CS233183B1

CS233183B1 - Determination of heparin biological activity

Info

Publication number: CS233183B1
Application number: CS697083A
Authority: CS
Inventors: Vaclav Stuzka; Jarmila Havlova; Jaroslav Dvorak; Vladimir Vavra
Original assignee: Vaclav Stuzka; Jarmila Havlova; Jaroslav Dvorak; Vladimir Vavra
Priority date: 1983-09-24
Filing date: 1983-09-24
Publication date: 1985-02-14

Abstract

Stanoveni biologické aktivity heparinu spočívá v tom, že se na roztok, suspenzi nebo gel obsahující heparin, působí vodným roztokem kationoidního barviva za vzniku metáchromatického produktu barviva a heparinu, jehož koncentrace, která je přímo úměrná biologické aktivitě heparinu, je přímo úměrná úbytku absorbance roztoku měřené v maximu monomerního absorpčního pásu použitého barviva. S výhodou lze použít Nilskou modř A a měření úbytku absorbance provádět v oblasti 636 nm.Determination of biological activity Heparin consists in being on solution, suspension or gel containing heparin, acts by aqueous solution cationic dye the formation of a methromatic product dyes and heparin, the which is directly proportional to biological heparin activity is directly proportional to absorbance loss solution measured at maximum monomeric absorbent strip of the dye used. Preferably, Nile can be used blue A and absorbance loss measurement performed at 636 nm.

Description

Heparin je mukopolysacharid, který se získává ze zvířecích plic nebo z hovězí střevní mukozy a v lékařství se používá jako antikoagulační látka. Jeho čistota je různá a kvalita preparátu se hodnotí hodnotou biologické aktivity. Je známo, že heparin zdržuje za přítomnosti thrombinu srážení citronanové plazmy a toto zdržení je úměrné účinnosti heparinu. Průběh srážecího orecesu se sleduje vizuálně nebo turbidimetricky. Tento postup stanovení je časově velmi náročný, nebol jeden pracovník je schopen za pracovní směnu provést stanovení biologické aktivity u 1 až 3 vzorků za pracovní směnu, přičemž stanovení provádějí paralelně dva pracovníci. Chyba stanovení dosahuje až 20 %.Heparin is a mucopolysaccharide that is obtained from animal lungs or bovine intestinal mucosa and is used in medicine as an anticoagulant. Its purity varies and the quality of the preparation is evaluated by the value of biological activity. Heparin is known to delay the precipitation of citrate plasma in the presence of thrombin, and this delay is proportional to the efficacy of heparin. The course of the precipitation oreces is monitored visually or turbidimetrically. This assay procedure is very time-consuming because one worker is able to perform a biological activity determination for 1 to 3 samples per work shift per shift, with two workers performing the assay in parallel. The determination error is up to 20%.

Stanovení biologické aktivity heparinu podle vynálezu spočívá v tom, že na roztok, suspenzi nebo gel obsahující heparin se působí vodným roztokem kationoidního barviva za vzniku metachromatického produktu barviva a heparinu, jehož koncentrace je přímo úměrná biologické aktivitě heparinu. Koncentrace tohoto metachrematického produktu je přímo úměrná úbytku absorbance roz toku měřené v monomerním absorpčním maximu použitého barviva.The determination of the biological activity of heparin according to the invention consists in treating the solution, suspension or gel containing heparin with an aqueous solution of a cationic dye to form a metachromatic dye-heparin product whose concentration is directly proportional to the biological activity of heparin. The concentration of this metachrematic product is directly proportional to the loss of flow absorbance measured at the monomeric absorption maximum of the dye used.

S výhodou se využívá reakce heparinu s Nilskou modří A a vzniklý metachromatický produkt se stanoví z úbytku absorbance v oblasti 636 nm.Preferably, the reaction of heparin with Nile Blue A is utilized and the resulting metachromatic product is determined from the absorbance loss at 636 nm.

Nová navrhovaná metoda stanovení biologické aktivity je vel mi jednoduchá a spočívá ve zhotovení kalibrační křivky z čs. heparinového standardu nebo z heparinu o známé biologické aktivitě Kalibrační křivka vyjadřuje pokles absorbance barviva v oblasti dlouhovlnného absorpčního pásu na zvyšující se biologické aktivitě heparinu. Biologickou aktivitu lze také vypočítat přímo z naměřené hodnoty absorbance při použití hodnot lineárních re2The new proposed method of determination of biological activity is very simple and consists in making a calibration curve from MS. Heparin standard or from heparin of known biological activity The calibration curve expresses a decrease in dye absorbance in the longwave absorption band region as the biological activity of heparin increases. Biological activity can also be calculated directly from the measured absorbance value using linear re2 values

233 183 gresních koeficientů. Přesnost stanovení novou metodou byla hodnocena G-kritériem /Cochranovo/ a bylo skfé'4fao, že metoda dává správné výsledky. Nová spektrofotometrická metoda stanovení biologické aktivity je velmi jednoduchá, stanovení provádí jeden pracovník, takže přináší Sasové úspory. Pro stanovení biologické aktivity novou metodou se používá přístroj, který dnes vlastní kontrolní laboratoře. Nová metoda umožňuje hodnocení více vzorků /za pracovní směnu 200 i více/, takže se hodí i pro rychlé hodnocení vyráběných produktů. Vlastní provedení stanovení biologické aktivity heparinu je zřejmé z následujícího příkladu.233 183 gres. The precision of the assay by the new method was evaluated by the G-criterion (Cochran) and it was found that the method gave correct results. The new spectrophotometric method for the determination of biological activity is very simple, the determination is carried out by one worker, thus bringing Saxony savings. For the determination of biological activity by the new method, the instrument, which is now owned by control laboratories, is used. The new method allows evaluation of multiple samples (200 or more per shift), so it is also suitable for quick evaluation of manufactured products. The actual determination of heparin biological activity is apparent from the following example.

PříkladExample

Do ódměrných nádobek na 25 ml je pipetováno 5,0 ml Nilské modře A o koncentraci 2,0.10“^ M a přibližně asi 1,0 až 5,0 ml _4Pipettes 5.0 ml of Nile Blue A at a concentration of 2.0 × 10 µM and about 1.0 to 5.0 ml are pipetted into 25 ml standard vials.

4,0.10 % roztok heparinu* Po doplnění ódměrných nádobek po značku destilovanou vodou je změřena absorbance při vlnové délce 636 nm v kyvetách s absorpční vrstvou 2,00 cm proti destilované vodě. Biologická aktivita vzorku je odečtena z grafu závislosti absorbance a biologické aktivity nebo je vypočtena s použitím hodnot lineárních regresních koeficientů pro heparinové preparáty.4.0.10% Heparin Solution * After adding dimensional vessels to the mark with distilled water, the absorbance at 636 nm is measured in cells with an absorbent layer of 2.00 cm against distilled water. The biological activity of the sample is subtracted from the absorbance / biological activity plot or is calculated using linear regression coefficient values for heparin preparations.

Claims

1. Determination of biological activity of heparin; characterized in that the heparin-containing solution, suspension or gel is treated

A good solution of a cationic dye to form a metachromatic dye-heparin product, the concentration of which is directly proportional to the biological activity of heparin, is directly proportional to the loss of absorbance of the solution measured to the maximum monomer absorption band of the dye used.

2. The method of claim 1, wherein the solution, suspension or gel containing heparin is treated with an aqueous solution of Nile Blue A and the loss of absorbance is revealed in the region of 636 nm.