CS259363B1

CS259363B1 - Sposob stanovenia bielkovín detekčnon technikou striebrom

Info

Publication number: CS259363B1
Application number: CS857393A
Authority: CS
Inventors: Kamil Marcinka
Original assignee: Kamil Marcinka
Priority date: 1985-10-17
Filing date: 1985-10-17
Publication date: 1988-10-14
Also published as: CS739385A1

Description

259363

Vynález sa týká sposobu stanovenia biel-kovín detekčnou technikou striebrom použi-tím amoniakálneho strieborného komplexu.

Metódu stanovenia bielkovín, kde sa na-miesto amoniakálneho strieborného komple-xu používá roztok dusičnanu striebornéhouviedli Merril a spolupracovníci (Electro-phoresis 3, 17, 1982). Na dosiahnutie opti-málneho výsledku třeba po farbení gél tři-krát odfarbiť a znovu zafarbiť, ostává všakpozadie. Sammons a spol. vyvinuli metódu,ktorou sa docielia u zafarbených bielkovínrózne farebné odtiene, ktoré však majú in-tenzívně žltooranžové pozadie (Electropho-resis 2, 135, 1981). Porovnáním šiestich me-tod farbenia striebrom v laboratóriu tohtoautora je táto metoda hodnotená ako naj-lepšia (Ochs D. C., Mc Conkey E. H. a Sam-mens D. W.: Electrophoresis 2, 304, 1981).Guevav a spol. pridávajú do všetkých roz-tokov 20 % etanol na zvýšenie citlivosti me-tódy a zníženie intenzity pozadia (Electro-phoresis 3, 197, 1982). Oshawa K. a Ebata N. používajú na fixovanie bielkovín a od-vodnenie gélu 70 % roztok polyetylénglyko-lu 2 000 (Anal. Biochem. 135, 409, 1983). Prireprodukovaní tejto metody vzniklo velmiintenzívně šedočierne pozadie, takže vý-sledky nebolo možno hodnotil. Pranie géluv 10% vodnom roztoku glutaraldehydu prvýuviedol Oakley a spol. (Anal. Biochem. 105,361, 1980). Takto spracované gély majú všakintenzívně šedé až hnedošedé pozadie.

Uvedené nevýhody doterajších metod sta-novenia bielkovín odstraňuje sposob stano-venia podlá vynálezu, ktorého podstata spo-čívá v tom, že sa platňový gél po elektrofo-retickej frakcionácii bielkovín prepiera dva-krát 30 minút fixačno-vymývacím roztokompozostávajúcim zo zmesi metanol, kyselinaoctová, voda a glutaraldehyd v objemovýchpomeroch 50 : 12 : 38 : 0,2 až 0,5, potomsa gél 30 až 40 min. premýva vodou a 10 až20 minút sa naň posobí roztokom amonia-kálneho strieborného komplexu, pozostáva-júceho s výhodou zo zmesi roztokov 0,1 Mhydroxidu sodného, 26% hydroxidu amon-ného, 20% dusičnanu strieborného a vodyv objemových pomeroch 10 : 0, 42 : 1, 65 :: 88, po ktorom sa gél premyje 20 až 30 mi-nút 0,001 M hydroxidom sodným a nakoniecsa vyvolá roztokom 0,005 %-nej kyseliny cit-rónové]' a 0,1 %-ného formaldehydu. Výhoda uvedeného spůsobu stanoveniabielkovín spočívá v tom, že sa výrazné zvý-ši účinok glutaraldehydu (použije sa jedna štyridsiatina oproti doterajším sposobom),súčasne sa prakticky odstráni vplyv glutar-aldehydu na pozadie gélu. Okrem toho pra-ním gélu alkalickým roztokom po působeníamoniakálneho strieborného komplexu sa zgélu vymyjú zvyšky strieborných iónov atým sa dosiahne, že zafarbené gély majúzanedbatelné pozadie pri zachovaní vyso-kej citlivosti a reprodukovatelnosti stano-venia. Údaje v %, pokial nie je uvedené i-náč, vyjadrujú koncentráciu látky v rozto-ku, t. j. v gramoch na 100 ml roztoku. Příklad 1

