CS246221B1 - Způsob úpravy kolon pro kapalinovou chromatografii - Google Patents

Abstract

Řešení se týká úpravy lože adsorbentu v chromatografických kolonách, kterou se minimalizuje rozmývání zón separovaných látek. Způsob úpravy kolon pro kapalinovou chromatografii se provádí tak, že se na adsorbent v koloně působí zásadami nebo kyselinami a/nebo jejich solemi, jako jsou například hydroxid amonný, tetraalkylamoniumhydroxid, kyselina chloristá, kyselina pikrová, alkylsulfonová a arylsulfonové kyseliny s výjimkou povrchově aktivních látek a jejich sodné, draselné nebo amonné soli, rozpuštěnými v anorganických rozpouštědlech nebo ve směsi organických rozpouštědel a vody průtokem tohoto roztoku. Výsledkem je rovnoměrnější a hutnější uspořádání částic v loži adsorbentu.

Description

Vynález se týká stabilizace lože adsorbentu v chromatografických kolonách, kterou se mini malizuje rozmývání zón separovaných látek.

Klíčový význam v kapalinové chromatografii má kolona s adsorbentem, na níž probíhá dělení směsi látek. Na její kvalitě primárně závisí dělicí účinek a tím celý výsledek chromatografické analýzy. Pro získání vysoce dělící účinnosti musí být adsorbent uložen v koloně velmi rovnoměrně a hutně. Rovnoměrnost uložení částic adsorbentu zajišťuje rovnoměrný průtok mobilní fáze průřezem kolony a nedochází k rozmývání zón látek dělící se směsi, které se projevuje v poklesu dělicí účinnosti kolony. Hutné uspořádání částic adsorbentu v koloně zajišťuje' objemovou stálost lože adsorbentu a nevytvářejí se v něm během používání kolony dutiny, tzv. mrtvé prostory, v nichž dochází k intenzivnímu rozmytí zón látek.

Jako adsorbentů se v kapalinové chromatografii používá silikagelu, kysličníku hlinitého a celé řady modifikovaných silikagelů s chemicky vázanými zbytky, jako např. alkyly o počtu uhlíkových atomů 1 až 22, fenyl nebo jsou to uhlovodíkové zbytky s různými funkčními skupinami, např. se skupinou nitrilovou, hydroxylovou primární, sekundární, terciární nebo kvartérní aminovou skupinou nebo skupinou sulfokyselinovou, fosfátovou či karboxylovou, eventuálně se skupinou opticky aktivní nebo afitivní.

Tyto adsorbenty mají nepravidelný nebo sférický tvar částic, jsou jemně zrněné, úzce vytříděné a jejich střední velikost Částic je většinou v rozmezí 3 až 25 ^um, ve vysoce účinné kapalinové chromatografii 3 až 12 ^um.

Kolony, do nichž se adsorbenty plní, jsou ocelové, ocelové s vnitřním skleněným povlakem, skleněné nebo plastové trubice vnitřního průměru do 8 mm pro analytické účely a více než 8 mm pro preparativní použití. Jejich délka je zpravidla do 3 do 30 cm, nejčastěji 10 až 25 cm, mohou však být i kratší či delší.

Je známo několik způsobů plnění chromatografických kolon adsorbenty s mnoha nuancemi ve volbě kapaliny pro zavádění adsorbentu ve formě suspenze do kolony, tj. suspendační kapaliny, a v tlakovém nebo průtokovém režimu plnění. Podstatně méně pozornosti je věnováno druhu kapaliny, jíž se používá pro vytlačení suspenze adsorbentu ze zásobníku nebo předkolony do chromatografické kolony, jedná se o tzv. tlačnou kapalinu, a kapalině kondicionační, upravující sorpční aktivitu adsorbentu.

