CS259289B1 - Spósob uvofňovania cytoplazmatického obsahu kvasiniek indukovanou autolýzou - Google Patents

Description

Vynález sa týká spósobu uvoíňovania cy-toplazmatického obsahu kvasiniek induko-vanou autolýzou za účelom získavania potra-vinářsky a farmaceuticky využitelných buň-kových komponent.

Na rozrušenie bunkovej steny a tým sprí-stupnenie proteínov a ostatných zložiek bio·-masy kvasiniek sa používajú rožne fyzikál-ně, chemické a biochemické spósoby dezin-tegrácie, pričom potřebný stupeň rozruše-nia buňky sa dosahuje často kombinácioutýchto metod.

Jednou z fyzikálnych metod dezintegrácieje balotlnová dezintegrácia, čo je vlastnědrvenie alebo mletie biomasy v zariadeniachs roznymi abrazívami (Mogren, H., Lind-blom, H., Hedenskog, G., Biotechnol. Bioeng.16, 261—274, 1974). Nevýhodou tohto spó-sobu je poměrně velký otěr abrazíva, s čímsúvisí potřeba viacnásobného premývania alokálně zahrievanie susepnzie vyžadujúcechladenie.

Vysokotlaková metoda dezintegrácie(Brookman, J. S., Biotechnol. Bioeng. 17,465—479, 1975} spočívá v tom, že suspenziakvasiniek prechádza z oblasti vysokého tla-ku cez trysky dezintegračného zariadeniado oblasti normálneho tlaku. Rozbitie bu-niek je v priamej závislosti na hodnotě hyd-rostatického tlaku a na rýchlosti změny tla-ku v prostředí, v ktorom sú buňky suspen-dované. Aj pri poměrně vysokých hodnotáchtlaku sa však tento spósob vyznačuje po-měrně nízkou účinnosťou, nesúcou so sebounutnost viacnásobne oipakovať proces, čímvznikajú fragmenty róznych velkostí a pro-blémy pri ich separácii. Navýše zahrievaniepri změnách tlaku může viesť k inaktiváciiintrancelulárnych enzýmov.

Princípom dezintegrácie explozívnou de-kompresiou je nasýtenie suspenzie vhodnýmplynom pod tlakom a rýchle zníženie tlaku(Nesterov, A. I., Stavoroitova, G. A., Prikl.Biochim, Mikrobiol. 11, 593—597, 1975). Ná-sledkom vyrovnávania tlakového rozdielu vovnútri buňky a jej okolí dochádza k rozru-šeniu buňkových stien. Vnútrobunečný ob-sah však zostáva z velkej časti vnútri bu-niek, nakofko rozrušená buňka po krátko-dobom působení dezintegrácie už nie je me-chanicky namáhaná. To si vyžaduje nutnosťviacnásobného opakovania dezintegrácie.

Okrem týchto najznámejších spósobov dez-integrácie sa zriedkavo využívá aj ultraso-nikácia, zmrazovanie, sušenie.

Chemické spósoby spočívajú v pósobeníurčitých látok (napr. tiolov) na zložky bun-kovej steny, čím sa buňková stená labilizu-je až ropzadá (Shetty, J. K., Kinsella, J. E.,Biotechnol. Bioeng. 20, 755—766, 1978).

Biochemické metody sú založené na en- zymatickom pósobení cudzieho alebo vlast- ného lytického aparátu na bunkovú stenu. V experimentálnych podmienkach je hojné rozšířené napma využívanie exogénnych sy- stémov (Phaff, M. J., Adv. Chem. Ser. 160,249—282, 1977) získaných z baktérií Arthro-bacter luteus, Bacillus subtilis, húb Oersko-wia, Albus, Coprinus, Flavus a dalších, ale-bo sa v laboratórnom rozsahu využívá trá-viaca šťava slimáka Helix pomatia.

