CS239472B1

CS239472B1 - A method of removing chorionic gonadotropic hormone from solutions of human blood derivatives isolated from retroplacental or abortin sol

Info

Publication number: CS239472B1
Application number: CS842736A
Authority: CS
Inventors: Milos Pokorny; Stanislav Ulrych; Milan Holinka; Marta Kyselova; Nadezda Odehnalova
Original assignee: Milos Pokorny; Stanislav Ulrych; Milan Holinka; Marta Kyselova; Nadezda Odehnalova
Priority date: 1984-04-10
Filing date: 1984-04-10
Publication date: 1986-01-16
Also published as: CS273684A1

Abstract

Prakcionace a purifikace krevních derivátů pro terapeutické a profylaktické úěely, které jsou připravovány z placentárního nebo abortního séra. Jedná se o způsob odstranění lidského choriogonádotropního hormonu z roztoků lidských krevních derivátů, zejména z roztoků imunoglobulinu a sérového albuminu. Tento hormon je nežádoucí biologicky aktivní příměsí uvedených preparátů. Podstatou vynálezu je oddělení choriogonádotropního hormonu, případně dalěích nežádoucích biologicky aktivních látek, z roztoku bílkovin úpravou pH na hodnotu, při které dochází k uvolnění komplexu bílkovina - hormon a následnou sorbcí na předem vhodně upravený sorbentProcessing and purification of blood derivatives for therapeutic and prophylactic purposes, which are prepared from placental or abortion serum. This is a method of removing human choriogonadotropin hormone from solutions of human blood derivatives, especially from solutions of immunoglobulin and serum albumin. This hormone is an undesirable biologically active admixture of the above preparations. The essence of the invention is the separation of choriogonadotropin hormone, or other undesirable biologically active substances, from a protein solution by adjusting the pH to a value at which the protein-hormone complex is released and subsequent sorption onto a previously suitably prepared sorbent

Description

(54) Způsob odstranění choriogonádotropního hormonu z roztoků lidských krevních derivátů izolovaných z retroplacentárního nebo abortnfho sóra(54) A method for removing choriogonadotropic hormone from solutions of human blood derivatives isolated from retroplacental or abortive sera

Prakcionace a purifikace krevních derivátů pro terapeutické a profylaktické úěely, které jsou připravovány z placentárního nebo abortního séra.Preparation and purification of blood derivatives for therapeutic and prophylactic purposes, which are prepared from placental or abortive serum.

Jedná se o způsob odstranění lidského choriogonádotropního hormonu z roztoků lidských krevních derivátů, zejména z roztoků imunoglobulinu a sérového albuminu. Tento hormon je nežádoucí biologicky aktivní příměsí uvedených preparátů.It is a method of removing human chorionic gonadotropic hormone from solutions of human blood derivatives, in particular from solutions of immunoglobulin and serum albumin. This hormone is an undesirable biologically active ingredient of said preparations.

Podstatou vynálezu je oddělení choriogonádotropního hormonu, případně dalěích nežádoucích biologicky aktivních látek, z roztoku bílkovin úpravou pH na hodnotu, při které dochází k uvolnění komplexu bílkovina - hormon a následnou sorbcí na předem vhodně upravený sorbent.The subject of the invention is the separation of the choriogonadotropic hormone or other undesirable biologically active substances from the protein solution by adjusting the pH to a value which releases the protein-hormone complex and subsequent sorption to a pre-treated sorbent.

Vynález řeší způsob odstranšní lidského choriogonádotropního hormonu /HCG/ z roztoků lidských krevních derivátů, zejména z roztoků imunoglobulinu a sérového albuminu, které byly izolovány z retroplacentárního a abortního séra.The invention provides a method of removing human chorionic gonadotropic hormone (HCG) from solutions of human blood derivatives, in particular from solutions of immunoglobulin and serum albumin, which have been isolated from retroplacental and abortive serum.

