CS248348B1 - Způsob stanovení aktivity enzymů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu stanovení enzymů, zejména alkalické a kyselé fosfatázy, aspartátaminotransferázy, alaninaminotransferázy a laktátdehydrogenázy, který spočívá v tom, že se vzorkem s obsahem zkoumaného enzymu působí na substrát, který v* závislosti na enzymatické aktivitě uvolňuje látky s volnou thiolovou skupinou, přičemž při stanovení aktivit enzymů, které přemisťují jiné než thiolové skupiny, například aminoskupiny, vodík a další, se látky 3 volnou thiolovou skupinou uvolní návaznými reakcemi s přídavnými enzymy, jejichž průběh uvolňování se sleduje elektrochemickou reakcí. Způsob stanovení lze využít v lékařství.

Description

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity enzymů, které mají význam v lékařství, zejména alkalické fosfatázy - ALP /E.C. 3.1.3·!./ a připadne kyselé fosfatázy - ACP /E.C. 3.1.3.2./, aspartátaminotransferázy - AST /E.C. 2.6.1.1./ a alaninaminotransferázy - ALT /E.C. 2.6.1.2./, obe se dříve nazývaly transaminázami GO a GP, a dále laktátdehydrogenázy - ID /E.C. 1.1.1.27·/ i dalších.

Způsoby stanovení aktivit alkalické a kyselé fosfatázy jsou dnes založeny na štěpení substrátu - např. nitrofenylfosfátu-, jehož odštěpená část je barevná, např. nitrofenol a vývin barvy a její fotometrie je mírou aktivity enzymu. Aspartátaminotransferáza a alaninaminotransferasa se stanovovaly nedokonalými metodami s fotometrií ve viditelné oblasti světla /metoda Reitman, Frankel/, ale tato metoda pro svou nedokonalost je opuštěna a nahrazena kontinuální fotometrií v ultrafialovém světle při 340 nm nebo fluorometričky. Podstatou jsou redox změny nikotinamidadenin dinukleotidu, čímž dochází ke změnám absorbance. Tato reakce je tedy indikující reakcí a často se k ní dospěje řetězem dalších reakcí a přídavkem jiných enzymů a látek. Přirozeně vyžaduje tento postup možnost kontinuální fotometrie a její registrace v ultra fialovém světle, což je relativně nákladně.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob stanovení aktivity enzymů, zejména alkalické a kyselé fosfatázy, aspartátaminotransferázý, alaninaminotransferázy a laktátdehydrogenázy podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se vzorkem obsahujícím zkoumaný enzym působí na substrát, kteřý v závislosti na enzymatické aktivitě uvolňuje látky s volnou thiolovou skupinou, jejichž průběh uvolňování se sleduje elektrochemickou reakcí. Při stanovení aktivit enzymů, které přemísťují jiné než thiolové skupiny,

248 348 w

- 2 například aminoskupiny, vodík a další, se látky s volnou thiolovou skupinou uvolní návaznými reakcemi s přídavnými enzymy, například koenzym A se uvolní z acetylkoenzymu A přidáním citrátsynthézy při stanovení aktivity aspartátaminotransferázy, nebo přidáním pyruvátkarboxylazy a citrátsyntházy při stanovení aktivity alaninaminotransferázy, nebo laktátdehydrogenézy. Na substrát po odstranění kyslíku se působí vzorkem s obsahem zkoumaného enzymu, načež se na zapisovači sleduje průběh napěíového potenciálu mezi látkou s volnou thiolovou skupinou a kalomelovou elektrodou, z rozdílu úhlu mezi přímkou odpovídající slepému pokusu a přímkou odpovídající vzorku s enzymem se stanoví enzymatická aktivita vzorku.

Uváděný způsob vychází z možnosti elektrochemické kontinuální detekce vznikajících thioskupin bučí přímo štěpením substrátu, nebo návaznými reakcemi s přídavnými enzymy, za použití přístroje popsaného v cs. c. 134022.

Pro fosfatázy vhodným substrátem je např. S-fenylthiofosfát Aithná sůl/ nebo S-/p-methoxy-fenyl/thiofosfát /anilinová sůl/, kde enzymatickým štěpením za příslušného pH vznikají odštěpením fosfátu zbytky mající volnou thiolovou skupinu. Tím kontinuálně stoupá jejich koncentrace a na elektronickém kompenzačním zapisovači vzniká lineární zápis průběhu enzymové aktivity fosfatáz.

