CS232330B1

CS232330B1 - Substrát pro přípravu elučních pufrů

Info

Publication number: CS232330B1
Application number: CS831595A
Authority: CS
Inventors: Richard Pospisil; Eva Keprtova
Original assignee: Richard Pospisil; Eva Keprtova
Priority date: 1983-03-08
Filing date: 1983-03-08
Publication date: 1985-01-16
Also published as: CS159583A1

Abstract

Vynález se týká vodného roztoku základního koncentrátu pro přípravu elučních pufrů, použitelných pro stanovení volných aminokyselin ve fyziologických tekutinách, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 100,0 až 110,0 g kyseliny citrónové a 120,0 až 130 g hydroxidu lithného a popřípadě vodu.

Description

Vynález se týké substrátu pro přípravu elučních pufrů použitelných pro stanovení volných aminokyselin ve fyziologických tekutinách na automatických analyzátorech aminokyselin jednokolonovým nebo dvoukolonovým postupem.

Pro kvalitní a kvantitativní analýzu aminokyselin klasickou metodou sloupcové chromatografie se nejčastěji používají automatické analyzátory aminokyselin. Zkoumaný vzorek představuje směs aminokyselin, které jsou svými vlastnostmi navzájem podobné. Jejich rozdělení na jednotlivé složky je úkolem chromatografieké kolony. Kolona je trubice naplněná umělou pryskyřicí, ionexem. Vzorek je kolonou unášen elučním pufrem, přičemž jednotlivé aminokyseliny mají k ionexu různou afinitu, čímž jsou ve svém postupu brzděny, takže složky s nejmenší afinitou k ionexu vycházejí z kolony nejdříve.

Posloupnost, v níž jednotlivé složky aminokyseliny vycházejí z kolony je určena jednak vlastnostmi ionexu, teplotou kolony a složením elučních pufrů. Po rozdělení směsi aminokyselin na jednotlivé složky se provádí jejich detekce ninhydrinovým činidlem. Ninhydrin je činidlo, které selektivně vytváří s aminokyselinami charakteristické zbarvení. Proto se pufr vytékající z kolony kontinuálně směšuje s ninhydrinovým činidlem a v konstantních podmínkách probíhá barevná reakce. Barevný produkt se při určité vlnové délce kontinuálně měří ve fotometru a na zapisovači se zapisuje ve formě vrcholů.

Absorpce světla je přímo úměrná koncentraci dané látky v roztoku. Stanovení celého spektra aminokyselin na automatickém analyzátoru aminokyselin dvoukolonovou technikou se provádí na dlouhé koloně, kde se stanoví kyselé a neutrální aminokyseliny a to v cyklu Na⁺ nebo Li⁺. Bazické aminokyseliny se stanoví na střední koloně.

Nevýhodou tohoto dvoukolonového způsobu stanovení je především velké spotřeba vzorku, delší doba analýzy a větší spotřeba chemikálií pro přípravu elučních pufrů. Při stanovení spektra aminokyselin jednokolonovou technikou se celé spektrum aminokyselin stanoví na jedné koloně. Pro stanovení aminokyselin v hydrolyzátu se používá tří pufrů sodnocitrananových, zatímco pro stanovení 5 lithiocitronanových elučních pufrů.

Výše uvedené nedostatky odstraňuje substrát pro přípravu elučních pufrů pro analyzátory aminokyselin, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 100 až 110 g kyseliny citrónové a 120 až 130 g hydroxidu lithného, popřípadě též vodu. Dále obsahuje antioxidační činidlo, například thiodiglykol. Déle obsahuje sméčedlo, například polyhydroxiethylenlaurylether.

Dále obsahuje konzervační činidlo, například kyselinu kaprylovou.

Výhody vynálezu spočívají v tom, že se řeší jednotný eluční systém pro stanovení volných aminokyselin v přirozených materiálech. Tento systém je jednotný pro typy analyzátorů. Dosud každý analyzátor měl odlišnou přípravu elučních pufrů. Při práci s novým elučním systémem se dosahuje 50% úspory analyzovaného vzorku, což má velmi velký význam zejména ve zdravotnictví, poněvadž umožňuje analyzovat malý objem vzorku, který nemohl být analyzován původní metodou. Jednoduchá a snadná příprava substrátu elučního pufru, který může být dodáván i ve formě substancí. Další výhodou je univerzálnost při přípravě jednotlivých pufrů. Zavedením jednotného elučního systému je rovněž zvýšena analytické reprodukovatelnost a přesnost při srovnání analýz na obou typech analyzátorů, i na různých pracovištích.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady pH pufru 2,2-0,02 2,64*0,02 3,50*0,02 4,30*0,02

Základní koncentrát (ml) 100

100

400

Koncentrace citrátu (M)

0,05

0,20

pH pufru	2,2-0,02	2,64-0,02	3,50±0,02	4,30-0,02
Koncentrace Li⁴ (11)	0,15	0,15	0,15	0,60
Uethylcelloeolve (ml) (2-methoxyethanol)	-	45	-	-
Thiodiglykol (ml)	2	-	-	-
Kyselina kaprylová p.ai	0,2	0,2	0,2	0,2
Pólyhydroxyethy 1enlaury1ether (50 g rozpuštěno ve 150 ml deionizované vody (ml)	2	2	·
HC1 konc. p. a. (cca ml)	30	25	20	60
Konečný objem (1)	1	1	1	1

Pro ředění standardů a vzorků se používá pufr s pH 2,2. Příprava jednotlivých pufrů pod le vynálezu: Thiodiglykol ae přidává jako antioxidační činidlo, aby během chromatografie nedocházelo k oxidaci sirných aminokyselin. Polyhydroxyethylenlaurylether (Brij 35) se užívá jako smáčedlo. Kyselina kaprylová slouží jako konzervační prostředek.