Je tomu tak proto, že suspendační kapalina může podporovat nebo potlačovat shlukování nebo dispergaci zrn adsorbentu a stupeň odmíšení zrn podle jejich velikosti. Tyto účinky pak určují hutnost naplnění kolony, rovnoměrnost odporu lože v průměru i podélné ose kolony a rovnoměrnost průtoku mobilní fáze kolonou. Důraz na dodržení optimálních hodnot tlaku a průtoku suspenze -adsorbentu pramení z všeobecně rozšířeného názoru, že právě okamžik ukládání částic adsorbentu do lože je rozhodující pro rovnoměrné a hutné naplnění kolony.

Podle vlastností suspendační kapaliny se popsané způsoby plnění chromatografických kolon dělí na metody isodenzitní, viskozitní, nízkov.iskozitní nebo plnění ze stabilizované vodné suspenze. Isodenzitní metoda používá organických rozpouštědel o hustotě shodné nebo blízké hustotě adsorbentu, aby bylo zabráněno jeho sedimentaci. Jsou to např. různé směsi tetrabromethanu, chloridu uhličitého, dibromethanu, tetrachlorethylenu a dioxanu.

Při viskozitní metodě se volí organická rozpouštědla s velkou viskozitou, která velmi zpomaluje sedimentaci částic adsorbentu. Jsou to např. směsi cyklohexanolu s alkoholy, směsi parafinového oleje s uhlovodíky nebo ethylonglykolu s alkoholy.

Nízkoviskozitní metoda využívá organických rozpouštědel o malé viskositě, jako např. acetonu, nižších kapalných alifatických uhlovodíků, tetrahydrofuranu a dioxanu, jednotlivě nebo ve vzájemných směsích, případně s přídavkem vody. Aby se zabránilo sedimentaci, při níž dochází k odmíšení částic adsorbentu, musí se kolona plnit rychle nebo se musí sus3 penze v zásobníku míchat, a to buč mechanickými míchadly, nebo při plnění zdola nahoru, proudem tlačné kapaliny. K plnění kolony stabilizovanou vodnou suspenzí adsorbentu se jako stabilizátorů používá např. amoniaku nebo fosforečnanového pufru.

Při isodenzitní a viskozitní metodě plnění kolon se používá tlačná kapalina odlišná od suspendační kapaliny, jako např. nižších alkoholů, vody, tetrahydrofuranu, chloroformu, methylenchloridu, nižších kapalných alifatických uhlovodíků, samostatně nebo ve směsích. U nízkoviskozitní metody plnění kolon je tlačná kapalina zpravidla shodná s kapalinou suspendační.

Nevýhodou těchto způsobů plnění kolon pro kapalinovou chromatografii je kolísavá hodnota dělicí účinnosti naplněných kolon, způsobená špatnou reprodukovatelností vytváření rovnoměrného a hutného uspořádání částic v loži adsorbentu. Jejím důsledkem je pak i nedostatečná objemová stálost náplně kolony při jejím používání. Dále to jsou nároky na dodržení tlakového a průtokového režimu při plnění kolony.' Přestože dodatečné sedání lože adsorbentu v koloně je jevem velmi častým, jeho příčina byla dosud hledána pouze ve vlastnostech suspendační kapaliny a v působení tlaku, rychlosti a doby průtoku suspendační a tlačné kapaliny.

Způsob úpravy kolon pro kapalinovou chromatografii podle vynálezu^xse vyznačuje tím, že se na adsorbent, kterým je silikagel, silikagel s chemicky vázanými organickými skupinami nebo kysličník hlinitý, působí v chromatografické koloně zásadami nebo kyselinami a/nebo jejich solemi, jako jsou například hydroxid amonný, tetraalkylamonium hydroxidu, kyselina chloristá, kyselina pikrová, alkylsulfonové kyseliny o počtu uhlíkových atomů 1 až 8 a arylsulfonové kyseliny o počtu uhlíkových atomů 6 až 10 s výjimkou povrchově aktivních látek, a jejich sodné, draselné nebo amonné soli, rozpuštěnými v organických rozpouštědlech typu alkoholů, ketonů, aldehydů, esterů nebo kyanosloučenin, nebo ve směsi těchto organických rozpouštědel s vodou do obsahu vody 90 % hmotnostních.

