CS250284B1 - Analoga MDP - Google Patents

Abstract

Vynález ss týká nových analogů MDP. Tyto látky se vyznačují silným imunoadjuvantním účinkem a nízkou pyrogenitou. MDP (N-acetylnmramoyl-L-alanyl-D-isoglutamin) je nejjednodušší strukturní jednotkou bakteriálních buněčných stěn, která má zachovanou ímunoadjuvantní aktivitu. Tato aktivita spolu s dalšími biologický­ mi účinky MDP byla v posledních dvou. desetiletích podnětem k intenzivnímu výzkumu analogů MDP s cílem nalézt látky s vyš­ ší ímunoadjuvantní aktivitou a nízkou pyrogenitou. Většina z několika set publikovaných analogů MDP obsahuje pouze jeden sacharidický zbytek D-glukkosaminu.

Description

Vynález ss týká nových analogů MDP. Tyto látky se vyznačují silným imunoadjuvantním účinkem a nízkou pyrogenitou.

MDP (N-acetylnmramoyl-L-alanyl-D-isoglutamin) je nej jednodušší strukturní jednotkou bakteriálních buněčných stěn, která má zachovanou ímunoadjuvantní aktivitu. Tato aktivita spolu s dalšími biologickými účinky MDP byla v posledních dvou. desetiletích podnětem k intenzivnímu výzkumu analogů MDP s cílem nalézt látky s vyšší ímunoadjuvantní aktivitou a nízkou pyrogenitou. Většina z několika set publikovaných analogů MDP obsahuje pouze jeden sacharidický zbytek D-glukkosaminu.

[A. Adam, E. Lederer: Med. Res. Rev. 4, 111, (1984)J. Disacharidická analoga byla připravena dosud jen v malém počtu, třebaže některá z nich mají velmi silný imu2 noadjuvantní účinek [V. T. Ivanov: Voprosy Med. Khim. 1984, 23 j. Omezujícím faktorem je obtížná dostupnost výchozí kyseliny O- (2-acetamido-2-deoxy-_jS-D-glukopyranosyl )-(1 -» 4 j-N-acetylmuramové, která byla získána enzymatickým štěpením bakteriálních peptidoglykanů [L. I. Rostovtseva, A. M. Andronova, V. P. MaTkova, I. B. Sorokina, V. T. Ivanov: Bioorg. Khim. 7, 1843 (1981)], nebo několikastupňovou syntézou [P. L. Durette, E. Meitzner, Τ. Y. Shen: Carbohydr. Res. 77, C 1 (1979)]. Kritickým stupněm syntetické cesty je glykosylace D-glukosaminu, probíhající v důsledku nízké reaktivity 4-OH skupiny D-glukosaminu s neuspokojivým výtěžkem.

Podstatou vynálezu jsou analoga obecného vzorce I

CH,OH £~

-O ,0 \ 'ψΗοβ / AcNH

CH^CO-NHCH (C_?H_S) CONHCH (CONH_?JCH£H£.OOR kde

R == vodík nebo benzyl.

Tyto látky se podle příkladu 3 vyznačují silným imunoadjuvantním účinkem, který je vyšší než u MDP a jejich pyrogenita je ve srovnání s pyrogenitou MDP velmi nízká.

Syntéza analogů I (R = vodík nebo· benzyl) je ve srovnání s popsanými syntézami disacharidických analogů MDP podstatně jednodušší, vychází totiž z kyseliny N-acetyl-nor-muramové, která je synteticky snáze dostupná než kyselina N-acetylmuramová. (Vzorce II — VII viz obr. 1 a obr. 2.)

Analog I (R = vodík) byl připraven 9stupňovou syntézou zahrnující tyto reakční stupně:

1. Látka II (R¹ = benzyl. R² = allyl) byla reakcí s 3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-Italimido-/S-D-glukopyranosylbromidem v dichlormetanu za použití trlfluormetansulfonátu stříbrného- jako promotoru reakce převedena na disacharid III (R¹ = benzyl, R² = = allyl).

2. Zahříváním látky III (R¹ = benzyl, R² rovná se allyl] s metanolickým roztokem 1-aminobutanu byl připraven arnin-oderivát IV (R¹ — benzyl, R² = allyl j.

