CS233687B1 - Způsob řízeni výroby penicilinů podle Teologických charakteristik fermentační půdy - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nového způsobu řízení výroby penicilinů podle Teologických charakteristik fermentační půdy. V prvé růstové fázi se zajišluje nelimitovaný růst mycelia až na úroveň odpovídající aerační kapacitě fermentoru (při dosažení zdánlivé viskozity půdy 0,1 až 0,3 Pa.s), načež se na počátku následující produkční fáze sníží dávkované množství zdroje uhlíku a energie tak, aby se postupně zastavil vzrůst zdánlivé visko- ' žity půdy. Ve zbývajícím průběhu produkční fáze se hodnota zdánlivé viskozity j udržuje v rozmezí 0,04 až 0,20 Pa.s. podle složeni fermentační půdy a aerační kapacity fermentoru. Způsob podle vynálezu umožňuje dlouhodobé vedení fermentace (více než 300 hodin) za udrženi vysoké produkce penicilinů až do konce.

Description

Vynález se týká způsobu řízení výroby penicilinů podle reologických. charakteristik fermentační půdy při aerobní kultivaci vysokoprodukčních mutant mikroorganismu Pěnici11ium ohrysogenum, za intenzivního míchání, v živné půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku, dusíku, a fosforu, minerální živné sole a prekurzory, za stálého kontinuálního nebo semikontinuálního dávkování živin a prekurzorů.

Při výzkumu a vývoji technologií biosyntézy penicilinů bylo nalezeno několik možností, podle kterých by se dal produkční proces, představující svou povahou jednorázovou přítokovanou fermentaoi, vhodně řídit, aby se dosáhlo vysokých výtěžků antibiotika. Jednou z prvních bylo dávkování substrátů /zdrojů uhlíku a dusíku, například sacharózy a čpavku/ podle hodnoty pH a obsahu sušiny /častěji sedimentu/ ve fermentační půdě /R.lUSguires, Developments in Industrial Miorobiology, 13, 128, 1972/. Ačkoliv je tento způsob kvalitativně závislý na složení fermentační půdy a na určité fázi fermentace, a zvláště ve druhé polovině fermentace vede k nepřesnostem a až k odklonu od optimálních podmínek jejího řízení, byl pro svou jednoduchost a rychlost často používán· Později byly studovány a zaváděny další způsoby vedení fermentace, používané zvláště v kombinaci s již uvedeným přístupem, například sledování koncentrace kysličníka uhličitého ve výstupním plynu z fermentoru /íoygin se sp·, Pharm*Ohem. 7, 10: 299» 1976/ a zejména hladiny rozpuštěného kyslíku ve fermentační půdě /Squires 1972, již citovánoj Oiona se sp·, Biotsohnol.Bioeng. 18, 493» 1976/· Tyto způsoby, které jsou provozně i aparaturné náročnější, dávají však lepší a přesnější pohled na průběh procesu, mají ovšem i některé nedostatky,

233 687 jak bude zmíněno dále· Souhrnně ee problematikou fermentací penicilinů, zabývají Quener a Swartz /Secondary Products of

Metaboliem, A.H.Bose, ed., 1979/.

