CS240831B1 - Způsob přípravy imunoreagencií obsahujících protilátky - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy imunoreagencií obsahujících protilátky, které jsou universálně použitelné pro kvalitativní a kvantitativní laboratorní techniky stanovení lidských plazmatických bílkovin v tělních tekutinách. Způsob přípravy imunoreagencií obsahujících protilátky se vyznačuje tím, že k hyperimunnímu zvířecímu antišéru se přidají solubilní antigeny až do v^sycení balastních protilátek a následné se izoluje imunoglobulinová frakce opakovaným vysolováním, iontoměničovou chromatografií a následně dialýžou do prostředí o nízké iontové síle.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy imunoreagenclí obsahujících protilátky, specifické proti lidským plazmatickým bílkovinám a přitom nevykazujících přítomnost nadbytečných antigenů, rozpustných imunokomplexů a lipoproteinů a proto vhodných pro kvalitativní i kvantitativní lmunochotnické diagnostické metody: ímunopreclpitační techniky, radloimunoanalytlcké techniky, enzymoimunoanalytlcké techniky, aglutinační techniky, nefelometrie, turbidimetrie, hletologická vyšetření·

Obecně lze tyto imunoreagencie obsahující protilátky připravit ze surových zvířecích antlsér obsahujících specifické a balastní protilátky, odstraněním nežádoucích protilátek pomocí nerozpustných antigenů, vázaných obvykle na vhodný nerozpustný nosič· Tímto postupem ee zajistí nepřítomnost nadbytečných antigenů používaných k odstranění balastnich protilátek a rozpustných imunokomplexů. Lipoproteiny se odstraní z hyperimunních sér buď dellpidačníml činidly a nebo izolací imunogl obul lnové frakce z vysyoeného anti séra.

Příprava nerozpustných antigenů vyžaduje velmi kvalitní nosič s vysokou pořezitou, aby se antigen mohl vázat nejen na povrchu partikul! gelu, ale i uvnitř partikul1. Tyto kvalitativní nároky splňuje Sepharóza AB aktivovaná bromkyanem (bromkyan em aktivované sférické agarózové gel ově částice), která je však velice drahá a tím obtížně dostupná. Náhrada bromkyanem aktivované Sepharózy AB neaktivovanou Sepharózou AB a Její přímá aktivace broukyanem je sice levnější, ale tato práce je spojena s rizikem práce s prudce jedovatým a silně těkavým jedem. Gely československé výroby Insolmer (syntetický polymer na bázi esteru aromatických kyselin), Spherony (hydrofilní makroporesní glykolmethakrylátové gely) nemají vlastnosti srovnatelné s vlastnostmi Sepharózy AB při vyvažování bílkovin, váží antigeny pouze na svém povrchu a účinnost takto vázaného antigenu je řádově nižší než při použití rozpustných antigenů.

Odstraňování balastních protilátek insolubilnlmi antigeny z hyperimunních zvířecích antlsér je obecně zdlouhavý proces, je nutno provádět regenerace nosičů promýváním a centrlfugací (energetická náročnost) a pro velkovýrobní použití je obtížné. Při tomto způsobu vysycování hyperimunních sér vzrůstají nároky na vybavení práčovišt přístroji a zařízeními, rostou požadavky na pracovní síly, doohází k omezování objemu výroby a narůstá i čas potřebný k výrobě preparátů.

Tyto vyjmenované nevýhody odpadají při použití rozpustných antigenů k odstranění balastních protilátek z hyperimunních zvířecích antlsér·

240 831

Podstatou vynálezu je jednoduchý způsob přípravy Imunoreagencií obsahujících protilátky, který k odstranění balastních protilátek ze zvířecích hyperimunních antisér využívá přidáváni solubilních antigenů až do jejich vysycení a následně izolace imunoglobulinová frakce opakovaným vysolováním, iontoměniěovou chromatografií a dialýzou do prostředí o nízké iontové síle I «0,005 až 0,02 ₀ Sol ubil ní vy syc ovací materiály Jsou před jejich použitím kontrolovány imunoolektroforeticky na přítomnost antigenů imunogl obul lnu G, který při vy syc ovacím postupu nesmí být do antlséra vnesen v nadbytku, ale pouze do ekvivalence antlgen IgG- protilátka antl IgG. V případě, že po odstranění ostatních balastních protilátek v antiséru zhývá ještě protilátka proti imunoglobulinu G, odstraní se přidáním čistého antigenů imunoglobulinu G do akvivalence.