3. Acetylací látky IV (R¹ = benzyl, R² = = allyl) anhydridem kyseliny octové v pyridinu byl získán peracetylderivát V (R = = acetyl).

4. Selektivní de-O-acetylace látky V (R = — acetyl] působením methoxidu sodného v methanolu vedla k trihydroxyderivátu V (R = vodík).

5. Benzylace látky V (R = vodík) byla provedena benzylbromidem v N,N-dimethylformamidu za použití hydroxidu barnatého jako báze. Za použití kombinace mechanického· míchání s účinkem ultrazvuku byl žádaný tri-O-benzylderivát V (R = benzyl] získán ve vysokém výtěžku.

6. Allylová skupina látky V (R = benzyl) byla selektivně odstraněna působením rhodiového katalyzátoru a následující kyselou hydrolýzou 1-propenylové skupiny za vzniku látky VI (R¹ — benzyl, R² = vodík).

7. Reakcí látky VI (R¹ = benzyl, R² = vodík] s chloroctanem sodným v 1,4-dioxanu za použití hydridu sodného jako báze byl získán disacharid nor-muramové kyseliny VI (R¹ — benzyl, R² = karboxymethyl j.

8. Kopulace kyseliny VI (R¹ = benzyl, R² se rovná karboxymethyl) s benzylesterem L-aminobutyryl-D-isoglutaminu v 1,4-dioxanu za použití N,N‘-dicykl-ohexylkabodiimidu poskytla disacharid-dipeptid VI (R¹ = benzyl, R² = CH2CO-L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzyl-ester j.

9. Hydrogenolýzou předchozího disacharid-dipeptidu v kyselině octové na paládiovém katalyzátoru byl připraven analog I (R = vodík).

Analog I (R — benzyl) byl připraven 4stupňovou syntézou zahrnující tyto reakční stupně:

1. Látka II [R¹ = benzoyl, R² = (methoxykarbonyl)methyl] byla převedena disacharid III [R¹ = benzoyl, R² = (methoxykarbo-nylj methyl] reakcí s 3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-jř?-D-glukopyranosylbromidem v dichlormethanu za použití trifluormethansulfonátu stříbrného jako promotoru glykosylace.

2. Postupným odstraněním chránících skupin působením methoxidu sodného, vodného roztoku hydroxidu sodného a 1-aminobutanu v methanolu poskytla látka III [R¹ = = benzoyl, R² = (methoxykarbonyl)methyl] látku IV (R¹ = vodík, R² = karboxymethyl).

3. Acetylací látky IV (R¹ = vodík, R² — = karboxymethyl) anhydridem kyseliny -octové ve vodě byla získána látka VII (R¹ = = vodík, R² — hydroxy), která byla charakterizována jako tetra-O-acetylderivát VII (R¹ = acetyl, R² — methoxy).

4. Kopulací látky VII (R¹ == vodík, R² — = hydroxy) s benzylesterem L-aminobutyryl-D-isoglutamlnu v N,N-dimethylformamidu za použití N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidu byl připraven analog I (R = benzyl).

Podstata vynálezu je d-oložena následujícími příklady provedení. Teploty tání byly stanoveny na Koflerově bloku a nebyly korigovány. Optická aktivita látek byla měřena polarimetrem Perkin-Elmer 141. NMR spektra byla měřena přístrojem Varian 200

XL v chloroformu za použití tetramethylsilanu jako vnitřního standardu.

Elementární analýzy byly provedeny v Ústavu organické chemie a biochemie, ČSAV Praha, čistota vzorků byla kontrolována pomocí HPLC na koloně plněné silikagelem C18 na přístroji Spectraphysics. Aminokyselinové analýzy byly provedení na přístroji Durrum.

Příklad 1

Benzyl 2-acetamido-4-O- (3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-/J-glukopyranosyl)-3-O-allyl-6-O-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (III; R¹ = benzyl, R² = allyl].