Úkolem vynálezu bylo vypracování nového způsobu řízení fermentace dávkováním substrátů. Východiskem byla skutečnost, Že fermentační půda, s výjimkou prvých hodin procesu, představuje nenewtonskou kapalinu pseudoplastického charakteru· Míchání a přestup hmoty v nenewtonskýeh kapalinách jsou velice složité děje, jejichž studium je dosud v počátcích. Platí to zvláště pro biologické systémy} na prvním místě je nutno uvažovat kultivace vláknitých mikroorganismů, protože reologické parametry kultivační půdy se během jejich růstu mění, zvláště tehdy, obsahuje-li půda suspenzní složky, například mouku. Přesto jsou poměrně jednoduše dostupné některé údaje o reologiokém chování fermentace, jež jsou mj. velmi dobře využitelné k popisu a tedy i řízení průběhu fermentace. Jedná se o využití a o řízení změn zmíněných charakteristik vhodným způsobem* , Z hlediska morfologicko-reologického je nutno vzít v úva hu, že v průběhu fermentace je reologické chování fermentační půdy ovlivňováno několika faktory. Na prvém místě, již od počátku fermentace, je nutno jmenovat složky půdy, které mají suspenzní charakter. Jsou to především různě zpracované zdroje dusíku, jako arašídová, sojová a bavlníková mouka, v menší míře kukuřičný výluh. Další běžnou suspenzní složkou půdy je uhličitan vápenatý. V průběhu fermentačního procesu je dále celkové reólogické chování půdy ve stále vyšší míře ovlivňováno myceliem produkčního mikroorganismu. Během hlavní růstové fáze fermentace nastává rychlý růst a tvorba agregátů částic mouky a buněk kultury. Vlákna produkčního mikroorganismu jsou v této fázi dlouhá a intenzivně rozvětvená.

Z reologického hlediska je možno tento úsek fermentace charakterizovat prudkým nárůstem zdánlivé viskozity fermentační půdy. V dalším průběhu procesu dochází k rychlé utilizaci částic mouky, hlavní podíl výživy kultury se přenáší do dáv233 887 kovaných substrátů a rychlost růstu rychle klesá. Při dosavadním způsobu řízení fermentace růst kultury pokračoval, byť i sníženou rychlostí, koncentrace buněk dále vzrůstala a délka vláken, ae příliš neměnila· Z reologického hlediska se úroveň zdánlivé viskozity fermentační půdy nezměnila nebo jen mírně poklesla /v průmšru^3 až0j5 Pa.s·/. Za těchto okolností i případné snížení dávkování, především sacharozy /například podle hladiny rozpuštěného kyslíku v půdě/, již nebylo doprovázeno dostatečným efektem· Nízká úroveň míchání a přenosu hmoty /především kyslíku/ v půdách s ták vysokou viskozitou vedly zákonitě k limitaci produkčního procesu a biosyntéza penicilinu se po 100. hodině fermentace postupně zpomalovala a zastavila·

Podrobné studium reologického chování fermentace při dosavadním způsobu řízení biosyntézy penicilinu umožnilo postupný přechod k aktivnímu řízení- procesu podle reologiokých parametrů fermentační půdy a optimalizaci celého postupu· Průběh fermentace je sledován od počátku a dodržením optimálního průběhu křivky zdánlivé viskozity fermentační půdy . pomocí řízeného dávkování roztoků zdrojů uhlíku, dusíku, fosforu a prekurzorů je dosaženo morfologické a biosyntetioké stabilizace fermentace, vedoucí k významnému zvýšení výtěžků antibiotika a prodloužení celého procesu při současném dosažení optimální úrovně dalších parametrů procesu, jako je stupeň ředění, ekonomický koeficient atd· Výchozí množství zdroje uhlíku /například sacharozy/ je s počínajícím růstem rychle vyčerpáno a od 10· až 12· hodiny fermentace je tento zdroj dávkován v ryohle 38 zvyšujícím množství /například okolo 40· hodiny 0,7 ež 0,8 g/litr/h/ nebo přechodně vysokou rychlostí, která odpovídá nelimitovanému růstu /například ve 20. až 30· hodině 1,2 až 1,4 g/litr/h/, a následujícím přechodným snížením tohoto dávkování /asi na 1,0 g/litr/h/·

