CS239826B1 - Sposob přípravy slinného izoenzýmu alfa amylázy - Google Patents

Description

239826

Vynález sa týlka spós-obu přípravy slin-riého izoenzýmu alfa amylázy.

Popři chromolytických metodách na gé-locli z molekulových sít a ionexov, medzi•techniky separácie a izolácie enzýmov pat-ří metoda afinitnej chromatografie. E. Star-kenstein a O. Holmbergh k izolácii alfa a-mylázy z biologického- materiálu použili n-a-tívny škrob [Έ. Stadkenstein, O. Holmbergh:Biochem. Z. 24, 21-0 (1910); O. Holmbergh:Biochem. Z. 25-8, 134 (1933)]. Natívny škrobako afinant obecného typu bol ďalej použitýaj k izolácii alfa amylázy z Clostridium ace-to-butilicum [D. J. D. Hockenhull, D. Her-bert: Biochem. J. 39, 102 (1945) ] a alfa a-mylázy iz ja-čmeňa [S. Schwimmer, A. K.Balls: J. Biol. Chem. 179, 1063 (1949)]. Ako-afinitný ligand bol použitý a) glyko-gén, via-zaný kovalentnou vazbou na povrch modifi-kovaného dextránu [R. Tkachuk: FEBS Lett.52, ©6 (1975)]. Natív-ny škrobový substrát soh-1'adom na -nehomogenitu partikul a ne-vhodné .hydrodynamické vlastnosti nemá vy-hovujúice vlastnosti ani afinitný ligand a-mylolytických enzýmov [R, M. Sandsted, S.Ueda: Japan Soc. Starch. Sci. 17 215 (1969)].Tento- postup ani použitie dalších afinantovna báze modifikovaných alfa-glukáncv ne-zabezpečoval ochranu amylázového glyko-proteinu slinnej izoamylázy pre-d účink-ombak-teriálnych hydroláz nachádzajúcich -sav dutině ústnej [Μ. P. Silvanovich, R. D.Hill: Anal. Biochem. 73, 430 (1976)]. Opti-málný postup neza-bezpečuje -ani použitieproteinového i-nhibítora alfa amylázy izolo-vaného z frakcie albumínov pšeničných zrna viazaného.-na modifikovaný dextrán kova-lentnou vazbou. Uplatňujú sa totiž vysokénešpeicificlké sorpcie nosné] matrice vočisprievodným proteinom a nízká účinnostafinitného liganda viazaného n-a povrch ma-trice bez pacera, na čo poukazujú výsledkys alfa amylázou slepačieho pankreasu, fu-d-ských stín a alfa -amylázou larvy Tenebriomoli-tor [V. Bu-onocore, E. Poerico, F. Gra-menzi. V. Síláno:. J. Chromatogr. 114, 109(1975)].

Uvedené nedostatky rieši tento vynález,ktorého podstatou je, že čerstvý sekrét l'ud-ských slin, ale-bo biologických tekutin ob-sahujúci slinný izoenzým alfa amylázy -sazriedi desatinou objemu acetóno-m a získanýroztok sa centrifuguje pri 2 000 až 3 000 gpo dobu 10 až 20 rninú-t, supernatant sa ad-justuje na pH 7 a pomocou acetonu vychla-deného na teplotu —10 až —-20 °C sa upravípo kvapíkách výsledná kon-centrácia aceto-nu v roztoku -na 40 až 50 θ/o objemových -azískaná suspenzia sa centrifuguje pri 2000až 30-00 g po dobu 10 až 20 minút, načo sazískaný supernatant obsahujúci alfa amy-lázu přečistí afinitnou metodou pomocoulektínu specifického k N-acetyl-D-glukóz-a--mínu a ku kyselině siálovej viaza-nej kova-lentnou vazbou, -na povrch perlovej celuló-zy a následovně sa uvolní enzým alfa amy-láza z komplexu s lektínom účinko-m 0,02 4 až 0,1 mol. 1_1 roztoku N-acetyl-D-glukóza-mínu, alebo 2 až 5 % hmotnostných glyko-gén u v 0,0il až 0,05 mol. I”1 fosfátovom ú-strojnom roztoku a pH až 7,2 a objeme 5 až10 násobné vyššom ako je napúčací objempoužitého afinantu. Výho-dou navrhovaného spós-obu je vyso-ká afinita kóvalentne viazaného lektínu,specifického k N-acetyl-D-gluikózamínu akyseli-ne -siálovej ku enzýmovému glykopro-teinu silného izoenzýmu alfa amylázy atým aj vysoká účinnost in-terakcie, nízké vý-robně náklady a skuto-čnosť, že alfa amylá-za sorbovaná na povrchu nosiča :s koválent-ne viaz-a-ným lektínom .uvedeného typu jestabilizovaná proti inaktivačným vplyvomhydroláz mikroorganizmov, přítomných vdutině ústnej. Přikladl Čerstvý sekrét fudských slin (200 ml) sazriedi 20 ml acetonu a získaný roztok sacentrifuguje pri 2000 g po dobu 20 minút azískaný supernatant sa--adjustuje n-a pH 7pomocou 22-0 ml 0,02 mol. I“1 fosfátovýmpufrom a přidá sa po kvapkách (30 ml zaminutu) 330 ml acetonu vychla-deného nateplotu —10 °C. Vytvořená suspenzia sa cen-trifuguje při 2 000 g po dobu 20 minut a zís-kaný supernatant obsahujúci -alfa amyláz-o-vú aktivitu sa přidá k 40 ml gélu napučanejperlovej celulózy, aktivova-nej pomocou 2--chlórmetyloxiránu -na oxirán celulózy (su-šina 1-3%; stupeň substitúcie celulózy oxi-rámu 0,42 mmol.g"1) s kóvalentne navia-zaným lektínom, specifickým k N-acetyl-D--glulkózamínu a kyselině si-alovej (připra-vený z Triticum vulgarisj o koncentrácii40 -mg . g1_ celulózy. Enzým alfa e-myláza saviaže -na imobilizovaný lektí-n ipo do-bu 1hodiny za miešania pri teplote 20 °C, perlo-vá celulóza s kóvalentne viazaným lektí-nom a -afinttne vi-azan-ou alfa amylázou saoddělí dakantáciou a premyje 500 ml 0,2mol. Γ1 fosfátového ús-tojného roztoku opH 7 a přečištěný enzýmový glykoproteí-nslinnej alfa amylázy sa uvolní 400 ml 0,02mol. I-1 N-acetyl-D-glukózamínu v 0,01 m-oíl. . 1_1 fosfátovom ústojnom roztoku o pH 7.Celková aktivita alfa amylázy 1 mkat o špe-cifickej aktivitě 0,25 pkat, mg"1 -a stuipniprečistenia 14,1. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým roz--dielom, že roztok enzýmu zriedený desa-tinou objemu acetonu sa centrifuguje pri3 000 g po dobu 10 minút, adjustovaný su-pernataňt 0,02 mol. I-1 fosfátovým tlmivýmroztokom na pH 7 sa upravuje s 226 acetó-nuvyichl-adeného na teplotu —20 °C po kvap-kách, získaná suspenzia sa centrifuguje pri3 000 g po dobu 10 minút. K afinitnému pre-čisteniu sa použil obdobný typ lektínu imo-