Cílem uvedených principů vysycování balastních protilátek z hyperimunního antiséra je kromě odstranění nežádoucích protilátek zabránění zanesení nadbytečného antigenů imunoglobulinu G do vysycovaného hyperimunního antlséra· Zanesení ostatních nadbytečných antigenů není na závadu, nebol dojde k jejich odstranění při izolaci imunoglobulinové frakce z vysyceného hyperimunního antiséra. Analytická kontrola používaných antigenů a zpracovávaných hyperimunních antisér se provádí e výhodou imunoelektroforeticky.

Při následné izolaci imunoglobulinové frakce z vysyceného hyperimunního antiséra dojde k odstranění nadbytečných antigenů použitých k vysycování balastních protilátek, lipoproteinů a rozpustných Imunokomplexů, při současném zachováni vysoké čistoty a výtěžnosti imunoglobulinové frakce a vysoké avidity specifických protilátek. Izolace Imunoglobulinové frakce z hyperimunního antiséra představuje purifikační proces, kdy se po filtraci vysyceného hyperimunního antiséra přes čeřící filtr (na př. Seitz K 5) opakovaným vysoleními s výhodou síranem amonným do 40% nasycení u prasečích antisér a do 45% nasycení z králičích, kozích, ovčích, koňských, hovězích, morčecích a myších antisér) a následnou chromatografií na lontoměnlči (dietylaminetyl celulose s výhodou na př. DEAJS celulose DB 52) při pH · 5,7 pro prasečí a 7,0 pro oetatní druhy antisér, izoluje imunoglobulinová frakoe, která se následně dlalyzuje do prostředí o nízké iontové síle (s výhodou proti 0,003 M wonohydrofosforečnanu sodnému) a filtruje přes hustý čeřící filtr (na př. Seitz K 5).

Tímto postupem se odstraní nadbytečné antigeny zanešené do hyperimunního séra při odstraňování balastních protilátek a také rozpustné lmunokomplexy a lipoproteiny. Sventůelně přítomný nadbytečný antlgen Imunoglobulinu G, by se tímto krokem neodstranil.

- 3 240 831

Takto izolovaná imunoglobullnová frakce z hyperimunního antiséra ae lyofilizuje a skladuje dále při teplotě +4°C.

Z lyofilizováné imunoglobulinové frakce se připraví sterilní roztok se standardním titřem specifických protilátek, který je použitelný jak pro klasické lmunopreclpltační techniky, tak pro moderní analytické metody: radioimunoanalýeu, enzymoimunoanalýzu, nefelometril, turbldlmetrli, aglutinační techniky, hietologická vyšetření a pod.

Široká škála použitelnosti imunoreagencií obsahujících protilátky připravených uvedeným způsobem je dána jejich vlastnostmi, t.j. standardním tltrem specifických protilátek, absencí nadbytečných antigenů použitých k odstraňování balastních protilátek, nepřítomností rozpustných imunokomplexů a llpoproteinů.

Způsob přípravy imunoreagencií je osvětlen na následujících příkladech

Přiklad 1.

Příprava prasečí Imunoglobullnové frakce proti lidskému imunoglobulinu M.

Surové hyperlmunní prasečí antisérum proti lidskému imunoglobulinu M obsahuje kromě protilátky anti-lgU také nežádoucí protilátky proti alfa 2 makroglobullnu (A^M) a Imunoglobulinu G (IgG). Surové antisérum se titruje roztokem antigenů alfa 2 makrogl obul inu tak, že se vždy k 1 ml surového antlséra přidá stoupající množství roztoku antigenů alfa 2 makroglobul inu a to 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml atd. Tltrace se provádí za imunoelektroforetlcké kontroly. K surovému hyperimunnímu antiséru se přidá takové množství antigenů alfa 2 makroglobulinu, až zcela vymizí protilátka proti alfa 2 makroglobulinu. Protože roztok antigenů alfa 2 makroglobullnu obsahuje vždy i stopy jiných antigenů, zanáší se přl vyučování protilátek proti alfa 2 makrogl obul inu do surového hyperimunního antiséra nadbytečné antl<eny.

Dále se provede titrace surového hyperimunního antlséra roztokem imunoglobullnu G a stanoví se optimální množství antigenů Imunoglobullnu G, které je potřeba dodat k hyperimunnímu surovému antiséru, aby vymizela protilátka proti imunoglobullnu G a do antiséra nebylo zanešeno nadbytečné množství antigenů Imunoglobulinu G. Titrace se provádí za imunoelektroforetlcké kontroly.

