239826239826
Vynález sa týlka spós-obu přípravy slin-riého izoenzýmu alfa amylázy.The invention relates to the preparation of a saline isoenzyme of alpha amylase.
Popři chromolytických metodách na gé-locli z molekulových sít a ionexov, medzi•techniky separácie a izolácie enzýmov pat-ří metoda afinitnej chromatografie. E. Star-kenstein a O. Holmbergh k izolácii alfa a-mylázy z biologického- materiálu použili n-a-tívny škrob [Έ. Stadkenstein, O. Holmbergh:Biochem. Z. 24, 21-0 (1910); O. Holmbergh:Biochem. Z. 25-8, 134 (1933)]. Natívny škrobako afinant obecného typu bol ďalej použitýaj k izolácii alfa amylázy z Clostridium ace-to-butilicum [D. J. D. Hockenhull, D. Her-bert: Biochem. J. 39, 102 (1945) ] a alfa a-mylázy iz ja-čmeňa [S. Schwimmer, A. K.Balls: J. Biol. Chem. 179, 1063 (1949)]. Ako-afinitný ligand bol použitý a) glyko-gén, via-zaný kovalentnou vazbou na povrch modifi-kovaného dextránu [R. Tkachuk: FEBS Lett.52, ©6 (1975)]. Natív-ny škrobový substrát soh-1'adom na -nehomogenitu partikul a ne-vhodné .hydrodynamické vlastnosti nemá vy-hovujúice vlastnosti ani afinitný ligand a-mylolytických enzýmov [R, M. Sandsted, S.Ueda: Japan Soc. Starch. Sci. 17 215 (1969)].Tento- postup ani použitie dalších afinantovna báze modifikovaných alfa-glukáncv ne-zabezpečoval ochranu amylázového glyko-proteinu slinnej izoamylázy pre-d účink-ombak-teriálnych hydroláz nachádzajúcich -sav dutině ústnej [Μ. P. Silvanovich, R. D.Hill: Anal. Biochem. 73, 430 (1976)]. Opti-málný postup neza-bezpečuje -ani použitieproteinového i-nhibítora alfa amylázy izolo-vaného z frakcie albumínov pšeničných zrna viazaného.-na modifikovaný dextrán kova-lentnou vazbou. Uplatňujú sa totiž vysokénešpeicificlké sorpcie nosné] matrice vočisprievodným proteinom a nízká účinnostafinitného liganda viazaného n-a povrch ma-trice bez pacera, na čo poukazujú výsledkys alfa amylázou slepačieho pankreasu, fu-d-ských stín a alfa -amylázou larvy Tenebriomoli-tor [V. Bu-onocore, E. Poerico, F. Gra-menzi. V. Síláno:. J. Chromatogr. 114, 109(1975)].In addition to the chromolytic methods on gel-locel from molecular sieves and ion exchangers, the techniques of separation and isolation of enzymes include the affinity chromatography method. E. Starkenstein and O. Holmbergh used n-starch starch to isolate alpha-mylase from biological material. Stadkenstein, O. Holmbergh: Biochem. Issue 24, 21-0 (1910); O. Holmbergh: Biochem. Z. 25-8,134 (1933)]. Native starch starch of the general type was further used to isolate alpha amylase from Clostridium ace-to-butilicum [D. J. D. Hockenhull, D. Herbert: Biochem. J. 39, 102 (1945)] and alpha a-mylases from ja-n. Schwimmer, A. K.Balls: J. Biol. Chem. 179, 1063 (1949)]. The affinity ligand used was a) a glyco gene, covalently linked to the surface of the modified dextran [R. Tkachuk: FEBS Lett. 52, © 6 (1975)]. Native starch substrate with respect to particle homogeneity and unsuitable hydrodynamic properties does not possess the properties or affinity ligand of α-myolytic enzymes [R, M. Sandsted, S.Ueda: Japan Soc. Starch. Sci. This procedure, or the use of other affinity bases of modified alpha-glucan, did not provide protection of the amylase glycoprotein of salivary isoamylase pre-d effect of ombacid terralas located in the oral cavity [Μ]. P. Silvanovich, R. D. Hill: Anal. Biochem. 73, 430 (1976)]. The optimal procedure does not prevent the use of a protein alpha-amylase inhibitor isolated from the fraction of wheat grain albumin bound to the modified dextran by covalent bonding. In fact, the high-specific carrier sorption of the matrix is applied to the prion-free protein and the low efficacy of the affinity ligand bound to the n-α surface without the pacifier, as indicated by the results of the alpha pancreatic amylase, fu-shade and alpha-amylase of the Tenebriomolor [V. Buonocore, E. Poerico, F. Gramenzi. V. Sielano :. J. Chromatogr. 114, 109 (1975)].