Při přípravě pufrů se velmi pečlivě dbá na přesné nastavení hodnoty pH u jednotlivých pufrů k získání reprodukovatelných elučních časů. Kontrola pH se provede až po ustálení rovnováhy, tj. po 24 hodinách, a to vždy, je-li nutné pufry upravovat na žádané pH. Pro každou připravenou dávku pufru je nutné udělat na analyzátoru kalibrační test.

Protože chování aminokyselin při eluci je citlivá na pH, je možné podle polohy jednotlivých vrcholů na chromatogramu púfry velmi přesně nastavit. Pufr pH 2,2 používáme k ředění vzorků a standardních roztoků, ostatní pufry pH 2,64, 3,5 0 4,30 slouží k eluci aminokyselin., K regeneraci kolony se používá roztok 0,3 N hydroxidu lithného. Příprava ninhydrinového činidla se provádí podle postupu uvedeného k jednotlivým analyzátorům. Je vypracován nový jednotný eluční systém, tabulke ,, který umožňuje stanovení volných aminokyselin na analyzátorech stejným způsobem a stejnými elučními pufry.

Stanovení se provádí jednokolonovou technikou a nevyžaduje žádnou elektronickou úpravu analyzátorů. Pro přípravu elučních pufrů o různém pH a pufru pro ředění pH vzorků se využívá ředění substrátu základního koncentrátu elučuího pufru. K přípravě základního roztoku, rovněž tak ostatních elučních pufrů používáme upravenou vodu, například deionizovanou a převařenou. Voda nesmí obsahovat amoniak. Například v deionizované vodě rozpustíme 105,0 g kyseliny citrónové a 126,0 g hydroxidu lithného. Konečný objem roztoku je 1 000 ml. Tento koncentrát se pak přidává do složení lithiocitronanových elučních pufrů.

Analyzátory aminokyselin nacházejí využití v biochemických laboratořích základního výzkumu, ve výzkumu výživy lidí i zvířat, v potravinářském a krmivářském průmyslu, ve zdravotnictví jako v diagnostice dědičných metabolických poruch, zejména u dětí, tak ve farmacii a v řadě příbuzných vědeckých i průmyslových oborů.

Tabulka 1

Příklad použití pufrů při analýzách

Typ analyzátoru:	1.		2.
Typ lonexu	Ostion LGKS 0803		Ostion LGANB
Bozmšr kolony:	0,8 x 62,0 cm		0,37 x 45,0 cm
Výška lonexu v koloně:	57,0 cm		23,5 cm
Průtok pufru	70 ml.h’		15,0 ml.h’
Průtok ninhydrinu	35 ml.h^-1		10,0 ml.h¹
Teplota: T, ^T2	38 °C		38 °C
60 °C		60 °C
Pufr: P I	pH 2,64-0,02		pH 2,64-0,02
P XI	pH 3,50^0,02		ph 3,50-0,02
P III	ph 4,30±0,02		pH 4,30-0,02
Program: Změny pufru	0 až 194 min pufr. I (ze vrchol Ala)		0 až 56 min pufr I (na vrchol Glu)
	194 až 301 min pufr. (za vrchol Tyr)	II	56 až 131 min pufr. II (za vrchol Tyr)
	301 až 560 min pufr. (do Konce analýzy)	III	131 až 272 min. pufr. III (do konce analýzy)
Teplotní změny:	0 až 156 min T^ (za Pro)		0 až 56 min T,
		(na vrcholu Clu)
	156 až 560 min T₂(do konce analýzy)		56 až 272 min Tg (do konce analýzy)
Celková doba analýzy:	560 min		272 min
Doba. regenerace:	20 min		20 min
Doba stabilizace:	120 min		100 min

Poznámka: U obou analyzátorů je zapotřebí použít předkolon k odstraňování amoniaku z prvého pufru.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Substrát pro přípravu elučních pufrů pro analyzátory aminokyselin na bázi citrátu lithného, vyznačující se tím, še obsahuje 100 až 110 g kyseliny citrónové a 120 až 130 g hydroxidu lithného a popřípadě vodu.
2. Substrát podle bodu 1, vyznačující se tím·, že obsahuje antioxidační činidlo například thiodiglykol.
3. Substrát podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje smáčedlo, například polyjiydroxiethylenlaurylether.
4. Substrát podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tim, že obsahuje konzervační činidlo, například kyselinu kaprylovou.