Sephadex C-50, Pharmacia Uppsala,Švédsko) ekvilibrovanom v acetátovom puf-ri, pH 4,5 až 5,5 tak, že indukčně médiumzbavené kvasiniek centrifugáciou sa pria-mo, alebo po zahuštění vákuovou destilácioualebo ultrafiltráciou preleje cez pripravenúkolonu nosič a, na ktorom sa enzým zachytía z ktorého sa potom enzým uvolní elúcioulineárnym gradientom chloridu sodného po1,0 až 1,5 M komcentráciu. V případe použi-tia 0,05 M acetátového pufru o pH 5,0 saenzým vytěsní z kolony ako ostrá bielko-vinná frakcia pri 0,45 M koncentrácii chlo-ridu sodného, ktorá sa buď priamo, alebopo zahuštění destiláciou alebo ultrafiltrá-ciou, připadne odsolení dialýzou alebo ul-trafiltráciou použije ako zdroj purifikova-nej xylanázy. Výhodou tohto sposobu purifikácie extra-celulárnej endo-l,4-/3-xylanázy Cryptoco-ccus albidus je to, že — je jednoduchý a rýchly predovšetkýmv porovnaní s postu,porn purifikácie enzýmuz rastových médií obsahujúcich rastlinnéxylany ako zdroj uhlíka, — enzým sa vytěsňuje z ionexového no-siča vysokou koncentráciou soli (0,45 Mchlorid sódny), čo umožňuje enzým viazaťna ionexe priamo prelievaním indukčnýchmédiíí zbavených buniek cez ním náplňenékolony; koncentrácia solí v indukčných mé-diách je nižšia než koncentrácia potřebnána vytesnenie adsorbovaného enzýmu, — enzým sa získá ako elektroforetickyhomogénny preparát, ktorý poskytuje po-čas izoelektricikej foikusácie v rozmedzí pH3 až 7, tri až štyri bielkovinné zóny vyka-zujúce súčasne enzymová aktivitu úměrněk zastúpeniu jednotlivých bielkovín. 259581 Příklad 1

Kvasinky Cryptococcus albidus CCY 17-4--1 (CCY, Československá zbierka kvasiniek,Chemický ústav CChV SAV, Bratislava] vy-rastené na tekutej syntetické) pode obsa-hujúcej 0,67 % ikvasničnej dusíkatej bázy,0,2 % L-asparagínu, 0,5 % dihydrogenfosfo-rečnanu draselného, 1,0 % D-xylózy na ro-tačnej trepačke pri 27 °C počas 24—48 ho-din sa odstredia a přenesu do, rovnakéhosyntetického média ako je uvedené vyššieiba s tým rozdielom, že D-xylóza sa na-hradí metyl /3-D-xylopyranozidom v koncen-trácii 0,5 mg/ml. Po 24 až 48 hodinové) in-kubácii na rotačně] trepačke pri 27 °C sasuspenzia kvasiniek centrifuguje a super-natant obsahu júci v 1 ml přibližné 1,4 jed-notiek xylanázy sa zahustí na rotačmej vá-kuovej odparke pri 35 °C na 1/5 až 1/10 pó-vodného objemu, zdialyzuje sa oproti des-tilované) vodě pri 4 °C (20 hodin) a pre- leje sa cez kolonu CM-Sephadexu C-50(1,8 X 20 cm) ekvilibrovaného 0,05 M ace-tátovým pufrom o pH 5,0. Po přetečení ob-jemu vzorky sa kolona eluuje lineárnymgradientom chloridu sárneho v 0,05 M ace-tátovom pufri (240 ml) až po 1,5 M kon-centráciu chloridu sodného. Zachytávajú sa 3,5 ml frakcie, ktoré sa analyzujú na enzý-movú aktivitu a bielkoviny. Na obr. 1 jeznázorněná elúcia xylanázy z kolony CM--Sephadexu C-50. V zachytávaných frak-ciách sa stanovili bielkoviny meraním ab-sorbancie pri 280 mm (bodkovaná čiara),aktivita xylanázy (plná čiara cez body) akoncentrácia chloridu sódneho (přerušova-ná čiara). Aktivně fraikcie sa zlejú, dialy-zujú proti destilovanéj vodě (4 °C, 20 ho-din) a použijú ako enzymový preparát. En-zým sa získá v 35 %-nom výtažku o špeci-fickej aktivitě 42,6 jednotiek na mg bielko-viny (tabulka 1).

Tabulka 1

Purifikácia xylanázy kvasiniek Cryptococcus albidus indukovanej metyl /S-D-xylopyra-nozidom

Stádium purifikácie Objem Celková aktivita Celkové bielkoviny Specifická aktivita Výťažok Indukčně ml jedn.’ mg jedn./mg % médium Koncentrované indukčně 480 816 120 6,8 100 médium 80 760 104 7,3 93 CM-Sephadex 33 290 6,8 42,6 35,5 aStanovenie enzýmovej aktivity a definícia jednotky enzýmovej aktivity je popísané vliteratúre (P. Biely, M. Vršanská a Z. Krátký, Eur. J. Biochem. 108, 313, 1980).