Poměrně menej sa využívá endogénny ly-tický systém kvasiniek (Chrenova, N. M.,Bezrukov, M. G., Kogan, A. S., Sergejev, W.A., NahíFung 25-, 837—844, 1981). Buňka zaurčitých okolností (vyčerpáme živin, ne-vhodná teplota, Ph) produkuje lytické en-zýmy — andopeptidázy, karboxypeptidázy,aminopeptidázy, kyslú fosfatázu, /3-(l,3)gIu-kanázu, které pósobie na vlastnú bunkovústenu a rozkladajú ju. Tento proces — auto-lýza priebeha v konečnom důsledku až doroaloženia buniek na základné zložky akosú aminokyseliny, patidy, nukleotidy, nízko-molekulové sacharidy, vitamíny atď. Ak savšak vedle len do určitého požadovanéhostupňa, móže slúžif ako vhodný prostriedokna dezintegráciu buňky a uvoíňovanie pro-teínov a iných vnútrobunečných zložiek doprostredia. Doba prirodzeného autolytickéhoprocesu je poměrně dlhá (niekolko dní),čo vyvolává riziko bakteriálnej kontaminá-cie.

Tento nedostatok v podstanej miere od-straňuje spósob podlá vynálezu, ktoréhopodstata spočívá v tom, že na vstupnú suro-vinu o sušině 5 až 30 % hmot. sa působíaktívnym autolyzátom v objemovom pomere1 : 3 až 1 : 12, zmes sa lyžuje za miešaniapri teplote 45 až 55 °C počas 5 až 30 hodin.Na vstupnú surovinu sa súčasne s autoly-zátom móže pósobiť etanolom v hmotnost-nom pomere 1 : 99 až 1 : 9 a/alebo- chlo-ridem sodným v hmotnostnom pomere 1 ku999, až; 1 : 9.

Spósob podlá vynálezu rozšiřuje paletudoposiaf používaných iniciačných faktorovautolýzy. Spočívá v iniciácii autolýzy přidá-ním. vhodného množstva už zhyzovanej sus-penzie tohoistého mikroorganizmu. V pridá-vanom lyzáte sú už neprodukované a uvol-něné lytické enzýmy, ktoré můžu hned ata-kovat buňkové steny,, tieto sa stávajú prí-stupnejšie vlastnému lytickému systému,ktorý sa zatial’ utvoří a proces rozloženiabuňky sa takto podstatné skráti na 5 až 30hodin.

Kombináciou s inými iniciačnými faktor-mi, ako je chlorid sodný a etanol sa eštezefektivni pósobenie autolytického systému.Ak ako kritérium autolytickej dezintegráciebuniek používáme množstvo uvolněných pro-teínov, tak potom sa týmto spósobom, t. j.prídavkom etanolu, chloridu sodného a ak-tívneho autolyzátu k suspenzii za niekolkohodin z buňky uvolní 50—80 % z celkovýchproteínov, stanovených Lowryho metodou.

Vhodný poměr přidávaného aktívneho au- tolyzátu k biomase zabezpečuje, že sa k mikrobiálnej suspenzii přidá dostatočné 5 239289 množstvo lytických enzýmov a přitom čo ných spOsoboch iniciácie autolýzy udává ta-najmenej ulitizovatefných živin. bulka 1.

Množstvo uvolněných proteínov pri růz-

Tabulka 1

Množstvo proteínov uvolněných do super-natantu (v %) z pdvodného obsahu proteí-nov v intaktnom droždí, pri roznych dobácha spósoboch iniciácie autolýzy. Etanol, res-pektive chlorid sodný přidávaný vo· výsled-

Čas 50 °C 50 °C (hj NaCl 1 0,7 0,9 5 4,6 5,6 10 9,0 12,1 24 36,3 46,3 Příklad 1 te 3 1 kvasničnej suspenzie o sušině 10 %a obsahu proteínov 32,8 mg/ml sa přidá600 ml štandardného autolyzátu, 30 g chlo-ridu sodného, 150 g etanolu a zmes sa inku-buje za miešania pri 50 °C. Po 5 hodináchsa suspenzia scentrifuguje, pričom sa získá730 g sedimentu, využitelného na izoláciunapříklad ergosterolu a 2 812 ml supernatan-tu o sušině 4,1 % a obsahu proteínov 15,5 mg/ml využitelného na izoláciu pro-teínov. Příklad 2