Směs 2,0 g (4,35 mmol} benzyl 2-acetamido-3-0-allvl-6-0-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosidu (II; R¹ = benzyl, R² = allyl) a 2,7 g (10,6 mmol) trifluormethansultonatu stříbrného byla sušena za intenzivního míchání v aparatuře, opatřené sépiovým uzávěrem 4 h při teplotě místnosti a při 1,3 Pa. Aparatura byla propláchnuta argonem a k míchané směsi ze přetlaku argonu byl přidán septovým uzávěrem dichlormethan (15 mililitrů). Reakční nádoba byla vložena do lázně ochlazené na —45 °C a při této teplotě byl septovým uzávěrem pomocí lineárního dávkovače přidáván roztok 4,5 g (9,03 milimol) 3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-jl-D-glukopyranjsylbromidu v dichlormethanu (15 ml) během 2 hodin. Směs byla míchána dalších 50 minut při —45 °C a 30 minut při —20 °C. Ke směsi byl při —20 °C přidán septovým uzávěrem pyridin (2 ml; 24,8 mmol), reakční nádoba byla vyjmuta z chladicí lázně a po 10 minutách mícháni za teploty místnosti byla zředěna chlorformem (250 ml) a vyloučený bromid stříbrný byl odfiltrován. Filtrát byl extrahován 0,5M-HC1 (3 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 50 ml), vysušen (Na2SOt a za vakua odpařen. Chromatografií na sloupci silikagelu (500 g. zrnění 0,03 — 0,06 mm) v soustavě octan ethylnatý toluen (2 : 1) bylo získáno 3,6 g látky III (R¹ — benzyl, R² = allyl). Výtěžek vztažený na výchozí látku II (R¹ = benzyl, R² — = iallyl) je 92%. Produkt byl získán jako tuhá pěna, čistota produktu byla kontrolována HPLC v soustavě methanol-voda.

[«]d²⁵ +49,0 ° (c 0,21; chloroform). β-Kontigurace disacharidické vazby byla prokázána 2D homokorelo váným ^XH NMR spektrem. Pro C45H50N2O15 (858,9 j:

vypočteno:

62,93 % C, 5,87 % H, 3,26 % N;

T*io'lci'7ci'rifv

62,72 % C, 5,96 % H, 3,09 % N.

Benzyl 2-acetamido-3-O-allyl-4-O (2-amino-2-deoxy-^-D-glukopyranosyl)-6-O-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (IV; R¹ = benzyl, R^z = allyl).

Roztok 3,6 g (4,2 mmol) látky III (R¹ = = benzyl, R² = allyl) ve směsi 70 ml 1-aminobutanu a methanolu (1:4] byl zahříván v zatavené ampuli 12 hodin na 85 °C. Po ochlazení byla směs odpařena a tuhý odparek byl extrahován etherem (3 x 100 ml). Tuhý zbytek byl rozpuštěn v methanolu, 0kyselen kyselinou mravenčí na pH 4 a nanesen na sloupec ionexu Dowex 50 (H⁺) (150 ml). Po promytí sloupce 500 ml 90% methanolu byl produkt eluován 500 ml směsi 25% vodného amoniaku a methanolu (1: :7j. Odpařením eluátu bylo získáno 1,97 g (77,8%) tuhého odparku, který byl chromatograficky jednotný v soustavě 2-propanol — 25% amoniak (20 : 1) na Silufolu. Analytický vzorek byl získán srážením methanolickěho rotzoku diethyletherem. fa]_D ²⁵ +82,1° (c 0,20; chloroform).

Pro C31H42N2O10 (602,7):

vypočteno:

61,78 % C, 7,02 % H, 4,65 % N;

nalezeno:

61,74 % C, 6,97 % H, 4,58 % N.

Krystalizaci surového produktu ze směsi diethylether-methanol-voda byl získán hemihydrát látky IV (R¹ = benzyl, R² = allyl) tající při 200 °C.

Pro C31H42N2O10.0,5 H2O (611,7):

vypočteno:

60,87 % C, 7,09 % H, 4,58 % N; nalezeno:

60,70 % C, 6,87 % H, 4,59 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O- (2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-^-D-glukopyranosyl) -3-O-allyl-6-O-benzyl-2-deoxy-«-D-glukopyranosid (V; R — Ac).

Roztok 1,95 g (3,15 mmol) látky IV (R^x = — benzyl, R² = allyl) v 30 ml směsi pyridin- acetanhydrid (2:1) byl nechán stát při teplotě místnosti 12 hodin, ke směsi byl přidán ethanol (20 ml) a po 20 minutách byla směs za vakua odpařena a kodestilována s toluenem (3 x 30 ml). Krystalizaci odparku z ethanolu bylo získáno 2,04 g látky IV (R = Ac) ve výtěžku 82%. T. t. 247°C (ethanol) [^D]_D ²⁵ +40,57 ° (c 0,2; chloroform).