Po skončení elektroforézy sa gél s plo-chou 150 cm2 a hrúbkou 1 mm perie dva-krát 30 minút vo fixačno-vymývacom rozto-ku pozostávajúcom zo zmesi metanol, kyse-lina octová a voda a glutaraldehyd v obje-movom pomere 50 : 12 : 38 : 0,25, potom sapremyje 30 minút vodou, na premytý gél saposobí 15 minút roztokom amoniakálnehostrieborného komplexu (připraveného zmie-šaním roztokov 0,1 M hydroxidu sodného,26% hydroxidu amónneho, 20% dusičnanustrieborného a vody v objemovom pomere10 : 0,42 : 1,65 : 88), gél sa ďalej vymyje0,001 M hydroxidom sodným 30 minút a po-tom sa vyvolá roztokom 0,005 %-nej kyseli-ny citrónovéj a 0,1 %-ného formaldehydupočas 2 až 3 min. V takto spracovanom gélesa proces vyvolávania zastaví 10 min. pra-ním v roztoku 20 %-ného metanolu a 0,05 %-nej kyseliny citrónovej. Nasledujúcim jed-notlivým praním v 500 ml vody pri jednejvýměně vody za čerstvá, sa získá gél vhodnýna vyhodnotenie. Příklad 2

Postupovalo sa ako v příklade 1 s týmrozdielom, že fixačno-umývací roztok obsa-hoval 0,5% glutaraldehydu, po ňom sa gélpremýval 45 minút vodou. Po aplikácii roz-toku amoniakálneho strieborného komple-xu sa gél vymýval 40 minút.

Vynález je možné využit všade tam, kdeje potřebné stanovit velmi malé množstvábielkovín, analyzovaných v platňových poly-akrylamidových géloch. Je to najma v bio-chemických pracoviskách najróznejšieho za-merania, v klinických laboratóriách i v nie-ktorých priemyselných odvetviach napr. vpivovarníctve, farmaceutickom priemysle apod,

Claims

259363 5 6 PREDMET

1. Spósob stanovenia bielkovín detekčnoutechnikou striebrom po elektroforetickejfrakcionácii bielkovín, vyznačujúci sa tým,že plátnový gél sa po elektroforetickej frak-cionácii bielkovín prepiera dvakrát po do-bu do 30 minút fixačno-vymývacím rozto-kom pozostávajúcim zo zmesi metanol, ky-selina octová, voda a glutaraldehyd v ob-jemových pomeroch 50 : 12 : 38 : 0,2 až 0,5,potom sa gél 30 až 40 minút premýva vo-dou a 10 až 20 minút sa naň posobí rozto-kom amoniakálneho strieborného komplexu,po ktorom sa gél premýva 20 až 30 minútroztokom hydroxidu sodného a nakoniec savyvolá roztokom kyseliny citrónovej a roz-tokom formaldehydu. vynalezu
2. Sposob stanovenia bielkovín podl'a bo-du 1, vyznačujúci sa tým, že roztok amonia-kálneho strieborného roztoku sa získá zmie-šaním 0,1 M roztoku hydroxidu sodného, 26percentného roztoku hydroxidu amonného,20 %-ného roztoku dusičnanu striebornéhoa vody v objemovom pomere 10 : 0,42 : 1,65 :: 88.
3. Spůsob stanovenia bielkovín podlá bo-du 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije pre-mývací roztok hydroxidu sodného o kon-centrácii 0,001 M.
4. Sposob stanovenia bielkovín podlá bo-du 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije 0,005pere. roztok kyseliny citrónovej a 0,1 %-ný roztok formaldehydu.