Působením zásad, kyselin a solí, rozpuštěných samostatně nebo ve směsích v organických rozpouštědlech nebo ve vodně-organických rozpouštědlech, dochází k většímu vzájemnému přiblížení částic v loži adsorbentu. Pravděpodobně eliminací elektrického náboje částic adsorbentu se zruší síly mezi částicemi náplně kolony. Výsledkem tohoto působení je rovnoměrnější a hutnější uspořádání částic v loži adsorbentu. Větší rovnoměrnost uložení částic se příznivě projevuje v poměrně vysoké, asi devadesátiprocentní, výtěžnosti kolon s dobrými dělicími vlastnostmi .

Vyšší hutnost lože adsorbentu způsobuje větší objemovou stálost náplně kolony při jejím zatěžování průtokem mobilní fáze libovolného složení během používání kolony v chromatografických analýzách. Sloupec adsorbentu v koloně neklesá a nevytvářejí se v něm mrtvé prostory. Zhutňování náplně kolony při působení kyselin a solí podle vynálezu je patrné z kontrakce sloupce adsorbentu, projevující se snižováním jeho horní úrovně. Zhutnění potvrzuje i vyšší tuhost náplně kolony při jejím mechanickém namáhání.

Při úpravě chromatografických kolon podle vynálezu není podstatný druh suspendační a tlačné kapaliny, tlakový a průtokový režim použitý při plnění kolony. Pro úpravu je možno vzít kolonu ve stadiu plnění po vtlačení suspenze adsorbentu do kolony, kdy tlačnou kapalinou je roztok kyselina solí podle vynálezu, dále kolonu, kterou již protekla tlačná kapalina nebo kolonu v libovolném stadiu její kondicionace, tedy i kolonu s procesem plnění ukončeným, například kolonu komerční. Jedinou podmínkou, která musí být splněna, je mísitelnost kapaliny v koloně s roztokem použitým k stabilizaci lože adsorbentu podle vynálezu.

Pro dosažení účinku na náplň kolony podle vynálezu postačuje zpravidla koncentrace kyselin, solí nebo jejich směsí 10 až 10 % hmotnostních v použitém roztoku. Pokud se použije jako rozpouštědla směs nepolárního a polárního organického rozpouštědla nebo směs polárního organického rozpouštědla s vodou, pak je třeba jejich vzájemný poměr volit takový, aby výsledný roztok zásad, kyselin a solí byl homogenní a nedocházelo k tvorbě dvoufázového systému. Nejčastěji vyhovují směsi nízkomolekulárních alkoholů a vody v poměru 50:1 až 1:20.

Příklad 1

Kovová kolona rozměrů 4x250 mm byla naplněna silikagelem o střední velikosti Částic 10,0 s chemicky vázanými dimethylsilylovými skupinami za použití suspendační kapaliny cyklohexanol-methanol v poměru 95:5. Lože adsorbentu bylo stabilizováno průtokem tlačné kapaliny, kterou byl roztok 0,05 g chloristanu sodného v 250 ml methanolu. Po promytí kolony mobilní fází, jíž byla směs methanol-voda v poměru 60 : 40, byla testována. Pro anisol (k = 2,5) měla dělicí účinnost 10 700 teoretických pater, což odpovídá výšce redukovaného patra h = 2,3. Stejným způsobem připravená kolona bez použití chloristanu sodného měla dělicí účinnost jen 4 030 teoretických pater a h = 6,2.

Příklad 2 '

Postupem uvedeným v příkladu 1 byla naplněna stejná kolona silikagelem o střední velikosti částic 7,5 jum s chemicky vázanou oktadecylovou fází s tím rozdílem, že jako tlačné kapaliny bylo použito 250 ml směsi acetonitril-voda v poměru 40:60, v níž bylo rozpuštěno 0,04 g kyseliny chloristé. Dělicí účinnost kolony dosáhla 17 430 teoretických pater a h ~ 1,9.