Pro C39H50N2O14 (770,8):

vypočteno:

60,77 % C, 6,54 % H, 3,63 % N;

nalezeno:

60,66 % C, 6,46 % H, 3,68 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-0 (2-acetamido-2-deoxy-jíí-D-glukopyranosyl) -3-O-allyl-6-O-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (V; R = H).

K Ο,ΟΙΜ-methoxidu sodného v methanolu (100 ml) bylo za míchání přidáno 1,96 g látky v (R = acetyl) a po rozpuštění byl roztok nechán stát 12 hodin při +3 °C. Směs byla neutralizována ionexem Dowex'50 (H⁺ ), ionex byl odfiltrován, promyt methanolem a za vakua odpařen. Po odpaření eluátu bylo získáno 1,51 g (92 %) tuhého odparku, který na HPLC v soustavě methanol-voda (7:3) je jednotný. [a]_n ²⁵ +73,1 ° (c 0,2; chloroform).

Pro C33H44N2O11 (644,7):

vypočteno:

61,48 % C, 6,88 % H, 4,35 % N; nalezeno:

61,01 % C, 6,96 % H, 4,39 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O- (2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-j3-D-glukopyranosyl)-3-O-allyl-6-O-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (V; R = benzyl).

K práškovitému hydroxidu barnatému, který byl připraven ekvilibraci 6,13 g (40 milimol) oxidu barnatého s 1,60 g (5 mmol) oktahydrátu hydroxidu barnatého, byl sépiovým uzávěrem za přetlaku argonu postupně přidán roztok 1,17 g (1,82 mmol) látky V (R = H) v Ν,Ν-dimethylformamidu a 2,16 gramu (12,6 mmol) benzylbromidu a směs byla za teploty místnosti sonikována v ultrazvukové pračce (Branson Ultrasonic Cleaner, Model B-12E, 50 W) 20 h. Potom byla směs zředěna 200 ml chloroformu, extrahována 10% kyselinou octovou (2 x 30 ml) a vodou (30 ml), vysušena (Na2SO4) a za vakua odpařena. Chromatografii na sloupci silikagelu (200 g; zrnění 0,030 až 0,060 mm) v soustavě chloroform — octan ethylnatý (2:1) bylo získáno 1,18 g (70,9 %) tuhého odparku látky V (R — benzyl). [a]_D ²⁵ +53,3° (c 0,20; chloroform).

Pro C54H62N2O11 (915,1):

vypočteno:

70,87 % C, 6,83 % H, 3,06 % N; nalezeno:

70,35 % C, 6,79 % H, 2,93 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O- (2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-₁íí-D-glukopyranosyl)-6-O-benzyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (VI; R¹ = benzyl, R² = vodík).

K roztoku látky V (R = benzyl) 1,2 g (1,32 mmol) v 20 ml směsi ethanol — toluen — voda (7:3:2) bylo přidáno 0,140 g (0,15 mmol) tris(trifenylfosfln)rhodium(I) chloridu a směs byla zahřívána 1 hodinu pod zpětným chladičem. Potom byl ke směsi přidán 1 ml kyseliny mravenčí a směs byla zahřívána k varu ještě 30 minut za vakua odpařena. Chromatografii na silikagelu (150 g, zrnění 0,030 až 0,060 mmj v soustavě chloroform — methanol (50:1) bylo získáno 1,05 g (91 %) látky VI; (R¹ = benzyl, R² = H) ve formě sirupu.

Pro C51H58N2O11 (87,5,03):

vypočteno:

71,03 % C, 6,68 % H, 3,20 % N; nalezeno:

70,23 % C, 6,48 % H, 2,93 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-0- (2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-_ld-D-glukopyranosyl) -6-O-benzyl-2-deoxy-3-O- (karboxymethyl)-a-D-glukopyranosid (VI; R¹ = benzyl, R² = karboxymethyl).