Dosud vyráběné injekění roztoky lidských imunoglobulinů Norga a infúzní roztoky lidského sérového albuminu, které byly izolovány z retroplacentárního nebo abortního séra, obsahují podstatné množství HCO jako nežádoucí biologicky aktivní přimést. Na tuto skutečnost již upozornila Ninakova (ŽltEI 3,66 /1979), která porovnávala obsah HCO v preparátech imunoglobulinů izolovaných z dárcovské plazmy a z výše uvedených druhů surovin. V této práci také upozornila na důvody, proě je přítomnost hormonu v preparátech imunoglobulinů nežádoucí. Zejména se to týká případů opakovaná aplikace těchto roztoků dětem. Roztok 16* hmotnostních imunoglobulinu Norga získaný z retroplacentárního séra obsahuje 10⁴až 6.10⁴ J/1 HCO. Naopak roztok připravený z dárcovská plazmy obsahuje pouze 10 až 20 J/1 tohoto hormonu. Zvýšený obsah je způsoben tím, že hladina hormonu v krvi žen během těhotenství se výrazně zvyšuje a HCO se během frakcionace koncentruje v bílkovinných frakcích. Například Infúzní 20* hmotnostních roztok albuminu, který byl Izolován z retroplacentárního nebo z abortního séra metodou podle AO 194957, obsahuje 1 000 až 5 000 J/1, naopak albumin získaný z dárcovské plazmy obsahuje HCO o dva řády méně. Lidský choriogonádotropní hormon je glykoprcteinový hormon, produkovaný placentou a obsažený v krevní plazmě. Z těla těhotných žen je vylučován močí, z níž jej lze izolovat v čistá formě. Jeho molekulární hmotnost je 40 000 daltonů. Obsahuje okolo 30 * cukerná složky. Hormon má nápadně nízký izoelektrický bod 2,95 pH. /0. Hanč. Z. Pédr: Hormony, Academia Praha 1982 str. 163 až 175/. HCO lze nesnadno, jak už bylo naznačeno, oddělit z roztoků plazmatických bílkovin, protože se váže na jejich molekulu. To platí například pro metodu frakcionace krevních bílkovin etanolem za chladu, frakcionaci síranem amonným, polyetylénglykolem, chromatografii na iontoměničích a gelové filtrace.To date, injections of Norga human immunoglobulin solutions and human serum albumin infusion solutions that have been isolated from retroplacental or abortive serum contain substantial amounts of HCO as undesirable biologically active inducers. This has already been pointed out by Ninakova (Yellow EI 3.66 / 1979), which compared the HCO content of immunoglobulin preparations isolated from donor plasma and the above-mentioned types of raw materials. She also pointed out the reasons why the presence of hormone in immunoglobulin preparations is undesirable. In particular, this applies to cases of repeated administration of these solutions to children. A 16% by weight Norga immunoglobulin solution obtained from retroplacental serum contains 10 ⁴ to 6.10 ⁴ J / L HCO. Conversely, a solution prepared from donor plasma contains only 10 to 20 J / l of this hormone. The increased content is due to the fact that the hormone level in the blood of women during pregnancy increases significantly and HCO concentrates in protein fractions during fractionation. For example, a 20% by weight albumin infusion solution that has been isolated from retroplacental or abortive serum by the method of AO 194957 contains 1,000-5,000 J / l, while albumin obtained from donor plasma contains HCO two orders of magnitude less. Human chorionic gonadotropic hormone is a glycoprotein hormone produced by the placenta and contained in blood plasma. It is excreted in the urine of pregnant women, from which it can be isolated in pure form. Its molecular weight is 40,000 daltons. It contains about 30% sugar ingredients. The hormone has a remarkably low isoelectric point of 2.95 pH. / 0. Hanč. Z. Pédr: Hormones, Academia Praha 1982 pp. 163-175 /. As already indicated, HCO is difficult to separate from plasma protein solutions because it binds to their molecule. This is true, for example, of the cold ethanol fractionation method, ammonium sulfate fractionation, polyethylene glycol fractionation, ion exchange chromatography and gel filtration.