Uvedené nedostatky rieši tento vynález,ktorého podstatou je, že čerstvý sekrét l'ud-ských slin, ale-bo biologických tekutin ob-sahujúci slinný izoenzým alfa amylázy -sazriedi desatinou objemu acetóno-m a získanýroztok sa centrifuguje pri 2 000 až 3 000 gpo dobu 10 až 20 rninú-t, supernatant sa ad-justuje na pH 7 a pomocou acetonu vychla-deného na teplotu —10 až —-20 °C sa upravípo kvapíkách výsledná kon-centrácia aceto-nu v roztoku -na 40 až 50 θ/o objemových -azískaná suspenzia sa centrifuguje pri 2000až 30-00 g po dobu 10 až 20 minút, načo sazískaný supernatant obsahujúci alfa amy-lázu přečistí afinitnou metodou pomocoulektínu specifického k N-acetyl-D-glukóz-a--mínu a ku kyselině siálovej viaza-nej kova-lentnou vazbou, -na povrch perlovej celuló-zy a následovně sa uvolní enzým alfa amy-láza z komplexu s lektínom účinko-m 0,02 4 až 0,1 mol. 1_1 roztoku N-acetyl-D-glukóza-mínu, alebo 2 až 5 % hmotnostných glyko-gén u v 0,0il až 0,05 mol. I”1 fosfátovom ú-strojnom roztoku a pH až 7,2 a objeme 5 až10 násobné vyššom ako je napúčací objempoužitého afinantu. Výho-dou navrhovaného spós-obu je vyso-ká afinita kóvalentne viazaného lektínu,specifického k N-acetyl-D-gluikózamínu akyseli-ne -siálovej ku enzýmovému glykopro-teinu silného izoenzýmu alfa amylázy atým aj vysoká účinnost in-terakcie, nízké vý-robně náklady a skuto-čnosť, že alfa amylá-za sorbovaná na povrchu nosiča :s koválent-ne viaz-a-ným lektínom .uvedeného typu jestabilizovaná proti inaktivačným vplyvomhydroláz mikroorganizmov, přítomných vdutině ústnej. Přikladl Čerstvý sekrét fudských slin (200 ml) sazriedi 20 ml acetonu a získaný roztok sacentrifuguje pri 2000 g po dobu 20 minút azískaný supernatant sa--adjustuje n-a pH 7pomocou 22-0 ml 0,02 mol. I“1 fosfátovýmpufrom a přidá sa po kvapkách (30 ml zaminutu) 330 ml acetonu vychla-deného nateplotu —10 °C. Vytvořená suspenzia sa cen-trifuguje při 2 000 g po dobu 20 minut a zís-kaný supernatant obsahujúci -alfa amyláz-o-vú aktivitu sa přidá k 40 ml gélu napučanejperlovej celulózy, aktivova-nej pomocou 2--chlórmetyloxiránu -na oxirán celulózy (su-šina 1-3%; stupeň substitúcie celulózy oxi-rámu 0,42 mmol.g"1) s kóvalentne navia-zaným lektínom, specifickým k N-acetyl-D--glulkózamínu a kyselině si-alovej (připra-vený z Triticum vulgarisj o koncentrácii40 -mg . g1_ celulózy. Enzým alfa e-myláza saviaže -na imobilizovaný lektí-n ipo do-bu 1hodiny za miešania pri teplote 20 °C, perlo-vá celulóza s kóvalentne viazaným lektí-nom a -afinttne vi-azan-ou alfa amylázou saoddělí dakantáciou a premyje 500 ml 0,2mol. Γ1 fosfátového ús-tojného roztoku opH 7 a přečištěný enzýmový glykoproteí-nslinnej alfa amylázy sa uvolní 400 ml 0,02mol. I-1 N-acetyl-D-glukózamínu v 0,01 m-oíl. . 1_1 fosfátovom ústojnom roztoku o pH 7.Celková aktivita alfa amylázy 1 mkat o špe-cifickej aktivitě 0,25 pkat, mg"1 -a stuipniprečistenia 14,1. Příklad 2The present invention solves these shortcomings, which is that fresh secretions of human saliva or biological fluids containing salivary alpha amylase isoenzyme are diluted by one tenth of the volume of acetone and the resulting solution centrifuged at 2,000 to 3,000 gpo 10-20 min, the supernatant is adjusted to pH 7 and the resulting concentration of acetone in solution at 40-50 ° C is added dropwise with