K roztoku 0,70 g (0,8 mmol) látky VI (R¹ = benzyl, R² = vodík) v 7 ml 1,4-dioxianu bylo přidáno 96 mg (4 mmol) hydridu sodného a směs byla zahřívána za míchání 2 hodiny na 96 °C. Po ochlazení na 65 °C byla ke směsi přidána kyselina chloroctová (0,1 g; 1,06 mmol) a při této teplotě byla směs míchána 3,5 hodiny. Po ^hodinovém stání při teplotě místnosti byla směs opatrně vlita do 20 ml vody pod CO2. Směs byla za vakua odpařena, ke zbytku byla přidána 5% kyselina octová (60 ml) a produkt byl extrahován chloroformem (3 x 80 ml), extrakt byl vysušen (Na2SO4), odpařen a chromatografován na koloně silikagelu C18 v soustavě methanol s 1 % kyseliny mravenčí. Výtěžek sirupovitého produktu 0,56 g (74 %).

Pro C53H60N2O13 (933,0):

vypočteno:

68,22 % C, 6,48 % I-I, 3,00 % N; nalezeno:

68,03 % C, 6,51 % H, 2,68 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O-(2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-^-D-glukopyranosyl )-6-O-benzyl-2-deoxy-3-O-(methoxykarbonyl)-methyl-a-D-glukopyranosid [VI; R¹ = = benzyl, R² = (methoxykarbonyl)methyl).

K roztoku látky VI (R¹ — benzyl, R² = = karboxymethyl) (0,15 g) ve směsi 10 ml chloroform — methanol (1:1) byl při 0°C přidáván 0,4M etherický roztok diazomethanu do trvalého žlutého zabarvení. Po chromatografickém vyčištění (HPLC, C18 v soustavě methanol — voda) a krystalizací z methanolu bylo získáno 95 mg (63 %) krystalického produktu o t. t. 223 °C. [a]_D ²⁵ +67,3° (c 0,21; chloroform).

Pro C54H62N2O13 (947,1): vypočteno:

68,48 % C, 6,60 % H, 2,96 % N; nalezeno:

68,47 % C, 6,54 % H, 2,95 % N.

NJ2-0-[ Benzyl 2-acetamido-4-O- (2-acetamido-3,4,6-tri-O-benzyl-2-deoxy-3-D-glukopyranosyl)-6-O-benzyl-2,3-dideoxy-D-glukopyranosid-3-yl ] glykioloyl)-L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzyl ester VII (R¹ = benzyl, R² = L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzyl ester).

K roztoku 0,33 g (0,36 mmol) látky VI (R¹ = benzyl, R² = karboxymethyl) v dlchlormethanu (3 ml) byl přidán 1-hydroxybenztriazol (54 mg; 0,4 mmol) a roztok trifluoroctanu benzylesteru L-aminobutyryl-D-isoglutaminu (0,5 mmol) v 1,4-dioxanu. (Trifluonoctan benzylesteru L-aminobutyryl-D-isoglutaminu byl připraven působením 1,4M roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu (10 ml) na benzylester terc.butyloxykarbonyl-L-aminobutyryl-D-isoglutaminu (0,21 g; 0)5 mmol) 45 minut při teplotě místnosti. Po odpaření byla směs rozmíchána se suchým etherem (2 x 30 ml) a v etheru nerozpustný sirupovitý podíl byl sušen 1 hodinu při 132 Pa). Po ochlazení reakční směsi ledem byl přidán 1M roztok triethylaminu v 1,4-dioxanu (0,7 ml) a 1M roztok N,N‘-dicyklohexylkarbodlimidu (0,36 ml). Směs byla ponechána stát 2 hodiny při 0 °C a 10 hodin při teplotě místnosti, zfiltrována od vyloučené N,N‘-dicyklohexylmočoviny, odpařena a chromatografována na sloupci silikagelu (100 g) v soustavě chloroform — methanol (25:1). Výtěžek 0,405 g (91 °/o) sirupu.

Pro C69H81N5O1G (1 236,4):

vypočteno:

67,02 % C, 6,60 % H, 5,56 % N; nalezeno:

66,67 % C, 6,57 % H, 5,62 % N.

O- (2-Acetamido,-2-deoxy-,d-D-glukopyranosyl)-(l - 4)-N-acetyl-normuramyl-L-aminobutyryl-D-isoglutamin (I; R = vodík).