S dokončením fáze rychlého růstu kultury /ve 20» až 40» hodině/ vrcholí také křivka zdánlivé viskozity půdy hodnotami 1,0 až 3,0 Pa.s /podle .výchozího složení fermentační půdy/· V další fázi procesu je velmi důležité zvládnutí přecho233 887 du celkového metabolismu kultury na postupné řízení dávkováním jednotlivých substrátů· Mouka nebo podobný zdroj, popřípadě kukuřičný výluh, jsou rychle využívány a degradovány, vlákna kultury se zkracují a* se současným přechodem do fáze pomalého růstu se rychle snižuje i jejich větvení. Obsah uhličitanu vápenatého v půdě také rychle klesá a v 70. až 80. hodině fermentaoe již nebývá detekovatelný· Všeohny tyto jevy jsou výsledkem řízeného poklesu zdánlivé viskosity půdy při zachování intenzivní biosyntézy antibiotika· Po celou zmíněnou dobu se v závislosti na počátečním složení půdy zvyšuje dávkování jednotlivých substrátů postupně tak, aby současně docházelo k řízenému poklesu zdánlivé viskosity fermentační půdy nebo k zastavení jejího vzrůstu /hranice se řídí účinností míchacího systému fermentoru/·

Opět podle výchozího složení fermentační půdy /i když tento vliv na celkovou reologii fermentační půdy klesá/ i aerační kapacity fermentorů je optimální úroveň zdánlivé viskosity okolo 100, hodiny procesu Ojh až|2/0 Pa.s· V této době se dávkování sacharózy pohybuje již okolo 1,0 až 1,2 g/litr/h a Teologické parametry prooesu jsou ovlivňovány v převážné míře již pouze myoeliem produkčního mikroorganismu· Další řízení produkce penicilinů je možno charakterizovat takovým dávkováním jednotlivých substrátů, které vede k postupnému ustálení hodnoty zdánlivé viskozity fermentační půdy v rozmezí QJ&Q až 0^70 Pa.s·, přičemž dočasné přesáhnutí zmíněného rozmezí nemusí podle zkušeností významně ovlivnit produkční aktivitu kultury. U intenzivněji míchaných fermentorů je možno hranici zvýšit až na 1,2 0 Pa.s., popřípadě na mez dosaženou v závěru růstové fáze. Dávkování sacharózy se i nadále regulovaně zvyšuje na hodnoty okolo 1,1 až 1,3 g/litr/h ve 150. hodině a 1,2 až 1,4 g/litr/h ve 200· hodině fermeataoe· Heologioké parametry fermentační půdy jsou mírou morfologie i koncentrace mycelia produkčního mikroorganismu* Praktic ký postup je jednoduchý» při poklesu zdánlivé viskozity k nalezené hranici se dávkování substrátů, především sacharózy, zvýší o 2 až 10 a naopak·

233 887

- ί

Také dávkování zdrojů dusíku./popřípadě fosforu a síry/, převážně amonných iontů, je rozhodující· Je zahajováno v 10* až 20· hodině fermentace a postupně se mění tak, aby hladina amonných iontů v půdě neklesla pod 0,1 g/litr a nepřesáhla 0,4 g/litr. Po 100. hodině fermentaoe se spotřeba a dávkování snižují. Popsaným způsobem řízení fermentaoe, jak vyplývá z příkladů provedení, je produkční mikroorganismus udržován v trvale vysooe produkčním stavu po dobu více než 200 hodin.

Uvedené konkrétní hodnoty dávkování zdroje uhlíku nebo zdánlivé viskozity fermentační půdy jsou uvedeny pro schematický popis postupu řízení fermentace nebo její optimalizace· Množství dávkovaných substrátů i hranice hodnot zdánlivé viskozity se mění v závislosti na složení fermentační půdy /značný vliv má například kukuřičný výluh/ i na aerační kapacitě fěrmentorů* U tanků s vyšěí úrovní přenosu kyslíku je možno hranici viskozity zvýšit, aniž by nastávalo nebezpečí limitace tímto substrátem. Takto je potom dosaženo zlepšeného produkčního účinku, protože například zvýšením koncentrace buněk s přibližně stejnou specifickou produkční rychlostí se zvýší i výsledný efekt. V případě fermentací s nelimitovaným růstem na počátku se dosáhne rychlejšího vývoje kultury· Zde se reologioký způsob řízení uplatňuje v plné míře až ve druhé polovině procesu.

