CS248499B1 - Sposob stabilizácie enzýmu galaktózaoxidáza - Google Patents

Description

248499

Vynález sa týká sposobu stabilizácie en-zymu galaktózaoxidáza (D-galaktóza: oxygen-oxidoreduktáza, EC 1.1.3.9).

Galaktózooxidáza je enzým zo skupiny me-taloproteinov s aíómom médi v prosíeiickejskupině, ktorý katalýzu je oxidáciu primár-né] hydroxylovej skupiny na uhlíku D-ga-laktózy v polohe 6 za vzniku aldehydickejfunkcie. Táto oxidácia prebieha nie len vmolekule volnej D-galaktózy, ale aj v anhyd-rogalaktozylových jednotkách s touto vol-nou hydroxylovou skupinou v o ligo- a biopo-lyméroch.

Jedným z obecne využívaných postupovstabilizácie enzýinových aktivit je prídavokreakčného substrátu k roztoku enzýmu, zvý-šenie hydrof óbnosti prostredia prídavkomorganického rozpúš.adla alebo prídavkomniektorých mono- alebo disacharidov k roz-toku enzýmu [N. Citri: Adv. Enzymol. 37,397 (1937)].

Nevýhodou stabilizácie v roztoku je u vač-šiny enzýmov a to predovšetkým zo skupinytransglykozylačných enzýmov a oxidoreduk-táz nižšia schopnost' perzistencie aktivity priteplotách nad 60 °C. Z toho dóvodu sa ukazu-je ako účelná stabilizácia enzýmov na fázo-vom rozhraní, pripravenom z modifikované-ho polymérneho substrátu [J. Zemek, S. Bau-er, E. Kuniak: Biopolymers 18, 2135 (1979)),alebo afinantov, obecného typu [J. Zemek,E. Kuniak, P. Gemeiner, J. Zámocký, Š. Ku-čár: Enzyme Microb. Technol, 4, 223 (1982)],připadne kompetitívnych inhibítorov reakcie,ktorí sa viažu na aktivně centrum enzýmu,v priebehu interakcie s enzýmom sa všaknerozkladajú. Galaktózaoxidázu sa zatial' nafázovom rozhraní stabilizoval nepodařilo.

Uvedené nevýhody odstraňuje postup po-dlá vynálezu, podstata ktorého spočívá vtom, že enzým galaktózaoxidáza v roztokufosfátového alebo tri (hydroxymetyl) mety 1-amóniumchloridového ústojného roztoku opH 6,5 až 8,0 a koncentrácii 0,01 až 0,05mol. dm-3 sa nanesie na gél připravený zalfa galaktánov ako je karagenan alebo gua-ran alebo ich zmesí sletovaných bifunkčnýmčinidlom 2-chlormetyloxyránom s výsled-ným napúčacím objemom 4 až 10 cm3. g 1a stupeň sieťovania 0,02 sž 0,1 a to tak, abyhmotnost gelu k hmotnosti roztoku enzýmuboli v pomere 0,7 až 1 a mokrý gél sa nako-niec vysuší do teploty 40 °C. Výhodou uvedeného postupu je jeho jed-noduchost1, technická nenáročnost', vysokástabilita enzýmu počas skladovania, ako ajmožnost přípravy enzýmového preparátu vtabletovacej formě, priamym suchým table-továním enzýmu zakotveného na nosiči. Příklad 1