Také využití sorbce na některé nespecifické sorbenty, jako je například hydroxid hlinitý, fosforečnan vápenatý, nepřináší žádoucí účinek. Některé postupy, vhodné pro izolaci HCO z moči, jsou neupotřebitelné pro oddělení hormonu z roztoků krevních derivátů, bu3 že negativně ovlivňují kvalitu konečného preparátu, nebo jsou z hlediska technologie nevhodná. Týká se to například afinitní chromatografie na Con A Sepharose, sorbce na materiály, které by mohly třeba jen stopově uvolňovat toxické látky, či postupů, u nichž by v důsledku užití extrémních podmínek docházelo k denaturaci plazmatických bílkovin.Also, the use of sorption on some non-specific sorbents, such as aluminum hydroxide, calcium phosphate, does not produce the desired effect. Some procedures suitable for the isolation of HCO from urine are unsuitable for separating the hormone from blood derivative solutions, either because they adversely affect the quality of the final preparation or are unsuitable from a technology point of view. This includes, for example, affinity chromatography on Con A Sepharose, sorption on materials that might even trace toxic substances, or processes that would result in denaturation of plasma proteins due to the use of extreme conditions.

Výěe uvedená problémy spojené s odstraněním HCO z krevních derivátů, zejména imunoglobulinu, případně lidského sérového albuminu, které byly izolovány ze surovin obsahujících zvýšené množství hormonu, se řeší podle vynálezu tím, že se v některá fázi jejich izolace upraví pH roztoku bílkovin na hodnotu 3,0 až 5,3, s výhodou na 4,7, přidá se aktivní uhlí nebo jiný sorběnl materiál, nejlépe předem upravený například varem s roztokem kyseliny chlorovodíkové, octové nebo vodou. Vzniklá suspenze se ponechá v kontaktu za občasného míchání při teplotě 0 °C až 30 °C, s výhodou po dobu 15 až 180 minut a po následná filtraci, kterou se oddělí sorbění materiál, se roztok bílkovin, zbavený podstatného množství HCO a dalších nežádoucích biologicky aktivních látek, po úpravě pH na výhodnou hodnotu, například 5,5 až 6,5, dále zpracuje některým ze známých postupů.The above problems associated with the removal of HCO from blood derivatives, in particular immunoglobulin or human serum albumin, which have been isolated from raw materials containing an increased amount of hormone, are solved according to the invention by adjusting the pH of the protein solution to 3 at some stage. Activated carbon or other sorbent material, preferably pretreated, for example by boiling with a solution of hydrochloric acid, acetic acid or water, is added to 0 to 5.3, preferably to 4.7. The resulting suspension is contacted with occasional stirring at a temperature of 0 ° C to 30 ° C, preferably for 15 to 180 minutes, and after subsequent filtration to separate the sorbent material, the protein solution is free of substantial amounts of HCO and other undesirable biologically The active substances, after adjusting the pH to a preferred value, for example 5.5 to 6.5, are further processed by one of the known methods.

Hlavní výhodou navrženého způsobu je podtatné snížení přítomnosti HCO v konečných roztocích lidských imunoglobulinů, albuminu, případná dalších roztoků krevních derivátů, získaných z retroplacentárních nebo abortních výchozích materiálů, jednoduchým technologicky nenáročným způsobem. Ztráty vzniklé při navrhovaném způsobu jsou nízké a jejich úroveň je závislá na promytí sorbčníto· materiálu, případně na vhodném zařazení postupů do procesu frakcionace. Postup neovlivňuje negativně z žádného známého hlediska kvalitu konečného produktu. Zařazením způsobu oddělení HCO je současně dosaženo oddělení dalších nežádoucích biologicky aktivních látek, například části ^krevního barviva, mastných kyselin apod. Antikomplementérní aktivita imunoglobulinů se při použití postupu s aktivním uhlím snižuje průměrně o 50 až 40 *. Způsob podstatně neovlivňuje u roztoků imunoglobulinů titr protilátek.The main advantage of the proposed method is a substantial reduction in the presence of HCO in the final solutions of human immunoglobulins, albumin, and possibly other blood derivative solutions obtained from retroplacental or abortive starting materials, in a simple, technologically undemanding manner. The losses resulting from the proposed process are low and their level is dependent on the washing of the sorbent material or the appropriate inclusion of the processes in the fractionation process. The process does not adversely affect the quality of the end product from any known aspect. The inclusion of a HCO separation method also achieves the separation of other undesirable biologically active substances, for example, a portion of the blood dye, fatty acids, and the like. The method does not substantially affect antibody titer in immunoglobulin solutions.

