CS233600B1 - Způsob fotosyntetické produkce sacharidů, nespecificky značených stabilním izotopem uhlíku s vysokým stupněm obohacení - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu fotosyn4· %etické produkce sacharidů, nespecificky značených stabilním izotopem uhlíku a vysokým stupněm obohacení. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se ke kultivaci použije dceřiných buněk synchronní populace řas s obsahem 2 až 4 % hmot. sacharidů na počátku buněčného cyklu, přičemž výrobní kultivace na světle probíhá až do začátku replikace deoxyríbonukleové kyseliny, tj. po dobu 7 až 8 hodin při teplotě 28 až 29 °C, načež se zvýší kultivační teplota na 36 až 38 °C a kultivuje ae dále po dobu 7 až 8 hodin. Tím se přeruší syntéza nukleových kyselin a bílkovin a dosáhne se výhradní syntézy sacharidů.

Description

Vynález se týká způsobu fotosyntetické produkce sacharidů, nespecificky značených stabilním izotopem uhliku s vysokým stupněm obohaceni·

Vynález řeší způsob řízené intenzívní syntézy sacharidů, probíhající při fotosyntéze u populace chlorokokálních řas 13 vhodného typu, přičemž zdrojem uhliku je CO?· Je dosaženo vysoké výtěžnosti požadovaných sloučenin a vysokého stupně jejich obohaceni stabilním izotopem uhlíku.

Postupy přípravy různých organických sloučenin, značených

13 radioaktivním / C/ nebo stabilním izotopem uhliku / C/ pomoci autotrofních mikroorganismů, jsou popsány v řadě publikaci /Beán et al. 1953, Beán et Hassid 1955, Outtom et Dagliesh 1956, Ellner 1959, Liebster et al· 1961, Tovey et al. 1964, Karpov et al· 1969, Lehman et Wbber 1977, Kollman et al. 1978, 1979/· Některé postupy jsou patentově chráněny /např. US patent 2602047, britský patent 1342098, francouzský patent 7208482, německý patent 2212092, československá autorská osvědčení 197918 a 199446/_O

Převážná většina uváděných postupů se vyznačuje nízkou výtěžnosti vyráběných produktů nebo nízkou specifickou akti14 13 vitou /u C sloučenin/ nebo nízkým stupněm obohacení /u C sloučenin/· Většina popsaných způsobů výroby je náročná z hlediska výrobních operaci i vlastních výrobních nákladů.

Tyto nedostatky odstraňuje v převážné míře způsob fotosyntetické produkce sacharidů, nespecificky značených stabilnira izotopem uhlíku s vysokým stupněm obohaceni podle vynále2 233 600 zu, jehož podstata spočívá v tom/ že se ke kultivaci použije dceřiných buněk synchronní populace řas s obsahem 2 až 4 % hmotnjksacha ri dů na počátku buněčného cyklu, přičemž výrobní kultivace probíhá na světle po dobu 7 až 8 hodin růstu při teplotě 29 °C, načež se zvýši kultivační teplota na 36 až 38 °C a kultivuje se dále po dobu 7 až 8 hodin. Výrobní kultivace na světle probíhá za podmínek maximální specifické růstové rychlosti až do začátku replikace deoxyribonukleové kyseliny po 7. až 8. hodině světelné periody buněčného cyklu, kdy se zvýšením kultivační teploty na 36 až 38 °C přeruší syntéza nukleových kyselin a bílkovin a dosáhne se výhradní syntézy sacharidů. Syntéza probíhá v prostředí, kde výhradním zdrojem uhlíku je C.

Podmínkou zdárného průběhu výrobní kultivace je, aby kultura řas, se kterou výroba začíná, měla požadované vlastnosti.

PředkuItivace v atmosféře CO^ a vlastni výrobní kultivace se provádějí v kultivačním zařízeni, popsaném v autorském osvědčeni 197918.