Na základě výše uvedených poznatků byl vypracován podle vynálezu způsob řízení výroby penicilinů podle reologických charakteristik fermentační půdy při aerobní kultivaci vysokoprodukčních mutant mikroorganismu Penicillium ohrysogenum, za intenzivního míchání, v živné půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku, dusíku a fosforu, minerální živné sole a prekurzory, za stálého kontinuálního nebo semikontinuálního dávkování živin a prekurzorů, za podmínek regulujících vliv mechanického namáhání vláken produkčního mikroorganismu v zóně míchadla a s ním související vliv morfologie producenta na průběh procesu, a udržujících nízkou ka'i

233 6S7 tabolickou represi produkce antibiotika substráty a dostatečnou hladinu rozpuštěného kyslíku v půdě po oelou dobu fermentaoe·

Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se v počáteční růstově fázi zajištuje nelimitovaný růst produkčního mikroorganismu až na úroveň odpovídající aerační kapacitě fermentoru při udržování hladiny zdroje uhlíku a energie v půdě, vyjádřené koncentrací redukujících látek, na hodnotách 0,3 až 10,0 g/litr, s výhodou 1,0 až 2,0 g/litr, odpovídajících dosažení hodnot zdánlivé viskozity půdy 1 až 3 Pa»s., na počátku následující produkční fáze se snižuje dávkované množství zdroje uhlíku a energie, vztažené na objemovou jednotku půdy ve fermentoru za 1 h, na 60 až 90 % množství dávkovaného v růstové fázi, za současné fyziologické a morfologické stabilizace produkčního procesu, projevující se reologicky postupným zastavením vzrůstu hodnoty zdánlivé viskozity půdy nebo jejím počínajícím poklesem, načež se ve zbývajícím průběhu produkční fáze dávkování zdroje uhlíku a energie postupně zvyšuje tak, aby se hodnota zdánlivé viskozity udržovala na výši dosažené v závěru růstové fáze nebo postupně stabilizovala na hodnotě 0^4- až(^z® v závis los ti na složení fermentační půdy a aerační kapacitě fermentoru, a dávkování zdroje uhlíku a energie dosahovalo 80 až 120 hodnoty dávkované v růstové fázi·

Využití řízení fermentace podle Teologických charakteristik fermentační půdy má ve srovnání s dosavadními přístupy několik významných předností, la prvém místě je nutno jmenovat rychlost /měření a výpočet trvají 5 až 10 minut/ a zcela objektivní přesnost. Slouží jako velice cenný indikátor růstu a morfologie kultury, zvláště v prvé polovině fermentace· Díky tomu, že tento způsob vede v podstatě k minimalizaci úrovně viskozity půdy, omezuje do značné míry dosavadní problémy spojené s mícháním a přenosem hmoty, především kyslíku /týká se to zejména druhé poloviny fermentace/·

V souvislosti s dlouhodobými fermentacemi se objevuje pro233 687 blém odolnosti myoelia produkčníclr mikroorganismů vůči mechanickému namáhání a ostatní způsoby vedení fermentace při postihnutí tohoto efektu bučí selhávají nebo jsou značná nepřesné· Způsob podle vynálezu již svou podstatou /jedná se především o druhou polovinu fermentace, kdy je reologie fermentační půdy téměř výhradně ovlivňována kvantitou a kvalitou myoelia/ tento problém do značné míry eliminuje· naopak, díky zmíněným charakteristikám je použitelný jako významné kriterium pro optimalizace produkčních technologií při převodu z laboratorního do poloprovozního a provozního měřítka i při srovnání rozdílných fermentorů a míchacích systémů /pro jednotlivé případy je to způsob nalezení optimálního profilu dávkování substrátů/. Způsob podle vynálezu může sloužit bučí přímo jako metoda optimálního řízení fermentace nebo jako prostředek k nalezení optimálního profilu dávkování jednotlivých substrátů·