Enzým indukovaný metyl /í-D-xylopyrano-zidom je totožný s enzýmom produkovanýmkvasinkou Cryptococcus albidus počas ras-tu na xylane a purifikovaným podl'a publi-kovaného postupu (P. Biely, M. Vršanská aZ. Krátký, Eur. j. Biochem. 108, 313, 1980).Oba preparáty dávajú jedi-nú a rovnako sapohybu jdou difúznu zónu bielkoviny a en-zýmovej aktivity počas elektroforézy v po-lyakrylamidovom géli. Enzymy sa javia i-dentické počas izoelektrickej fokusácie vtenkej vrstvě polyakrylamidového' gélu vrozmedzí pH 3 až 7. Niekolko foriem bielko-vín detekovaných farbivom Comassie Bril-liant Blue R-250 vykazovalo úměrně kmnožstvu bielkoviny enzýmovú aktivitu,ktorá sa detekovala kovalentne vyfarbenýmxylanom (P. Biely, O. Markovič a D. Mislo-vičová, Anal. Biochem. 144, 147, 1985).Příklad 2

Supernatant s naindukovanou xynalázou získaný centrifugáciou suspenzie kvasiniek inkubovaných s metyl /3-D-xylopyranOzidom tak ako je popísané v příklade 1 sa neza-husťuje, ale priamo prelieva cez kolonuCM-Sephadexu C-50. Zachytená xylanázasa z kolóny vytěsní a ďalej spracuje tak,ako je uvedené v příklade 1. Výťažok astupeň purifikácie enzýmu odpovedá hodno-tám v tabulke 1. Příklad 3

Enzým sa u kvasiniek indukuje tak, akoje popísané v příklade 1 a aplikuje sa nakolónu CM-Sephadexu C-50 tak, ako je uve-dené v příklade 2. Xylanáza sa z kolóny vy-těsní následovně: kolona sa najprv premyje0,25 M roztokám chloridu sódneho v 0,05M acetátovom pufri o pH 5,0 (75 mol) apotom lineárnym gradientom chloridu sód-neho po 1,0 M koncentráciu v rovnakomacetátovom pufri (150 ml). Xylanáza sa i-zoluje zahuštěním a odsolením frakcie vy-tesnenej pri 0,45 M koncentrácii chloridusódneho. Výťažok a stupeň purifikácie en-zýmu odpovedá hodnotám v tabulke 1,

Claims (4)

1. 2 S S7 Endo-l,4-/S-xylainázy sú v poslednom ob-dobí predmetom intenzívneho štúdia v sú-vise s narastajúcim záujmom o využitie lig-noeelulózových odpadov ako zdrojov sacíia-ridov pre fermentačný prietmysel. Purififco-vaná xylanáza kvasiniek Cryiptococcus albi-dus sa dá v tomto zmysle využit ako mode-lový enzym. Ďalšie použitie má vo sféře zá-kladného výskumu, hlavně při štrukturál-nych štúdiách xylanov a pri stádiu úlohyxylanáz v procese izolácie celulózových 8 1 8 vlákien z rastlín ako sú konope a lan, ú-činkom komplexných enzýmových prepará-tov, ktorých súčastou sú a] xylanázy. Pun-tíkovaná xylanáza kvasiniek Cryptococcusalbidus sa dá využit na přípravu poměrněvzácných l,4-j3-xyloologisacharidov z aryl β--D-xylopyranozidov transglykozylačnými re-akciami, ktoiré enzým katalyzuje pri vyso-kých koncentráciách aryl xyíozidov (Z.Krátký, P. Biely a M. Vrštanská, CS AO218 624). PREDMET

   1. Sposob purifikácie extracelulárnejendo-l,4-/3-xylanázy kvasiniek Cryiptococcusalbidus indukované] metyl p-D-xylopyrano-zidom vyznačujúci sa týni, že indukčně mé-dium s oibsiahnutým enzýmom sa uvediedo styku s ionexom na báze karboxymetylderivátu sletovaného bakteriálneho dextra-nu, na ktorý sa enzým naadsorbuje a z kto-rého sa potom uvolní stúpajúcim gradien-tom chloridu sodného až do 1,5 M koncen-trácie. VYNÁLEZU
2. 2. Sposob podlá bodu 1, vyznačujúci satým, že sa nosič na chromatografiu ekvilib-ruje acetátovým pufrom o pH 4,5 až 5,5.
3. 3. Sposob purifikácie podl'a bodov· 1 a 2vyznačujúci sa tým, že sa použije 0,05 Macetátový pufer o pH 5,0 a enzým sa uvol-ní pri 0,45 M koncentrácií chloridu sodné-ho.
4. 4. Sposob podlá bodov 1 až 3 vyznačujúcisa tým, že enzymový roztok sa ďalej zbavísolí a zahustí. 1 list výkresov