Příklad3

Kovová kolona o rozměrech 4x200 rrm byla naplněna silikagelem o střední velikosti částic 5,2/um Jako suspendační kapalina byla použita směs cyklohexanolu s n-heptanem v poměru 95 : 5 a tlačnou kapalinou byl lékárenský bezín. Tato kolona kondicionovaná mobilní fází n-hexan-ethanol v poměru 993 : 7 měla dělicí účinnost odpovídající h - 2,9. Po záměně této mobilní fáze mobilní fází s obsahem alkoholu vyšším než 2 % objemová, do níž byla přidána voda nebo vodný roztok elektrolytu, bylo již po několika hodinách měření pozorováno postupné zhoršování, dělicí účinnosti kolony, provázené zhoršováním tvaru chromatografických zón a kontrakcí lože adsorbentu. Proto byla kolona doplněna další porcí silikagelu, stejným způsobem jako při plnění a po odstranění tlačné kapaliny byla promyta směsí n-hexan-isopropanol v poměru 95:5, do níž bylo přidáno 10 ^J % hmotnostních kyseliny pikrové. Po této úpravě byla získána kolona s dělicí účinností odpovídající h = 3, z níž byly nastřikované soluty aluovány v symetrických zónách. Lože adsorbentu bylo rozměrově stálé bez ohledu na obsah alkoholu, vody i elektrolytu v mobilní fázi.

Příklad 4

Postupem uvedeným v příkladu 3 byla ze silikagelu téže výrobní šarže, ale o zrnění 10,3 připravena kolona stejných rozměrů, s tím rozdílem, že po vymytí suspendační kapaliny tlačnou kapalinou byla kolona stabilizována průtokem směsi n-hexan-isopropanol v poměru 95 : 5 s přídavkem 10~ % hmot. kyseliny pikrové. Pro nesorbovaný solut měla tato kolona dělicí účinnost odpovídající h = 2,5. Eluované zóny testovaných látek byly symetrické a dělicí účinnost kolony byla po dobu čtyř měsíců používání stálá, bez ohledu na složení mobilních fází, v nichž hlavní podíl, nad 75 % objemových, tvořil uhlovodík.

Příklad 5

Kolona rozměrů 4x100 mm byla naplněna silikagelem o střední velikosti částic 4,5 ^um.

Silikagel byl suspendován ve směsi cyklohexanol-methanol v poměru 80:20 a jako tlačná kapalina -3 byl použit ethanol denaturovaný methanolem s přídavkem 5.10 % hmotnostních kyseliny chloristé. Při testování s hexanem jako mobilní fází měla takto připravená kolona pro nesorbovanou látku dělicí účinnost odpovídající h = 2,7. Lože adsorbentu zůstalo objemově stálé a podrželo si svoje dělicí schopnosti i při promývání vodným roztokem síranu sodného nebo chloristanu sodného o koncentraci 4 % hmotnostních, do něhož bylo přidáno do 10 % objemových methanolu, a který byl případně okyselen kyselinou fosforečnou nebo kyselinou chloristou na pH = 2 až 5. Proti změnám v uložení částic, způsobeným rozpouštěním silikagelu ve vodných mobilních fázích, byla náplň kolony chráněna předkolonou naplněnou silikagelem.

Příklad6

Kovová kolona rozměrů 4x200 mm byla naplněna neutrálním kysličníkem hlinitým o střední velikosti částic 6,2 postupem popsaným v příkladu 3 s tím rozdílem, že po vymytí suspendační kapaliny tlačnou kapalinou bylo lože adsorbentu stabilizováno promytím směsí n-hexan-isopropanol v poměru 90: 10, nasycenou koncentrovaným vodným roztokem amoniaku. Takto upravená kolona měla počáteční dělicí účinnost pro nesorbovanou látku odpovídající h - 3,2. Po ročním používání kolony, během něhož byla zatěžována mobilními fázemi typů uhlovodík-polární organické rozpouštědlo-voda-elektrolyt se snížila její dělicí účinnost pouze na hodnotu odpovídající h = 4,0.