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z příkladů provedení·

Bříklad 1

Jako produkční mikroorganismus byl použit kmen Penioillium chrysogenum lhom CCM 3?-713. Fermentace byla prováděna ve 250 litrových tancích. Vegetativní inokulum bylo připraveno submerzní kultivací kultury ve 100 litrovém předočkovaoím tanku /kultivační doba 36 hodin/ a 160 litrovém očkovacím tanku /kultivační doba rovněž 36 hodin/, na půdě obsahující všechny základní živiny, tj. zdroj uhlíku /sacharózu/, dusíku /kukuřičný výluh a síran amonný nebo bavlníkovou mouku/ a dalších prvků ve formě minerálních solí. Fermentační tank obsahoval půdu tohoto složenit bavlníková mouka 40 g/l, sacharóza 5 g/l, thiosí.ran sodný 8 g/l, uhličitan vápenatý 9 g/l, hydrogenfosforečnan draselný 0,5 g/l a kyselina fenoxyootová /prekurzor biosyntézy penicilinu V/ 6,65 g/l» Výchozí objem 150 litrů, po inokulaoi /10 % objemu/ 165 litrů, pH půdy bylo udržováno v rozmezí 6,0 až 7,0, tank byl vy233 887 baven dvěma Sestilopatkovými míohadly a počtem otáček 500/min » vzdušnění 150 reep· 180 l/min» » přetlak v tanku 0,05 MPa, fermentační teplota 25 °0· Průběh, fermentace byl řízen dávkováním roztoků sacharozy obsahujících 500 a 500 g/1, roztoku tzv· dusíkové směsí /95 g/l síranu amonné·· ho, 45g6 g/1 močoviny, 27,2 g/1 hydrogéhfosforečnanů draselného a 65 g/1 kyseliny íenoxy octové/» 5 % čpavku a kyseliny fenoxyoctové· Dávkování roztoků sacharozy a dusíkové směsi bylo zahájeno ve 12· hodině fermentace a bylo řízeno podle dosavadních kriterií vedení procesu, tzn· s udržováním kultury v aktivním produkčním stavu pomocí regulace růstu vhodným ředěním půdy /sediment/· Průběh fermentace charakterizují následující udajei

Hodiny fermentace	Obsah penicilinu V v půdě j/ml	Skonomioký koeficient £ mia/mír · h
50	4525	-
54	8870
78	12965	- ·
102	16150	0,068
126	19540	0,097
150	20950	0,097
174	24570	0,105
198	25480	0,100
210	25480	0,097
222	27070	0,097
254	28655	0,099

Koeficient £ zahrnuje též ztrátové*časy mezi jednotlivými fermentacemí /zde 15 h/ i ztráty při izolaci antibiotika po filtraci půdy /faktor 0,77/·

233 687

Iříklad 2

Fermentace byla prováděna za stejných podmínek jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že její průběh byl řízen Teologicky podle zásad uvedených v popise· K měření byl používán rotační viskozimetr Bheomat 30, měřicí systém A, smyková rychlost 59»9 resp. 81,4 s‘ · Vzorky byly měřeny okamžitě po homogenizaci /protřepávání/, spojené s oddělením vzduchu dispergovaného v půdě· Průběh je znázorněn v tabulce:

Hodiny fermentace	Obsah penicilinu V v půdě áAi	Ekonomický koeficient £ mia/m|^ · h	Zdánlivá viskozita půdy Pa · s
30	3000	MB	-
42	6140	-	0,182
54	8645	-	0,130
66	11370	-	0,085
78	13700	-	0,066
90	15700	0,092	0,044
102	20470	0,112	0,048
114	22290	0,114	0,032
126	24110	0,115	0,040
138	24340	0,111	0,036
150	26385	0,115	0,036
162	27300	0,116	0,038
174	28665	0,118	0,042
186	32070	0,125	0,042
198	31400	0,122	0,045
210	34110	0,128	0,046