acetone cooled to -10 to -20 ° C. The volume of the obtained suspension is centrifuged at 2000 to 30-00 g for 10 to 20 minutes, and then the recovered alpha amylation-containing supernatant is purified by affinity using N-acetyl-D-glucose-α-mine and acid-affinity to the surface of the bead cellulose, and subsequently the enzyme alpha amylase is liberated from the complex with lectin effect of 0.02 to 0.1 mol. 11 µl of N-acetyl-D-glucose-mine solution, or 2 to 5% by weight of glycogen in 0.0 µl to 0.05 mol. I ' 1 phosphate solution and pH up to 7.2 and a volume of 5-10 times higher than the swelling of the used affinity. The advantage of the proposed coupling is the high affinity of the co-bound lectin, specific to N-acetyl-D-glucosamine and alkyl-silane to the enzyme glycoprotein of the strong alpha amylase isoenzyme, and the high efficacy of the inactivity, low In addition, the cost and the fact that alpha amylase is sorbed on the surface of the support: with a covalently bonded lectin of the type described herein is stabilized against the inactivating effects of the hydrolases of the microorganisms present in the oral cavity. EXAMPLE 1 Fresh secretion of human saliva (200 ml) is diluted with 20 ml of acetone and the resulting solution is centrifuged at 2000 g for 20 minutes and the recovered supernatant is adjusted to pH 7 with 22-0 ml of 0.02 mol. The phosphate buffer was added dropwise and 330 ml of acetone, cooled to -10 ° C, was added dropwise (30 ml). The resulting suspension is centrifuged at 2000 g for 20 minutes, and the supernatant containing -alpha-amylase-o-activity is added to 40 ml of swollen cellulose gel activated with 2-chloromethyloxirane-cellulose oxirane ( dry matter 1-3%; degree of substitution of the oxi-frame cellulose 0.42 mmol.g "1) with a co-bound N-acetyl-D-glulcosamine specific acid-specific lectin (prepared from 40 mg / ml cellulose Triticum vulgarisj Immobilized lectin alpha-mylase enzyme for 1 hour with agitation at 20 ° C, pearl cellulose with co-bound lectin-α-tartrate the azan alfa amylase is separated by dacantation and washed with 500 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer solution of opH7 and the purified enzyme glycoprotein-alpha-alpha amylase is released with 400 ml of 0.02 mol / l N-acetyl-D-glucosamine in 0.01 µmol / l phosphate buffer solution pH 7. Total activity a 1α amylase 1 cattle at a specific activity of 0.25 pkat, mg -1, and staple purification of 14.1. Example 2
Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz--dielom, že roztok enzýmu zriedený desa-tinou objemu acetonu sa centrifuguje pri3 000 g po dobu 10 minút, adjustovaný su-pernataňt 0,02 mol. I-1 fosfátovým tlmivýmroztokom na pH 7 sa upravuje s 226 acetó-nuvyichl-adeného na teplotu —20 °C po kvap-kách, získaná suspenzia sa centrifuguje pri3 000 g po dobu 10 minút. K afinitnému pre-čisteniu sa použil obdobný typ lektínu imo-The procedure is as in Example 1, except that the enzyme solution diluted with 10% acetone is centrifuged at 3000 g for 10 minutes, adjusted to 0.02 moles. The pH of 7-phosphate buffer solution I-1 is adjusted dropwise with 226 acetone buffered to -20 ° C, and the resulting suspension is centrifuged at 3000 g for 10 minutes. For affinity pre-purification, a similar type of imin