Claims (1)

1. 239826 5 bilizovaného za ro-vnakýeh podmienok akov příklade 1, izolovaný bol však zo zemiakov(Solárium). Vytesnenie enzymu alfa amylá-zy z komplexu s imobilizovanýim lektínomsa previedlo- 400 ml 0,05 mol. I-1 fosfátovýmústrojným roztokom o pH 7,2, 'obsahujúcom0,1 mol. k J N-acetyl-D-glukózamín. Výta-žek alfa amylázy a stupeň prečistenia boltaký alko je uvedené v příklade 1. P r í k 1 a d 3 Postupuje sa alko v příklade 1 s tým roz-dielom, že k vytesneniu enzýmu alfa amylá-zy z komplexu s lektínom sa použilo 200 mlroztoku 2 % hmotnostných glýkogénu (z ipe-čene zajacaj. Výťažok alfa amylázy bol 1,04mkat o špecifickej aktivitě 0,24 jukat.mg-1a stupni prečistenia rovnakom ako v příkla-de 1. Přikládá Postupuje se ako v přiklade 2 s tým roz- dielom, že ik vytesneniu enzymu alfa amy-lázy sa použije 200 ml rozteku 5 θ/o hmot-nostných glýkogénu (z kvasiniek Saccharo-myces cerevisiaej. Získala sa alfa amyláza*o celkovej aktivitě 1,08 mkat a sípecifičkejaktivitě 0,25 ,ukat. mg-1. Stupeň prečisteniabol 13,8. Výnález može nájsť široké uplatnenie vmedicíně a klinickej biochemii pri prípraveenzýmových štandardov glyfcozylovanýchalfa amyláz o vysokej čistotě, pre účely kon-troly správnosti a přesnosti metod použí-vaných v rutinnej analýze tělových tekutin,predovšetikým pri diferenciálnej biochemic-kej diagnostike poruch pankreasu a paro-tis. Slinný izoenzým -alfa amylázu možnoďalej použit v základnom biochemickom aenzymo-logickom výskume a pre přípravuvzácných oligosacharidOv maltózového typu. r R E D Μ E T Sposob přípravy stinného izoenzýmu alfaamylázy vyznačený tým, že čerstvý sekret1'udských slin, alebo biologických tekutinohs-ahujúci stinný izoenzým alfa amylázy sazriedl desatinou objemu acetónom a získa-ný roztok sa oentrifdguje pri 2 000 až 3 000gramov po dobu 10 až 20 minút, supernatantsa adjustuje na pH 7 a pomocou acetonuvychladeného na teplotu —10 až —20 °C saupraví po kvapkách výsledná koncentráciaacetonu v roztoku na 40 až 50 % objemo-vých a získaná suspenzia sa centrifugujepri 2 000 až 3 000 g po dobu 10 až 20 minút, VYNÁLEZU nač-ο sa získaný supernatant obsahujúci alfaamylázu přečistí afinitnou metodou pomo-cou lektínu specifického k N-a-cetyl-D-glu-kózamínu a ku kyse-line sialovej viazanejkov-alentnou vazlbou na povrch perlovej ce-lulózy a následovně sa uvolni enzým alfaz komplexu s lektínom účinkom 0,02 až 0,1mol. I-1 roztokom N-acetyl-D-gluikózamínu,alebo 2 až 5 % hmotnostných glýkogénu v0,01 až 0,05 mol. I-1 fosfátovom ús-tojnomroztoku a pH 7 až 7,2 a objeme 5 až 10 ná-sobné vyššom alko je n-apúčací objem použi-tého -afinantu.