Příklad 7

Komerční kovová kolona o rozměrech 6x250 mm naplněná silikagelem o velikosti částic 10 ^um s chemicky vázanými oktylovými skupinami mela po uvedení dó provozu za podmínek doporučených výrobcem pro testování, dělicí účinnost odpovídající h = 8 a testovací látky z ní byly eluovány v asymetrických zónách. Byla proto stabilizována promytím směsí vody a acetonu v objemovém poměru 70:30 s přídavkem 0,01 % hmot. benzensulfonanu sodného. Volný prostor na vstupu kolony, vzniklý kontrakcí lože adsorbentu byl vyplněn skleněnými kuličkami o velikosti 60 až 80 jim. Takto upravená kolona vykazovala za podmínek doporučených pro testování pro všechny zkušební látky dělicí účinnost lepší než h = 5,0, přičemž zóny testovacích látek byly symet* rické.

Příklad 8

Nerezová kolona rozměrů 3x100 mm byla naplněna silikagelem o střední velikosti částic 5,5 fum s chemicky vázanými kyanopropylovými skupinami. Adsorbent byl suspendován v tetrachlormethanu, jako tlačná kapalina byl použit hexan, který byl z kolony odstraněn promytím kolony ethanolem, denaturovaným methanolem. Lože adsorbentu pak bylo stabilizováno promytím kolony směsí denaturovaného ethanolu a vody v objemovém poměru 2:1, do níž bylo přidáno 0,01 % hmotnostních p-toluensulfonanu sodného. Pro nesorbovanou látku měla tato kolona dělicí účinnost odpovídající h ~ 3,4 a zóny sorbovaných látek byly symetrické.

Příklad 9

Nerezová kolona o rozměrech 4x100 mm byla naplněna silikagelem o středním průměru částic 10,4 fUm s chemicky vázanými oktadecylovými skupinami. Náplň byla suspendována cyklohexanol-ethanol v poměru 95:5 a jako tlačná kapalina byl použit ethanol denaturovaný methanolem, do něhož bylo přidáno ,001 % hmotnostních chloristanu sodného. Jako mobilní fáze byla použita směs vodného fosforečnanového pufru s acetonitrilem v objemovém poměru 70:30. Pro sorbovanou látku s kapacitním faktorem k = 4 měla kolona dělicí účinnost odpovídající h = 2,4. Po dobu jednoho roku používání byla kolona promývána mobilními fázemi typu voda-polární organické rozpouštědlo, například methanol, isopropanol, aceton, acetonitril, s přídavkem anorganických kyselin, například kyseliny sírové, kyseliny fosforečné, nebo pufrů, např. fosfátový, acetátový nebo pufr s tris(hydroxymethyl)aminomethanem, přítomnými ve vodné složce mobilní fáze v koncentracích až do 200 mmol/1. Během této doby dělicí účinnost kolony pro sorbovanou látku s k - 4 poklesla pouze na h - 3,1, přičemž zóny solutů zůstaly symetrické.

Claims (1)

1. Způsob úpravy kolon pro kapalinovou chromatografii, vyznačený tím, že se na adsorbent, kterým je silikagel, silikagel s chemicky vázanými organickými skupinami nebo kysličník hlinitý, působí v chromatografické koloně zásadami nebo kyselinami a/nebo jejich solemi, jako jsou například hydroxid amonný, tetraalkylamonium-hydroxidy, kyselina chloristá, kyselina pikrová, alkylsulfonové kyseliny o počtu uhlíkových atomů 1 až 8 a arylsulfonové kyseliny o počtu atomů 6 až 10 s výjimkou povrchově aktivních látek, a jejich sodné, draselné nebo amonné soli, rozpuštěnými v organických rozpouštědlech typu alkoholů, ketonů, aldehydů, esterů nebo kyanosloučenin, nebo ve směsi těchto organických rozpouštědel s vodou do obsahu vody 90 procent hmotnostních.