Důležitou podmínkou úspěšného průběhu kultivace je použiti synchronní populace, tj. populace, ve které jsou všechny řasové buňky ve stejném stádiu životního cyklu. Synchronní kultura umožňuje jednak snížit množství sacharidů před vlastni výrobní kultivaci na minimum, což je jednou z podmínek dosaženi vyso13 kého obohaceni požadovaných sloučenin izotopem C, jednak provést zásah do metabolismu rostoucí populace buněk v okamžiku, který je pro dosaženi co nejvyšší výtěžnosti a izotopového obohaceni nejpři znivějši, jednak dosáhnout během řízeného výrobního cyklu podstatně vyšši růstové rychlosti populace a celkové produkce biomasy ve srovnáni s kulturou nesynchronni·

Výhody navrhovaného způsobu kultivace podle vynálezu spočívej i v:

- krátké době kultivace a jednoduchosti výrobních operaci;

- mimořádně vysoké výtěžnosti požadovaných sloučenin, neboť během řízené kultivace probíhá jejich výhradní syntéza;

- 3 233 600

- takovém zastoupeni atomů C v molekulách vyrobených sloučenin, odpovidajicim koncentraci tohoto izotopu v surovině, ze které se pro fotosyntézu získává·

Výroba sloučenin podle vynálezu je ekonomicky efektivní, nebol náklady na syntézu jednotkového množství produktu tvoři pouze 1 až 10 Z hodnoty výsledného produktu, vyjádřené ve svě tových cenách.

Přiklad

K výrobní kultivaci byla použita kultura chlorokokálnich řas vhodného typu, přechovávaná ve zkumavkách na agarových půdách, obohacených minerálním živným roztokem při teplotě o -2

C a ozářenosti 10 W.m FAR.- FAR znamená fotosynteticky účinné zářeni, měřené spektrálně neselektivnim čidlem, citlivým pouze v oblasti 400 až 720 nm. /Viz např. KUBÍN: Zdroje fotosynteticky účinného zářeni a metody jeho měřeni, Academia Praha 1973./

a) Připrata kultury a předvýrobní kultivace

Kultura se z agaru převede do tekutého živného roztoku následujícího složení: KN0₃ 2g.r\ MgS0₄. 7 H₂0 1 g_o{, KH₂P0

680 mg.l\ Ca/NOj/g . 4 HgO 10 mg.<~\ chelatonát železitosodný 18,4 rag.l”^ /obsah Fe⁺⁺⁺ 5,6 mg_ol”^/, H^BO^ 6,18 mg.l“ a stopové těžké kovy: Cu 0,635 mg.l“^, Mn 0,6 mg.l~\ Mo 0,96 -1 -1 mg.l , Co 0,59 mg.l · K úpravě pH na hodnotu 6,8 se přidává do živného roztoku potřebné množství KOH.

V uvedeném roztoku se kultura pěstuje po dobu 10 hodin při ozářenosti 130 W.m“^, teplotě 29 °C a takové koncentraci 12

C0₂ ve směsí se vzduchem, která odpovídá 2 X rozpuštěného C0₂ v suspenzi řas. Počáteční kultivační hustota řasové suspenze ^A75q ^s 0,050. = optická hustota, měřená pří vlnové délce 750 nm v 5 mm kyvetě na upraveném fotometru /SPECOL/. Znásobíme-li hodnotu optické hustoty koeficientem 0,50 /u dce řinných buněk synchronní populace/ nebo hodnotou 0,35 /u mateřských buněk/, získáme přibližnou hodnotu suché hmoty řas.

Po 10hodinové periodě ozáření se kultura na 18 hodin zatemni. V následujících cyklech se periody ozáření prodlužují a periody tmy zkracuji tak, že po 4 až 5 přípravných synchro233 600

- 4 nizačních cyklech dosahuji konečných hodnot 14 hodin ozářeni a 14 hodin tmy· Aby se středni ozářenost populace během světelné periody cyklu nezměnila, probihá kultivace na světle od druhého přípravného cyklu v průtokovém chemostatickém re- -1 žimu při zředovaci rychlosti 0 - 0,14 h · V ustálené, plně synchronní populaci se optická hustota předvýrobní kultury pohybuje v rozmetl *750 ⁼ 0,880 až 1,150·

Středni ozářenost populace /E Z se stanovuje z ozářenosti c povrchu kultivační nádoby ZE^Z a z množství FAR, které projde kultivovanou vrstvou suspenze /£*/:

E s /e. - E.Z ! InZE.ZE.Z· ZDOUCHA: Continuous Cultures Cit 1 t of Algae, Algal Assays in Eutrophication Monitoring,

Stuttgart 1978/,

Zředovaci rychlost 0 se rovná u ustálené průtokové kultury specifické růstové rychlosti, ^u· Ta se stanovuje nejčastěji z růstové křivky jednorázové kultury na základě doby zdvojeni populace, t^: /U = In 2/t^ /viz např· OOUCHA: Kandidátská disertace, Μβδ ČSAV Třeboň 1979/«