Po odstranění balastních protilátek ze surového hyperlnoumího antiséra se vysycené antisérum zfiltruje přes vrstvu Seitz K 5 a Izoluje se z něj

- 4 240 831

4m?mogl obul lnová, frakce třikrát po sobě opakovaným srážení· nasyceným roztokem síranu amonného do 40% nasycení. Sediment obsahující surovou lmunoglohu1lnovou frakci se dialyzuje proti 0,03 M acetátovému tlumivému roztoku pH

5,7 při +4°C až do vymizení pozitivní reakce na amonné lonty. Vydialyzovaná lmunoglobullnová frakce ae dočistí vsádkovou chromátograflí na DEAN celulóse DE 52 (10 g celulosy na 1 g bílkoviny) a filtrát obsahující čistou imunoglohulinovou frakci se dialyzuje proti 0,003 M monohydrofosforečnanu sodnému (NagHPO^) po dobu tři až pěti dní za výměny dlalyzačního roztoku dvakrát denně. Vzniklý preclpltát se odstraní filtrací přes vrstvu Seitz K 5 a filtrát se lyofilizuje.

Příprava diagnostika:

Ze získaného lyofilizátu se připraví 5% roztok prasečí lmunoglobullnové frakce proti lmunogl obul lnu M ve fyziologickém roztoku pH - 7,2 (PBS) s 0,1% azldem sodným. Stanov! so titr specifických protilátek proti imunoglobullnu M metodou jednoduché radiální imunodlfuze (modifikace Becker,W.: Immunochem. 6, 539, 1969) a koncentrace bílkoviny připraveného roztoku.

Úměrou se vypočte potřebné množství lyofilizátu pro přípravu zvoleného množství diagnostika tak, aby byl dodržen standardní titr specifických protilátek, u prasečí lmunoglobul lnové frakce proti lmunoglobul inu M je to 6,9 mg/ml. Roztok se zfiltruje přes vrstvu K 5, změří se pH. Není-li pH v rozmezí hodnot 7,2 - 7,4 upraví so bu5 1 N roztokem hydroxidu sodného nebo 1 N roztokom kyseliny chlorovodíkové.

Opětovně se provede kontrola titru specifických protilátek metodou Jednoduché radiální imunodlfuze, výsledná hodnota se má shodovat s předem provedeným výpočtem. Není-li tomu tak roztok diagnostika ae naředí nebo se přidá další lyofilizát lmunoglobullnové frakce podle posledního výpočtu, opakuje ae měření pH a kontrola titru specifických protilátek až je dosaženo jeho požadované hodnoty.

Roztok lmunoglobullnové prasečí frakce proti lmunoglobulinu M se sterilně zfiltruje nejlépe membránovým filtrem (0,22 u) a sterilně rozplní po alikvotních množstvích do skleněných lahviček.

Takto připravené diagnostikům má široké spektrum upotřebení. Lze Jím detekovat imunoglobulin M ve všech používaných druzích kvalitativních imunoprecipitačních testů na př. Ouchterlonyho dvojitá imunodlfuze, imunoelektroforéze, protisměrná lmunoelektroforéza.

Diagnostikům připravené výše uvedeným způsobem lze využít plně při kvantitativních imunoprecipitačních testech jako je na př. metoda jednoduché radiální imunodifuze: 240 831

V cltrát-veronal-oxalátovém pufru pH « 8,6, iontové sílo I « 0,05 ee rozvaří agaróze na 1% koncentraci a po echladnutí na 50°C ee k roztoku přidá 0,10 ml prasečí Imunoglobullnové frakce proti imunogl obul lnu M na 30 ml gelu· Směs se promíchá a naleje ve vodorovné poloze na diapozitivní sklo 8,5 x 18 cm·

Po zatuhnutí gelu (asi 30 minut) se zabroušenou transfuzní jehlou vykrojí startovní jamky o průměru 2 mm a aplikují es do nich standardní roztoky a vyšetřované vzorky (5x ředěné) lidských sér· Po proběhnuti 48 hodinové preclpitacl při laboratorní teplotě ve vlhké komůrce ee destička vymyje fyziologickým roztokem, usuší se, obarví a hodnotí· Hodnoty obsahu imunoglobullnu M ve vyšetřovaných vzorcích se odečítají z kalibrační křivky sestrojené jako závislost čtverce průměrů precipitačnlch prstenců na koncentraci standardních vzorků. Ve variantě metody jednoduché radiální imunodifuze, kdy se neředí vyšetřovaná lidská séra, se k nalití jedné imunodifuzní plotny o rozměrech

8,5 x 18 cm, t.j· 30 ml gelu, použije 0,25 ml prasečí imunogl obul lnové frakce.

Pomocí diagnostika připraveného podle uvedeného způsobu lze kvantifikovat ímunoglobulln M v lidských tělních tekutinách na př. metodou nefelometrlckou:

Prasečí imunogl obul lnová frakce proti Imunogl obul lnu Use naředí lOOx 4% roztokem polyenthylenglykolu 6000 a zfiltruje se přes čeřící vrstvu na př.