Příklad 3

Fermentace byla řízena Teologicky za stejných podmínek jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že fermentační půda obsáhovala jako hlavní složky 30 g/1 bav lni kové mouky a 20 g/1 kukuřičného výluhu; průběh byl řízen dávkováním roztoku

233 887 obsahujícího 500 g/l sacharózy a růstové fáíae hýla gajxátšna nelimitovaným růstem kultury se zvýšeným' aávkDváů/m sacharózy, jak vyplývá z průběhu procesu.

Hodin fermen- tace	Dávkování sacharózy e/i/n	Obsah penicilinu V v půdě j/ml	Ekonomický koeficient £ mia/my · h	Zdánlivá viskozita půdy Pa · β
20	1,30		—	0,080
30	1,28/1,00	4085	-	0,115
42	0,99	8645	-	0,113
54	0,99/1,05	12055	-	0,088
60	1,05/1,10	-	-	0,088
66	1,09	16150	M	0,071
78	1,08/1,16	19110	-	0,060
90	1,15	21610	0,119	0,068
102	1,15/1,19	23890	0,121	0,058
108	1,19/1,23	-	-	0,067
114	1,22	25930	0,123	0,065
126	1,20/1,24	30000	0,133	0,058
138	1,24/1,26	33435	0,140	0,072
150	1,25	36165	0,144	0,068

233 687

Claims (1)

1. PŘEDMĚT V Υ'Η ί 1 Ε Z D

   Způsob řízení výroby penicilinů podle reologických charakteristik fermentační půdy při aerobní kultivaci vysokoprodukčních mutant mikroorganismu Penicillium chrysogenum za intenzivního míchání, v živné půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku, dusíku a fosforu, minerální živné sole a prekurzory, za stálého kontinuálního nebo semikontinuálního dávkování živin a prekurzorů, za podmínek regulujících vliv mechanického namáhání vláken produkčního mikroorganismu v zóně míchadla a s ním související vliv morfologie producenta na průběh procesu, a udržujících nízkou kataholickou represi produkce antibiotika substráty a dostatečnou hladinu rozpuštěného kyslíku v půdě po celou dobu fermentace^, vyznačující se tím, že se v počáteční růstové fázi zajišťuje nelimitovaný růst produkčního mikroorganismu až na úroveň odpovídající aerační kapacitě fermentoru při udržování hladiny zdroje uhlíku a energie v půdě, vyjádřené koncentrací redukujících látek, na hodnotách 0,3 až 10,0 g/litr, s výhodou 1,0 až 2,0 g/litr, odpovídajících dosažení hodnot zdánlivé viskozity půdy||l až(p Pa^s.^na počátku následující produkční fáze se snižuje dávkované množství zdroje uhlíku a energie, vztažené na objemovou jednotku půdy ve fermentoru za 1 h, na 60 až 90 % množství dávkovaného v růstové fázi, za současné fyziologické a morfologické stabilizace produkčního procesu, projevující se reologicky postupným zastavením vzrůstu hodnoty zdánlivé viskozity půdy nebo jejím počínajícím poklesem, načež se ve zbývájíoím průběhu produkční fáze dávkování zdroje uhlíku a energie postupně zvyšuje tak, aby se hodnota zdánlivé viskozity udržovala na výši dosažené v závěru růstpvé fáze nebo postupně stabilizovala na hodnotě Ο,Μ až Pa.s. v závislosti na složení fermentační půdy a aerační kapacitě fermentoru, a dávkování zdroje uhlíku a energie dosahovalo 80 až 120 # hodnoty dávkované v růstové fázi.