Způsob stanovení enzymatické aktivity podle vynálezu je blíže objasněn na příkladech.

Příklad 1

Při provádění způsobu jedle vynálezu se používají tato činidla: karbonát-bikarbonátový pufr 0,1 M, pH 10,0 pro alkalickou fosfatázu nebo natriumcitrátový s kys. chlorovodíkovou pufr 0,1 M, pH 4,9 pro kyselou fosfatázu, substrát S-/p-methoxy-fenyl/thiofosfát /anilinová sůl/ v koncentraci 2.10“-* M rozpuštěný v příslušném pufru, dále stlačený dusík v láhvi.

Do nádobky se odměří 4 ml pufru a 0,5 ml roztoku substrátu, probublá se 2 min. dusíkem a vytemperuje se směs na teplotu 50 °G; nechá se kapat rtuřová kapkové elektroda s dobou kapky kolem 3 sekund a zaznamená se na zapisovači slepá zkouška. Pak se přidá

- 3 248 348

0,2 ml vzorku s enzymem, znovu se probublá směs 20 sekund dusíkem a potom se zaznamenává lineární průběh enzymatické aktivity. Úhel přímky se slepou zkouškou je mírou aktivity fosfatázy. Kalibruje se 1 milimolárním redukovaným glutathionem.

Příklad 2

Pro měření aktivity aspartátaminotransferázy - AST se užívá běžný substrát: L-aspartát a 2-oxoglutarát ve vhodném pufru, ale dále se nově přidává citrátsyntháza /E.C. 4«1·3·7/ a acetylkoenzym A. Pak reakce probíhá takto:

Λςφ

L-aspartát + 2-oxoglutarát —>

,Ι^~·ι·ι oxalacetát citrátsynthasa acetylkoenzym A ci-13-σζ

S.CoA oxalacetát + L-glutamán /1/ citrát koenzym A

CoA.SH

Se vznikem citrátu vzniká i koenzym A, který má volnou thiolovou skupinu aopět vzniká lineární zápis průběhu enzymatické aktivity AST.

Při provádění způsobu dle vynálezu se používají tato činidla: substrát /obsahující ve 100 ml fosfátového nebo jiného pufru 0,1 M, pH 7,8 : 17 mmol L-aspartótu, 1,5 mmol 2-oxoglutarótu, 2,5 mg citrátsynthasy -cca 400 jednotek, 0,01 mmol acetylkoenzymu A/ a dusík stlačený v lahvi.

Do nádobky se odměří 4 ml substrátu, probublá se 2 min. dusíkem a vytemperuje se roztok na 30 °G; nechá se kapat rtuíová kapková elektroda s dobou kapky kolem 3 sekund a zaznamená se slepá zkouška. Pak se přidá 0,2 ml vzorku s aspartátaminotransferázou, znovu se probublá směs 20 sekund dusíkem a potom se zaznamenává lineární průběh enzymatické aktivity. Úhel přímky se slepou zkouškou je mírou aktivity aspartataminotransferázy. Kalibruje se 1 milimolárním redukovaným glutathionem.

Příklad 3

Pro měření aktivity alaninaminotransferázy - ALT se užívá běžný substrát: L-alanin a 2-oxoglutarát ve vhodném pufru, ale

248 348 dále se nově přidá pyruvátkarboxyláza /E.C. 6.4.1.1/, citrátsynthá za /E.C. 4.1.5.7/ a acetylkoenzym A. Pak reakce probíhá takto:

L-alanin + 2-oxoglutarát

ALT pyruvát — oxalacetát acetylkoenzym A pyruvátkarboxyláza

pyruvát + L-glutamán oxalacetát citrát koenzym A /1/ /2/

Opět se vznikem citrátu vzniká i koenzym A, který má volnou thiolovou skupinu a vzniká lineární zápis průběhu enzymatické aktivity alaninaminotransferázy.

Při provádění způsobu dle vynálezu se používají tato činidla: substrát /obsahující ve 100 ml fosfátového nebo jiného pufru 0,1 M, pH 7,8 : 40 mmol L-alaninu, 1,5 mmol 2-oxoglutarátu, 1,5 mg pyruvátkarboxylázy- cca 10 jednotek, 0,15 mM adenosintrifosfátu,

2,5 mg citrátsyntházy - cca 400 jednotek, 0,01 mmol acetylkoenzymu A/ a dusík stlačený v lahvi.