Seitz E 5· Připravený roztok se rozplní do kyvet nefelometru po 1 ml a k jednotlivým množstvím diagnostika se přidá standardní nebo vyšetřované lidské sérum.

Jednotlivé směsi roztoků se promíchají a po 30 minutách stání se změří rozptyl světla na laserovém nefelometru. Z naměřených hodnot rozptylu standardních vzorků se sestrojí kalibrační křivka, na které se odečítají hodnoty obsahu imunoglobul inu M ve vyšetřovaných lidských sérech.

Detekci obsahu Imunogl obul inu M lze provést i metodou terbidimetrie:

Prasečí imunogl obul lnová frakce proti imunogl obul lnu M so naředí 20x 4% roztokem polyethylenglykolu 6000 a zfiltruje se přes čeřící vrstvu na př. Seltz E 5. Připravený roztok se rozplní do kyvet spektrofotometru po 1 ml a k jednotlivým množstvím diagnostika se přidá standardní nebo vyšetřované lidské sérum.

Jednotlivé směsi roztoků se promíchají a nechají stát 30 minut. Měří se absorbance při 340 nm na UV spektrofotometru.

Prasečí imunoglobulínovou frakci proti imunoglobulinu M lze použít ke kvantitaci imunogl obul inu i metodou imunoenzymostanovení a radiolmunostanovení. Prasečí imunoglobullnová frakce proti imunoglobulinu li se zředí tisíckrát

240 831

0,05 M bikarbonátovým pufrera pH-9,6 a aplikuje ee po 0,1 nl do jamek mikrotitračních destiček. Po proběhnutí inkubační doby (zpravidla 60 minut) se jednotlivé jamky promyjí třikrát promývacím roztokem a aplikují ee standardní a vyšetřované vzorky. Po proběhnutí inkubační doby (30 až 60 minut) ee jamky opět třikrát promyjí promývacím roztokem a aplikuje ae značená protilátka (enzymem nebo radioizotopem). Po Inkubaci 15 minut ae vyvolá barevná reakce enzymu a měří se pak abaorbance nebo v případě radioizotopického značeni ae měří přímo radioaktivita.

Z naměřených hodnot standardních vzorků se sestrojí kalibrační křivka, ze které se odečítají hodnoty měřených vzorků.

Principielně stejným způsobem jako je uvedeno na přikladu 1 lze připravovat další zvířecí imunoglobullnové frakce proti bílkovinám lidského séra na př. imunogl obul inu G, imunoglobulinu A, eekrečnimu imunoglobulinu A, C3 a Ch složce lidského komplementu, alfa 2 makroglobul inu, transferinu, fragmentu těžkého řetězce imunoglobullnu G, fragmentu lehkého řetězce imunoglobulinu G, albuminu, orosomukoidu, ceruloplazminu, prealbuminu, alfa 1 antitrypsinu, hemopexinu, haptoglobinu, sekreční komponentě, fibrinogenu, fetoproteinn, ferrltinu a dalším.

Z uvedených příkladů přípravy a použiti je patrna široká škála použitelnosti lmunoreagencií obsahujících protilátky připravených výše uvedeným způsobem pro detekci a kvant!taci různých druhů plazmatických bílkovin. Široké spektrum použitelnosti je dáno vlastnostmi připravených diagnostik, t.j. etandarním titrém specifických protilátek, nepřítomnosti nadbytečných antlgenů, imunokomplexů a lipoproteinů.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   240 831

   1. Způsob přípravy inamoreagencíí obsahujících protilátky, vhodných pro imunopreoipitační techniky, radiolmunoanalytické techniky, imunoenzymoanalytické techniky, aglutinační techniky, nefelometrli, turbidimetrli a hietologická vyšetření, vyznačující se tím, že ee k hyperinunnímu zvíře čímu antlséru přidají solubilní antigeny až do vytyčení balastních protilátek a následně se izoluje imunogl obul lnová frakce vysolováním, potom lantoměničovou chromatografií a následně dialýzou do prostředí o nízké iontové síle I · 0,005 až 0,02 .
2. 2. Způsob přípravy lmunoreagenclí obsahujících protilátky podle bodu 1, vyznačující se tím, že v hyperlmunním zvířecím antlséru přítomná protilátka proti imunogl obul inu G se odstraní přidáním ekvivalentního množství čistého imunoglobulinu G,
3. 3· Způsob přípravy lmunoreagenclí obsahujících protilátky podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k přípravě lmunoreagenclí používá surové prasečí antisérum,
4. 4« Způsob přípravy imunoreagencii obsahujících protilátky podle bodu 1 až 3, —^vyznačující se tím, že se dialýza provádí do prostředí v iontové síle