Enzým galaktózaoxidáza z Polyporus cir-cinatus o aktivitě 2 ,ukat a špecifickej aktivi-tě 1,2 nkat. mg“1 sa rozpustí v 10 cm3 fosfá- tového ústojného roztoku o pH 6,5 a koncen-trácii 0,01 mol. dm-3 68,5 cm3 dihydrogen-fosforečnanu sodného (27,8 g.dm“3) a 31,5centimetrov krychlových hydrogenfosforeč-nanu sodného (53,65 g.dm“3), doplněné na1 dm3 dest. vodou a nanesie na 10 g gélu,připraveného z karagenanu, sletovaného 2--chlnrometyloxyránom na stupeň sieťovania0,02 a napúčacom objeme 10 cm3. g“1. Získa-ný gél sletovaného karagenanu s galaktóza-oxidázou sa vysuší pri tlaku 5 kPa a podrobítepelne expozičným testom pri teplote 70 až90 °C. Zatial', čo lyofilízovaný enzýmový pre-parát sa dezaktivoval už po 3 dňovej expo-zícii pri teplote 70 °C, enzým stabilizovaný napovrchu gelu sledovaného karagenanu za-znamenal po 3 dňoch expozície pri teplote90 °C len 18 % pokles aktivity. Příklad 2

Enzým galaktózaoxidáza z Dactylium den-droides o aktivitě 1,4 ^kat a špecifickej ak-tivitě 0,95 nkat. mg“1 sa rozpustí v 25 cm3tris (hydroxymetyl jmetylamóniumchlorido-vého ústojného roztoku o koncentrácii 0,05mol. dm“3 50 cm3 roztoku tris (hydroxyme-tyl jmetylamínu (24,2 g . dm-3 kyseliny chlo-rovodíkovej sa doplní vodou do 200 cm3 ananesie sa na 50 g gelu připraveného z gua-ranu, sieťovaného 2-chlormetyloxyránom nastupeň sieťovania 0,1 a o napúčacom objeme4 cm3.g_1. Získaný gél s enzýmom sa vy-suší volné a podrobí tepelne expozičnýmtestom pri teplote 70 až 90 °C. Zatial', čo lyo-filizovaný enzýmový preparát sa dezaktivo-val už po 3 dňovej expozícii při teplote 70 °C,enzým stabilizovaný na povrchu gélu sieťo-vaného garagenanu zaznamenal po 3 dňochexpozície pri teplote 90 °C len 18 % poklesaktivity. Příklad 3

Postupuje sa podlá příkladu 1 s tým roz-dielom, že sa roztok enzýmu nanáša na gélpřipravený zo směsi karagenanu a guaranu vhmotnostných pomeroch 1:1a sieťovaný 2--chlormetyloxyránom na stupeň sieťovania0,05 a o napúčacom objeme 7 cm3. g"1. Za-tial', čo lyofilízovaný enzýmový preparát sadezaktivoval už po 3 dňovej expozícii priteplote 70 °C, enzým stabilizovaný na povr-chu gélu zo zmesi sieťovaného karagenanua guaranu zaznamenal po 3 dňoch expozíciepri teplote 90 °C iba 18 % pokles aktivity.

Vynález mĎže nájsť široké uplatnenie pristabilizácii enzýmu galaktózaoxidáza pri vý-robě diagnostik pre účely klinickej bioché-mie, napr. pri monitorovaní galaktosémie agalaktosúrie, k štruktúrnej analýze oligo-sacharidov a biopolymérov, v potravinárskeja veterinárnej analytike a vo výskume.

Claims (1)

1. 248499 S 6 PREDMET Spósob stabilizácie enzýmu galaktózaoxi-dáza EC 1.1.9.9 vyznačený tým, že enzýmgalaktózaoxidáza v roztoku fosfátového ale-bo tris( hydroxymetyl )metylamóniumchlori-dového ústojného roztoku o pH 6,5 až 8,0a koncentrácii 0,01 až 0,05 mol. dm-3 sa na-nesie na gél připravený z alfa galaktánovako je karagenan aiebo guaran alebo ich VYNÁLEZU zmesí sletovaných bifunkčným činidlom 2--chlormetyloxyránom na stupeň sieťovania0,02 až 0,1 s výsledným napúčacím objemom4 až 10 cm3.g_1 tak, aby hmotnost gelu khmotnosti roztoku enzýmu boli v pomere 0,7až 1,0 a mokrý gél sa nakoniec vysuší doteploty 40 °C.