CS234589B1 - Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-753 - Google Patents

Abstract

Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM F-753 (Cu P-2) produkujícího ve zvýšené míře penicilín V, penicilín G a 6-aminopenicilánovou kyselinu (6-APK). Předností tohoto kmene je značná odolnost na mechanické namáhání při míchání ve fermentační nádobě.

Description

-1- 234 589

Vynález se týká kmene mikroorganismu Penicillium chrysoge-num CCM F- (Cu P-2) produkujícího ve zvýšené míře penicilínV, penicilín G'a 6-aminopanicilánovou kyselinu (6-APK). Předno-stí tohoto kmene je značná odolnost na mechanické namáhání přimíchání ve fexmentační nádobě· Výroba penicilinu se realizuje ve výrobních fermentačníchtancích více než 30 let a její objem se neustále zvětšuje. Zvý-šení výroby souviáí s nároky na objem výroby polosyntetickýchpenicilinů odvozených od 6-aminopenicÍlánové kyseliny. Zvýšenívýroby může být realizováno rozšiřováním výrobních fermentačníchprovozů nebo zvyšováním výtěžnosti fermentačního přocesu. Druháalternativa, která nevyžaduje významné investiční náklady,'jeumožněna buď zlepšením fermentačních podmínek na základě dokona-lejšího řízení fermentačního procesu nebo zvýšením produkčníschopnosti kmenů používaných pro biosyntézu. Šlechtitelské li-nie kmenů pro biosyntézu penicilinu jsou dlouHodobě vedeny řa-dou zavedených postupů.

Kmen Penicillium chrysogenum CGM F- (Cu P-2) byl zí-skán z kmene Penicillium chrysogenum evid.čísla 2/170 řadou opa-kovaných mutagenních zásahů (nitrosometylmočovina, nitrosometyl-guanidin, UV-světlo, p-fluorófenylalanin) a následných pravidel-ně zařazovaných pasivních selekcí. Izoláty byly hodnoceny dlenásledujícího schématu: - 2 - izolované kolonie na Petriho misce i šikmý agar í vegetativní inokulum 1 vlastní fermentace. 234 88·

Izoláty byly hodnoceny ve dvou pokusech před lyofilizací(konzervací) a ve třech pokusech po lyofilizaci· Lyofilizovanékonzervy slouží k dlouhodobému uchovávání sporového materiálu aumožňují zachování vhodných růstových a produkčních vlastností· ,

Stanovení účinnosti penicilinu bylo prováděno automatizo-vaným systémem při použití hydroxamátové polarimetrické metody· Tímto hodnotícím systémem byl získán kmen, na který jeuplatňován patentový nárok·

Kmen Penicillium chrysogenum OCM P-jfX (Cu P-2) tvoří přimonospOrickém rozsevu na sporulační půdě typu'glyceřin-melasakolonie velikosti 7,5 až 10 mm během 10 až 12 dnů kultivace při25°0. Na okraji tvoří radiální vrásy, střed kolonie je proláklý,okraj kolonie je lemován bílou nesporulující zónou· Spory majíkulovitý až elipeoidní tvar obvyklých rozměrů,'při mikroskopic-kém sledování jsou bezbarvé· Kultura dobře sporuluje na různýchtypech sporulačních půd, na přírodních substrátech (proso, kuku-řice, ovesné kroupy tad·), zejména při obohacení přírodních sub-strátů zdrojem dusíku, nejlépe ve formě l%ního roztoku přípravkuPharmamedia· Barva vysporulované kultury je Šedozelená·

Kmen Penicillium chrysogenum OCM P- (Ou P-2) je dosta-tečně stabilní, a to jak při vegetativním pasážčvání (neztrácíprodukční schopnosti pasáží do 4«generace), tak při dlouhodobémuchovávání v lyofilizované formě· Příklad 1

Biosyntéza penicilinu V.

Vegetativní inokulum bylo připravováno submersně v 500 ml varných baňkách se 60 ml inokulační půdy, která obsahovala základ- ní živiny,"tj. zdroj uhlíku (nejlépe sacharóza), dusíku (kukuřič- ný extrakt v kombinaci s anořganickým zdrojem dusíku), a5sole· 234 589

Vegetativní inokulum bylo očkováno kličkou spor ze šikmého aga-ru a kultivováno na rotačním třepacím stroji 48 hodin·

Takto připraveným vegetativním inokulam byly očkovány fer-mentační baňky o obsahu 500 ml se 40 ml fermentační půdy. Zdro-jem uhlíku Byla laktóza á sojový olej v kombinaci a přidávanousacharozou, zdrojem uhlíku byla sojová mouka, případněPharma-media,'půda dále obsahovala fenoxyoctovou kyselinu, jako pre-kurzor postranního řetězce pro biosyntézu penicilinu V, křídu azdroj síry· Příprava vegetativního inokula i vlastní fermentace bylyprováděny na rotačních třepacích strojích při 230 obr./min., vý-střednost 25 mm při teplotě 25°C.

Produkční hodnocení izolátů bylo opakováno 2x až 3x, načežnejlepší izoláty byly lyofilizovány a po vyočkování opětně mini-málně 3x produkčně hodnoceny· Těmito fermentačními postupy jsou dosahovány produkce připoužití kmene Pěnicillium chrysogenum CCM P- (Cu P-2) naúrovni 20 áž 26 000 j. penicilinu V/ml podle použitého řermentačního média a fermentačního postupu· Příklad 2

Biosyntéza penicilinu G.

Permentace kmene Pěnicillium chrysogenum CCM P- (Cu P-2)pro bidsyntézu penicilinu G byly provedeny analogicky s póstupy'pro biosyntézu penicilinu V. Rozdíl spočíval pouze v tom, žepůda neobsahovala fenoxyoctovou kyselinu jako prekurzor postran-ního řetězce, ale sodnou sůl fenyloctové kyseliny, která vzhledemk vyšší toxicitě je dávkována v průběhu fermentace ve formě dra-žé nebo roztoku. Dosahované produkce v laboratorním měřítku sepohybovaly od 17 do 19 000 j.penicilinu G/ml. Příklad 3Biosyntěza 6-APK.

Permentační postup pro biosyntézu 6-APK je analogický po- stupu pédle příkladu v bode 1. Rozdíl je pouze v tom, že půda ne- obsahovala žádný prekurzor postranního řetězce, tj· neobsahová- - 4 - 234 589 la fenoxyoctovou ani fenyloctovou kyselinu. Získané produkcejsou na úrovni 13 až 15 0^0 j. 6-APK/ml.

Claims (1)

1. 5- 234 589 pS b Dlí Š I VYNALEZU . Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenumyproďukujícípenicílin V, G a β-aminopenicilánovou kyselinu. «