Postup rovnaký ako v příklade 1, lýza savšak nepřeruší po 5. hodině, ale po 24. ho-dině. Po centrifugách sa z rovnakého množ-stva suspenzie získá 639 g sedimentu a3 044 ml supernatantu o sušině 6 % a obsa-hu proteínov 25 mg/ml. Příklad 3

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 1 000 ml aktívneho autolyzátu a 60 gchloridu sodného. Získaný supernatant másušinu 9,1 % a obsah proteínov 48,5 mg/ml.Příklad 4

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 3 g chloridu sodného a 30 g etyl-alkoholu. Získaný supernatant má sušinu 7,4 % a obsah proteínov 43,0 mg/ml. Příklad 5

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 150 g chloridu sodného a 300 g etylalkoholu. Získaný supernatant má sušinu 11 % a obsah proteínov 44 mg/ml. nej koncentrácii 5 % hmot., autolyzát vmnožstve zodpovedajúcom 1/6 objemu, vstup- nej suroviny10 %}. (kvasničné mlieko o sušině 50 °C 50 °C 50 °C etylalkohol autolyzát etylalkohol NaCl autolyzát 1,9 17,5 18,2 7,1 26,6 37,2 16,0 45,3 68,5 50,9 Příklad 6 64,7 78,8

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása 500 ml aktívneho autolyzátu, 60 g chlo-ridu sodného a 30 g etylalkoholu. Získanýsupernatant má sušinu 8,2 % a obsah pro-teínov 44 mg/ml. Příklad 7

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 150 g chloridu sodného a 500 ml ak-tívneho autolyzátu, získaný supernatant másušinu 11,2 % a obsah proteínov 41,5 mg/ml.Příklad 8

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 500 ml aktívneho autolyzátu, 3 gchloridu sodného a 300 g etylalkoholu. Zís-kaný supernatant má sušinu 6,9 % a obsahproteínov 46,2 mg/ml. Příklad ‘9

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 100 ml aktívneho autolyzátu, 150 gchloridu sodného^ a 30 g etylalkoholu, Zís-kaný supernatant má sušinu 10,7 % a obsahproteínov 46,2 mg/ml. Příklad 10

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidása však 100 ml aktívneho autolyzátu, 3 gchloridu sodného. Získaný supernatant másušinu 6,2 % a obsah proteínov 36,2 mg/ml.Příklad 11

Postup rovnaký ako v příklade 2, přidá sa však 100 ml aktívneho autolyzátu, 60 g chloridu sodného a 300 g etylalkoholu. Zís- kaný supernatant má sušinu 7,0 % a obsah proteínov 40,5 mg/ml.

Claims (2)

1. 259289 PREDMET

   1. Spůsob uvolňovania cytoplazmatickéhoobsahu kvasiniek indukovanou autolýzou vy-značujúci sa tým, že na vstupnú surovinuo sušině 5 až 30 % hmot. sa působí aktív-nym autolyzátom v objemovom pomere 1 ku3 až 1 : 12, zmes sa lyžuje za miešania priteplote 45 až 55 °C počas 5 až 30 hodin. VYNALEZU
2. 2. Spůsob uvolňovania cytoplazmatickéhoobsahu kvasiniek podlá bodu 1 vyznačujúcisa tým, že na vstupnú surovinu sa súčasnes autolyzátom působí etanolom v hmotnost-nom pomere 1 : 99 až 1 : 9 a/alebo chlori-dom sodným v hmotnostnom pomere 1 : 999až 1 : 9. Severografia, n. p. závod 7, Most Cena 2,40 Kčs