Postup lze v případě potřeby opakovat nebo výhodně kombinovat s jinými purifikaěními postupy. Způsob oddělení HCG z roztoků plazmatických bílkovin lze zařadit do různých fází frakcionaěního postupu a v různém frakcionačním kroku.The process may be repeated if necessary or preferably combined with other purification processes. The method of separating HCG from plasma protein solutions can be incorporated into different phases of the fractionation process and in a different fractionation step.

Pokud jsou dodrženy věechny ostatní předepsané podmínky pro přípravu injekčních roztoků v celém procesu výroby, preparáty zbavené HCG navrhovaným způsobem vyhovují požadavkům ČSL3.If all other prescribed conditions for the preparation of injectable solutions are observed throughout the production process, the HCG-free formulations comply with the requirements of CSL3.

Příklady provedení:Examples:

1. Ke 100 ml 8% /hmotnostních/ roztoku imunoglobulinu obsahujícímu 15 000 J HCG/1, který vznikl po oddělení sraženiny po etanólové frakcionaci za chladu a chloroformové purifikaci, bylo přidáno 8 g předem upraveného aktivního uhlí. Tato úprava spočívala v tom, že aktivní uhlí se vařilo 30 minut s IN kyselinou chlorovodíkovou nebo IN kyselinou octovou. Uhlí bylo proqyto dekantací vodou. V suspenzi roztoku imunoglobulinu s aktivním uhlím bylo upraveno pH na 4,7 a suspenze byla ponechána v kontaktu za občasného promíchání1. To 100 ml of an 8% (w / w) immunoglobulin solution containing 15,000 J HCG / L formed after the precipitation of the ethanol after cold fractionation and chloroform purification was added 8 g of pretreated activated carbon. This treatment consisted in that the activated carbon was boiled for 30 minutes with 1N hydrochloric acid or 1N acetic acid. The coal was decanted by water decantation. In the suspension of the activated carbon immunoglobulin solution the pH was adjusted to 4.7 and the suspension was left in contact with occasional mixing

180 minut při 4 °C. Aktivní uhlí bylo odděleno filtrací přes dekalizační vrstvu a ve filtrátu bílkoviny bylo bezprostředně upraveno pH do neutrální oblasti 6,5. Roztok imunoglobulinu byl dále zpracován známým postupem.180 minutes at 4 ° C. Activated carbon was separated by filtration through a decalization layer and the pH of the protein filtrate was immediately adjusted to a neutral range of 6.5. The immunoglobulin solution was further processed according to a known method.

2. Injekční 16% /hmotnostních/ roztok imunoglobulinu, který obsahoval vysoké množství HCG, byl naředěn destilovanou vodou na 5% /hmotnostních/ roztok bílkoviny. K roztoku bylo přidáno předem upravené aktivní uhlí podle příkladu 1, v množství odpovídajícím 5 g suchého uhlí na 1 g bílkoviny. V suspenzi bylo upraveno pH na hodnotu 5,3 a za míchání bylo ponecháno ,5 minut při laboratorní teplotě. Aktivní uhli bylo odděleno filtraci přes dekalizační vrstvu a ve filtrátu bylo upraveno pH na požadovanou hodnotu 6,0. Roztok imunoglobulinu byl dále zpracován známým způsobem.2. An injectable 16% (w / w) immunoglobulin solution containing a high amount of HCG was diluted to 5% (w / w) protein solution with distilled water. Pre-treated activated carbon according to Example 1 was added to the solution in an amount corresponding to 5 g dry carbon per 1 g protein. The suspension was adjusted to pH 5.3 and allowed to stir at room temperature for 5 minutes. The activated carbon was separated by filtration through a decalization layer and the pH was adjusted to the desired value of 6.0 in the filtrate. The immunoglobulin solution was further processed in a known manner.

3. Sloupcem o celkovém objemu 10 ml předem upraveného aktivního uhli podle příkladu 1 zvolna protékal roztok 10 ml imunoglobulinu o koncentrací 1% /hmotnostních/ bílkovin mající pH 4,7. U proteklého roztoku bylo bezprostředně upraveno pH na požadovanou hodnotu podle příkladu 1 a dále byl roztok bílkoviny známým způsobem zpracován.3. A 10 ml total pre-treated activated carbon column of Example 1 was slowly flowed through a solution of 10 ml of 1% (w / w) immunoglobulin having a pH of 4.7. The flowing solution was immediately adjusted to the desired pH value according to Example 1 and further treated with the protein solution in a known manner.