K roztoku 0,308 g (0,25 mmol) látky VII (R¹ = benzyl, R² = L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzyl ester) v 20 ml kyseliny octové byl přidán 5% předhydrogenovaný paládiový katalyzátor a směs byla hydrogeňována 8 hodin za teploty místnosti. Katalyzátor byl odpařen, promyt methanolem (100 mililitrů) a filtrát byl za vakua odpařen. Chromatografii na ionexu Dowex 1 (formiát) (40 ml) za použití gradientu voda — 0,2M-kyselina mravenčí bylo získáno 0,064 g (36 procent) monohydrátu látky I Aminokyselinová analýza:

kyselina L-aminomáselná 1,03, kyselina D-glutamová 1,00,

D-glukosamin 1,02, kyselina normuramová 1,03.

Pro C27H45N5O16 . H2O (713,7): vypočteno:

45,44 % C, 6,64 % H, 9,81 % N; nalezeno:

45,12 % C, 6,27 % H, 9,54 % N.

Příklad 2

Benzyl 2-acetamido-4-O- (3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-/4-D-glukopyranosyl)-6-O-benzoyl-2-deoxy-3-O( methoxykarbonyl )methyl-a-D-glukopyranosid [III; R¹ = benzoyl, R² = (methoxykarbonyl)methyl).

Působením 3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-jd-D-glukopyranosylbromidu (15,35 gramu; 30 mmol) a trifluormethansulfonanu stříbrného (8,27 g; 32,3 mmol) na látku II [R¹ = benzoyl, R² = (methoxykarbonyl)methyl] (7,84 g; 16,1 mmol) v dichlormethanu (40 ml) za podmínek uvedených v příkladu 1. bylo po chromatograíickém zpracování (600 g silikagelu; 0,06 až 0,12 mm) v soustavě octan ethylnatý — toluen (2:1) a krystalizaci z ethanolu získáno 9,06 g (62 procent) produktu. T. t. 157 až 158°C (ethanol). [«]_D ²⁵ +53,8 ° (c 0,21; chloroform). ^-Konfigurace disacharidické vazby byla prokázána 2D homokorelovaným ^XH NMR spektrem.

Pro C45H48N2O18 (904,85):

vypočteno:

59,72 % C, 5,34 % H, 3,09 % N;

τλ Ca 1 P7DΥΎ íN*

59,81 % C, 5,27 % H, 3,08 % N.

Benzylamido-4-O- (2-amino-2-deoxy-,₍S-D-glukopyranosyl)-3-0-karhoxymethyl-2-deoxy-a-D-glukopyranosid (VI; R¹ — vodík, R² = karboxymethyl).

K 0,01M roztoku methoxidu sodného v methanolu (100 ml) bylo za míchání při teplotě místnosti přidáno 3,62 g (4,0 mmol) látky III [R¹ = benzoyl, R² = (methoxykarbonyl jmethyl] a směs byla ponechána stát při +5 °C 12 hodin. Směs byla neutralizována kyselinou octovou, methanol byl za vakua oddestllován a dvakrát kodestilován s 50 ml vody. Zbytek byl rozpuštěn v 75 ml 0,'5M-NaOH a směs byla zahřívána na 60 °C 3,5 hodiny. Bo ochlazení byla směs neutralizována přidáváním ionexu Dowex 50 (H⁺) a suspenze byla nalita na sloupec (3 x 25 centimetrů) ionexu Dowex 50 (H⁺). Sloupec byl eluován 600 ml vody, eluát byl odpařen a odparek byl sušen za vakua (6,5 Pa) 2 hodiny při 25 °C. Amorfní odparek byl rozpuštěn v methanolu, přidán 1-aminobutan (15 ml) a směs byla zahřívána v zatavené trubici 15 hodin na 80 °C. Methanol a 1-aminobutan byly oddestilovány a zbytek byl kodestilován dvakrát s vodou (100 ml) a odparek byl rozpuštěn v 50 ml vody a extrahován octanem ethylnatým (dvakrát po 50 ml). Vodná fáze byla nastavena kyselinou mravenčí na pH 5 a nanesena na sloupec ionexu Dowx 50(NH4⁺) (3 x 25 cm).