Do nádobky se odměří 4 ml substrátu, probublá se 2 min. dusíkem a vytemperuje se roztok na 50 °Cj nechá se kapat rtuíová kapková elektroda s dobou kapky kolem 5 sekund a zaznamená se slepá zkouška.· Pak se přidá 0,2 ml séra, znovu se probublá směs 20 sekund dusíkem a potom se zaznamenává lineární průběh enzymatické aktivity. Úhel přímky se slepou zkouškou je mírou aktivity alaninaminotransferázy. Kalibruje se 1 milimolárním redukovaným glutathionem.

Příklad 4

Pro měření aktivity laktátdehydrogenázy - LD užívá se běžný substrát: L-laktát a NAD⁺ ve vhodném pufru a nově se přidá pyruvátkarboxyláza /E.C. 6.4.1.1/ a citrétsyntháza /E.C. 4.1.5.7/ a acetylkoenzym A. Pak reakce probíhá takto:

L-laktát + NAD⁺ _...¾—- _ pyruvát + NADI-I + H+ /1/ pyruvát — oxalacetát pH 9 - 9,5 pyruvátkarboxyláza ^citrát synthází oxalacetát citrát /2/· acetylkoenzym A koenzym A

- 5 248 348

Se vznikem citrátu vzniká i koenzym A, který má volnou thiolovou skupinu a vzniká lineární zápis průběhu enzymatické aktivity laktátdehydrogenazy.

Při provádění způsobu dle vynálezu se používají tato činidla: substrát /obsahující ve 100 ml karbonátového nebo jiného pufru 0,1 M, pH 9,3 : 0,1 mmol L-laktátu, 0,02 mmol NAD -nikotinamid adenin dinukleatid, 1,5 mg pyruvátkarboxylázy - cca 10 jednotek, 0,13 mmol adenosintrifosfátu, 2,5 mg citrátsyntházy - cca 400 jednotek, 0,01 mmol acetylkoenzymu A/ a dusík stlačený v láhvi.

Do nádobky se odměří 4 ml substrátu, probublá se 2 min. dusíkem a vytemperuje se roztok na 30 °C; nechá se kapat rtuíová kapková elektroda s dobou kapky kolem 3 sekund a zaznamenává se slepá zkouška. Pak se přidá 0,2 ml vzorku s enzymem, znovu se probublá směs 20 sekund dusíkem a potom se zaznamenává lineární průběh enzymatické aktivity. Úhel, přímky se slepou zkouškou je mírou aktivity laktatdehydrogenazy. Kalibruje se 1 milimolárním redukovaným glutathionem.

Tím se využívá jednoduchého a levného přístroje k měření aktivity popsaných klinicky důležitých enzymů v séru, což jinak je možné jen s nákladným zařízením pro kontinuální fotometrii v ultrafialovém světle.

Claims (3)

1. Způsob stanovení aktivity enzymů, zejména alkalické a kyselé fosfatázy, aspartátaminotransferázy, alaninaminotransferázy, a laktátdehydrogenázy, vyznačující se tím, že se vzorkem obsahujícím zkoumaný enzym působí na substrát, který v závislosti na enzymatické aktivitě uvolňuje látky s volnou thiolovou skupinou, přičemž při stanovení aktivit enzymů, které přemisťují jiné než thiolové skupiny, například aminoskupiny, vodík a další, se látky s volnou thiolovou skupinou uvolní návaznými reakcemi s přídavnými enzymy, načež průběh uvolňování se sleduje elektrochemicky.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na substrát po odstranění kyslíku působí vzorkem s obsahem zkoumaného enzymu, načež se sleduje průběh napěťového potenciálu mezi látkou s volnou thiolovou skupinou a kalomelovou elektrodou a z rozdílu úhlu mezi přímkou odpovídající slepému pokusu a přímkou odpovídající vzorku s enzymem se stanoví enzymatické aktivita vzorku.

5. Bpůsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se při stanovení aktivity aspartátaminotransferázy uvolni koenzym A z acetylkoenzymu A přidáním citrátsyntházy.

4. Způsob podle bodu 1 a 2,vyznačující se tím, že se při stanovení aktivity alaninaminotransferázy nebo laktátdehydrogenázy uvolní koenzym A z acetylkoenzymu A přidáním pyruvétkarboxylázy nebo citrátsyntházy.