4. K 10% /hmotnostních/ roztoku sérového albuminu, který obsahoval vysoké množství HCO, bylo přidáno aktivní uhlí v poměru 5 g suchého aktivního uhlí na 1 g bílkoviny a ponecháno v kontaktu za míchání 480 minut při pH roztoku 3,0. Aktivní uhlí bylo odděleno filtrací podle příkladu 1 a u roztoku bílkoviny upraveno pH na hodnotu 5,5. Roztok byl dále zpracován známým postupem.4. To a 10% (w / w) serum albumin solution containing a high amount of HCO, activated carbon was added at a rate of 5 g dry activated carbon per g protein and allowed to stir for 480 minutes at pH 3.0 of the solution. The activated carbon was separated by filtration according to Example 1 and the pH of the protein solution was adjusted to 5.5. The solution was further worked up according to a known method.

5. 5% /hmotnostních/ roztok imunoglobulinu nebo sérového albuminu, který obsahoval vysoká množství HCG, byl rozmíchán s kaolinem předem upraveným varem ve vodném prostředí a dekantací nadbytečné vody. Hodnota pH suspenze byla upravena na 4,0. Po 180 minutách se kaolin oddělil filtrací a v roztoku bílkoviny bylo upraveno pH na hodnotu 6,0. Roztok bílkoviny byl dále zpracován známým způsobem.5. A 5% (w / w) immunoglobulin or serum albumin solution containing high levels of HCG was mixed with the kaolin pre-treated by boiling in an aqueous medium and decanting the excess water. The pH of the suspension was adjusted to 4.0. After 180 minutes, the kaolin was separated by filtration and the pH was adjusted to 6.0 in the protein solution. The protein solution was further processed in a known manner.

6. Z roztoku imunoglobulinu nebo sérového albuminu, který obsahoval vysoké množství HCG, byl oddělen hormon zčásti tím, Že k roztoku bílkoviny byl za podmínek uváděných v příkladech 1 až 5 přidán oxid křemičitý vhodný pro chromatografii v tenké vrstvě, který byl předem upraven varem ve vodném prostředí. Po oddělení oxidu křemičitého způsobem uvedeným v příkladech 1 až 5 a úpravě pH na 7,0 byl roztok bílkoviny dále zpracován známým způsobem.6. The hormone was separated from the immunoglobulin or serum albumin solution containing a high amount of HCG, in part by adding silica suitable for thin-layer chromatography, which had been pre-treated by boiling in a thin-layer chromatography, under the conditions given in Examples 1 to 5. aquatic environment. After separation of the silica as described in Examples 1-5 and adjusting the pH to 7.0, the protein solution was further processed in a known manner.

V uvedených příkladech bylo dosaženo oddělení choriogonádotropního hormonu pod stanovitelná množství pomocí metody R1A nebo ELISA, nebo jeho množství v roztoku bílkoviny bylo podstatně sníženo na 1 až 10 % z výchozího množství.In the examples, separation of the choriogonadotropic hormone below determinable amounts was achieved by the R1A or ELISA method, or its amount in the protein solution was substantially reduced to 1-10% of the starting amount.

Obecný princip navrženého způsobu oddělení choriogonádotropního hormonu z roztoků bílkovin je založen na úpravě pH na hodnotu, při které dochází k uvolnění komplexu bílkovina-hormon 3 následnou sorbcí na vhodná upravený sorbent.The general principle of the proposed method of separating choriogonadotropic hormone from protein solutions is based on adjusting the pH to a value where the protein-hormone 3 complex is released by subsequent sorption to a suitable treated sorbent.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method of removing human chorionic gonadotropic hormone from solutions of human blood derivatives isolated from retroplacental or abortive serum containing high amounts of this hormone by sorbent thereof, characterized in that at some stage of isolation of said blood derivatives the pH of the protein solution is adjusted to 3.0-5 3, preferably 4.7, a sorbent, preferably activated carbon pretreated with, for example, boiling with hydrochloric acid or acetic acid, is added, the resulting suspension is contacted with stirring at 0 ° C to 30 ° C and the sorbent material is filtered off.