Kolona byla promyta 600 ml vody a produkt byl desorbován 700 ml 5% vodného amoniaku. Po odpaření amoniakální frakce byl tuhý odparek kodestilován třikrát s 50 mililitry vody do vymizení alkalické reakce. Zbytek byl rozpuštěn v 30 ml vody a nechán krystalovat 5 dní při +5 °C. Po rozmíchání s 50 ml methanolu byl krystalický produkt promyt methanolem a sušen v exsikátoru nad hydroxidem draselným. Výtěžek 1,28 g (58 %). Odpařením matečných louhů a následující krystalizací z vodného methanolu bylo získáno dalších 0,63 g produktu. Celkový výtěžek byl 87 %. Vzorek pro analýzu byl krystalován z borké vody. T. t. 180 °C (za rozkladu). (a)_D ²⁵ +94,2° (c 0,21; voda). Pro C23H34N2O12 . H2O (548,5):

vypočteno:

50,35 % C, 6,61 % H, 5,11 % N; nalezeno:

50,16 % C, 5,27 % H, 5,04 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O- (2-acetamido-2-deoxy-,d-D-glukopyranosyl) -2-deoxy-3-0-karboxymethyl-re-D-glukopyranosid (VII;

R¹ ~ vodík, R² = hydroxy).

K míchané suspenzi 1,08 g kyseliny IV (R¹ — vodík, R² — karboxymethyl) v 15 ml vody byl přikapáván acetanhydrid (2 ml) za teploty místnosti 10 min, po 30 min byl přidán další podíl acetanhydridu (2 ml) a po 2 hodinách byla směs odpařena a nanesena na sloupec ionexu Dowex 50 (H⁺) (2 x x 10 cm). Produkt byl eluován 200 ml vody, eluát byl odpařen rozmíchán s methanolem (20 ml) a po 6 hodnách stání při 5 °C byl produkt odsát a sušen nad hydroxidem draselným. Produkt k analýze byl krystalován z 90% ethanolu. T. t. 183 °C. [a)_D ²⁵ +71,0 ⁰ (c 0,19; voda).

Pro C25H36N2O13. H2O (590,6):

vypočteno:

50,84 % C, 6,49 % H, 4,74 % N; nalezeno·:

50,66 % C, 6,07 % H, 4,33 % N.

Benzyl 2-acetamido-4-O- (3,4,6-tri-O-acetyl-2-acetamido-2-deoxy-/2-D-glukopyranosyl) -2-deoxy-3-O- (methoxykarbonyl) methy 1-α-D-glukopyranosid (VII; R¹ = acetyl, R² = = methoxy).

K roztoku 89 mg látky VII (R¹ = vodík, R² = hydroxy) v 10 ml methanolu byl při 0 °C přidáván 0,4M etherový roztok diazomethanu do trvalého žlutého zabarvení. Po 30 minutách stání při 0 °C byl přebytek diazomethanu rozložen kyselinou octovou, směs byla odpařena a rozpuštěna ve směsi 5 ml pyridinu a acetanhydridu (2:1). Po 12 hodinách stání při teplotě místnosti byl ke směsi přidán methanol (5 ml), směs byla odpařena a kodestilována se směsí ethanolu a toluenu a tuhý zbytek byl rekrystalován ze směsi methanol — voda (1 : 1). Výtěžek 55,3 mg (49 %). T. t. 272 °C (methanol — voda). [a]_u ²⁵ +62,1 ° (c 0,8; chloroform).

Pro C34II4CN2O17 (754,7):

vypočteno:

54,10 % C, 6,14 % H, 3,71 % N; nalezeno:

54,18 % C, 6,12 % H, 3,51 % N.

N-!2-O- [ Benzyl 2-acetamido-4-0- (2-acetamido-2-deoxy-/Ž-D-glukopyranosyl)-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl ] glykoloylj-L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzyl-ester. (I; R = benzyl).