Během předkultivace a výrobní kultivace jsou sledovány následující údaje:

a· teplota suspenze b· pH suspenze c· optická hustota suspenze d· koncentrace CO?, rozpuštěného v suspenzi a v plynném okruhu aparatury

e. ozářenost povrchu kultivační nádoby a střední ozářenost populace

f. stupeň synchronnosti populace b| Výrobní kultivace

Hodinu před ukončením temné periody přípravného synchronního cyklu se výrobní kultivační válec naplní 850 ml anorganického živného roztoku, který se předtím zb&vi veškerého fyzikálně rozpuštěného C0?« Z plynného prostoru aparatury se vytěsni vzduch a nahradí se dusíkem, načež se tento uzavřený prostor částečně evakuuje Zcca 0,07 MPa/· Pot lnt se živný roztok ve válci nasytí ^^C0?, který vzniká ve vyvíječí přidá233 600

- 5 13 váním IN HCIO^ do suspenze Ba ^c03« Rovnovážný stav v živném roztoku rozpuštěného CO? s atmosférou obsahující 2 X CO? nastane asi po 30 minutách intenzivního probubláváni·

Po nasyceni se do kultivačního válce vpraví takové množství inokula dceřiných buněk řas, aby počáteční optická hustota suspenze, Αγ^θ, byla 0,350«, Potom po dobu 8 hodin probíhá růst za autotrofnich podmínek při teplotě 29 °C, kdy _zu ^s 0,18 h · Počáteční ozářenost kultivačního povrchu je

120 W.m, po Čtvrté hodině kultivace se ozářenost zvýši na

-2 -2 150 W.m a po osmé hodině na 180 W.m . Po osmi hodinách, kdy dosahuje optická hustota Α?₅θ hodnoty 1,600, se přeruší syntéza nukleovýeh kyselin a bílkovin zvýšením kultivační tep loty na 38 °C„ Při této teplotě, při které probihá výhradni syntéza sacharidů, se kultura pěstuje 8 hodin»

Po ukončeni kultivace se suspenze řas ochladl na 2 °C a při této teplotě se centrifuguje» Získaná řasová biomasa i supernatant jsou výchozí surovinou pro další zpracováni·

V následující Tabulce jsou množství škrobu a sacharozy 13 v jednotce objemu řasové suspenze a hodnoty obohacení C uhlíkem v průběhu výrobního kultivačního cyklu· Zdrojem uhlíku pro biosyntézu je buď 90 X ^^C0?|nebo 99 X ^C0?.

233 600

Tabulka

Množství sacharidů Izotopové obohaceni produktu X

Hodiny v jednotce objemu, kulti- _;ug . ml’¹ 90 X ¹³C02 99 X ¹³C02 va ce —™—··———————™·.™.

	škrob	sacharóza	škrob	sacharóza	škrob	sacharóza
0	2,9	3,4	0	0	0	0
2	29,2	5,9	81,6	35,0	88,6	40,2
4	61,3	9,2	86,0	56,2	94,8	63,0
6	104,1	11,5	87,5	62,8	96,3	69,7
8	156,8	15,3	88,5	69,5	97,2	76,5
10	258,8	90,5	89,0	86,5	98,1	95,2
12	370,1	136,1	89,3	87,6	98,2	96,3
14	473,5	156,5	89,4	87,8	98,3	96,8
16	551,2	162,4	89,5	87,9	98,4	96,9
	Průběh syntézy škrobu a	sacharózy	během synchronního	cyklu
výrobní kultivace, vyjádřený	množstvím	těchto sacharidů v	j ed-
notce	objemu je	uveden na obr	. 1.

Claims (1)

1. Způsob fotosyntetické produkce sacharidů, nespecificky značených stabilním izotopem uhlíku s vysokým stupněm obohacený vyznačující se tim, že se ke kultivaci použije dceřiných buněk synchronní populace řas s obsahem 2 až 4 X hmotněl sacharidů na počátku buněčného cyklu, přičemž výrobní kultivace probíhá na světle po dobu 7 až 8 hodin růstu při teplotě 29 °C, načež se zvýši kultivační teplota na 36 až 38 °C a kultivuje se dále po dobu 7 až 8 hodin.