Do baňky opatřené septovým uzávěrem a magnetickým míchadlem bylo vloženo 0,760 gramu (1,25 mmol) látky VII (R¹ = vodík, R² = hydroxy), 1-hydroxybenztriazol (0,165 gramu; 1,185 mmol) a tosylát benzylesteru L-aminobutyryl-D-isoglutamlnu (0,617 g; 1,25 mmol) a směs byla sušena při teplotě místnosti při 6,5 Pa 2 h. Aparatura byla vypláchnuta dvakrát dusíkem a šeptem byly přidány 3,6 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Po rozpuštění byl roztok ochlazen na —30 °C a při této teplotě byl přidán triethylamin (0,120 g; 1,20 mmol) v 0,5 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a potom za stálého chlazení na —30 °C byl přidán roztok N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidu (0,730 g; 3,54 mmol) během 10 minut. Teplota reakční směsi byla nechána vystoupit během 2 hodin na 25 3C a ponechána stát při této teplotě 2 dny. Nezreagovaný N,N‘-dicyklohexylkarbodiimid byl rozložen 20 ml 10% kyseliny octové a po 1 hodině stání byla vyloučená N,N‘-dicyklohexylmočovina odfiltrována, promyta 10 ml 10% kyseliny octové a filtrát byl za vakua odpařen, zbytek byl dvakrát kodestilován s 50 ml vody a vysušen destilací s 50 ml ethanolu. Ke zbytku byl přidán aceton (50 ml) a po 2hodinovém stání při +5 °C byla vyloučená tuhá látka odsáta a sušena nad hyd250284 roxidem draselným ve vakuu. Surový produkt byl chromatografován na sloupci silikagelu C18 v 60% methanolu. Výtěžek 0,372 gramu (33 %) amorfního prášku. [aj_D ²⁵ +50,1° (c 0,4; 50% methanol).

Pro C.41H57N5O16. H2O (893,9):

vypočteno:

5)5,08 % C, 6,42 % H, 7,83 % N;

πλΙοτρηπ*

55,39 0/0 C, 6,53 % H, 7,78 % N.

Hydrogenolýzou benzylových skupin 0,255 gramu látky I (R - - benzyl) za podmínek uvedených u hydrogenolýzy látky VII (R¹ — — benzyl, R² — L-aminobutyryl-D-isoglutamin benzylester) bylo získáno 0,142 g (69,7 procenta) lyofilyzátu látky, která byla chromatograficky (HPLC v 10% methanolu) i elektroforeticky identická s látkou I (R

Látka

Dávka = vodík), jejíž příprava byla popsána v příkladu 1.

Příklad 3

Biologická aktivita látek I (R = vodík, benzyl)

Biologická aktivita látek I (R = vodík, benzyl) byla stanovena standardními testy pro imunoadjuvantní účinek a pyrogenitu za podmínek uvedených v tabulkách I a II

Tabulka I

Imunoadjuvantní účinek MDP a látek I (R = = vodík, benzyl) byl měřen 14 dní po sensibilizaci kožními testy na morčatech indikovaných ovalbuminem jako antigenem intradermátně. Látky byly injikovány spolu s nekompletním Freundovýra adjuvantem (FIA). Průměr velikosti indurace je uveden v milimetrech.

Průměr indurace (mm) ₍ug Dávka 250 μ%

FIA —	0,3
FIA + MDP	0,4
FIA + I (R = benzyl)	0,5
FIA + I (R — vodík)	0,9

0,9

1,3

2,6

3,8

Tabulka II

Pyrogenita MDP a látek I (R = vodík, benzyl) byla stanovena testem na králících předepsaným ve farmakologii léčiv. Hodnoty ΔΤ odpovídají maximálnímu vzrůstu teploty po aplikaci látky.

Látka ΔΤ (°C)

MDP 1,7

I (R = vodík) 0,5

I (R = benzyl) 0,0

Možnosti využití vynálezu

Analoga I (R = vodík nebo benzyl), která jsou předmětem vynálezu, mohou nalézt použití jako imunoadjuvantní složky syntetických vakcín a jako imunoadjuvantní léčiva při poruchách imunitního aparátu, a to jak v humánní, tak i veterinární medicíně.

Claims (2)

1. VYNÁLEZU

   Analoga MDP obecného vzorce I CH^OI /—o fi / AiNH kde

   CH^O-NHCHÍC^) (L-J

   CONHCH í CO NH^ CH£H£QOR

   ID~>

   (I)

   R je vodík nebo benzyl
2. 2 listy výkresů

   Pht«= ftaloyt e>6r/t ch₂or¹ (IV)

   Obr, Z.

   (V!) (VII)