CS231239B1 - Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy - Google Patents
Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CS231239B1 CS231239B1 CS828920A CS892082A CS231239B1 CS 231239 B1 CS231239 B1 CS 231239B1 CS 828920 A CS828920 A CS 828920A CS 892082 A CS892082 A CS 892082A CS 231239 B1 CS231239 B1 CS 231239B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- formula
- gel
- mol
- carriers
- enzyme
- Prior art date
Links
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 title claims description 12
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title claims description 11
- 238000003672 processing method Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- -1 6-carboxyhexyl Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims 1
- 150000001450 anions Chemical group 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 108020002202 Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000005234 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241001502122 Pyrrhocoris apterus Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical group 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000011240 wet gel Substances 0.000 description 2
- FVXHPCVBOXMRJP-UHFFFAOYSA-N 8-bromo-7h-purin-6-amine Chemical class NC1=NC=NC2=C1NC(Br)=N2 FVXHPCVBOXMRJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100020925 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N L-Homocysteine Natural products OC(=O)C(N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
(54) Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy
Předmětem vynálezu jsou afinitní nosiče na bázi dextranových gelů obecného vzorce I
R-NHCO/CHg/g-R' /1/, dále způsob jejich přípravy, spočívající v reakci omega-karboxyalkylderivétu makromolekulétního nosiče s 9-/RS/-[ 3/2/-/3-ami· nopropylemiho/-2/3/-hydroj(ypropyl] -8-hydroxyadeniny obecného vzorce IV kde R'je zbytek makromolekulárního dextranového gelu a R je zbytek vzorce II nebo III
NHj
/11/, N^-oh
Ν ch2ch-ch2nh(ch2)3imh2
OH /IV/,
2 kde R a R jsou střídavě hydroxy- a 3-aminopropyleminoskúpine, v přítomnosti rozpustného karbodiimidu.
Uvedené nosiče slouží zejména pro čištění a isolaci Š-adenosyl-U-homocysteinhydroláz z biologických extraktů.
ch2oh /111/,
Vynález se týká afinitních nosičů na bázi dextranových gelů a způsobu jejich přípravy.
Makromolekulární nosiče s kovalentně vázanými nízkomolekulátními sloučeninami /ligandy/ mají ěiroké uplatnění’ ve výzkumných laboratořích i v provozech pro zvýšení účinnosti izolaci, čiStění nebo naopak odstranění biokatalyzátorů /enzymů/ z přirozených zdrojů. Jejich použití je založeno na principech tzv. afinitní chromatografie, tj. specifických interakcích /vazbě/ přlsluSných enzymů s nizkomolekulétním zbytkem vázaným na pevném nosiči.
Tím se z roztoků odstraní ostatní /i bílkovinné/ složky, které se na ligand neváží a apecificky vázané bílkoviny se potom uvolní zvýšením iontové síly eluentu, zvýSenim teploty nebo elucí roztokem substrátu, produktu či inhibitoru příslušného enzymu. Pro úspěšné provedení takového čisticího postupu je rozhodující chemická struktura ligandu, který je obvykle analogem substrátu, produktu nebo inhibitoru příslušného enzymu.
V regulaci základních procesů metabolismu živé hmoty hrají důležitou úlohu enzymy S-adenosyl-L-homocysteinhydrolázy /dále SAH-hydrolaay/, které katalyzují hydrolýzu přirozeného metabolitu - S-adenosyl-L-homocysteinu - na adenosin a L-hmmocystein. Nedostatečná hladina tohoto enzymu v organismu může souviset se vznikem určitých vrozených metabolických onemocnění; z údajů literatury /např. E. N. Orlov, J. V. Bukin: Voprosy med. chim. 26. 699 (1980)/ vyplývá rovněž vztah mezi hladinou tohoto enzymu a růstem experimentálních nádorů pokusných zvířat. Proto nabývá na významu izolace, čištění a stanovení obsahu tohoto enzymu ve vzorcích biologického materiálu, s potenciálním využitím v klinické biochemii.
Izolace SAH-hydroláz byla dosud popsána pro enzymy z nejrůznějších zdrojů, jako telecích jater /Η. H. Richarde, Ρ. K. Chiang, G. L. Gantoni, J. Biol. Chem. 253. 4476 (1978)/, hovězích jater /Palrner J. L., Ábeles R. H.: J. Biol. Chem. 254. 1217 (1979)/, myších jater /Ρ. M. Ueland, J. Saeb: Bíochemistry 18, 4130 (1979)/, krysího mozku R, A. Schnta, C. R. Vunnam, O. Z. Sellinger: Tronsmethylation /Usdin E,, Borchardt E. T., Creveling C. Π., Eds/, str. 143; Elsevier, Hew Xork 1979/, intaktnich lymfócytů /1. P. Ziinmerman, G. Wolberg, G. S. Duncan, G. B. Elion: Bíochemistry 12, 2252 (1980)/ a semen lupinu /A. Guranowskl, J. Pewalkiewicz: Eur, J. Biochem. 80, 5'7 (1977)/, vesměs obvyklými způsoby čištění bílkovin, která zahrnují postupy jako frakční srážení, chro™ matografii na ionsxech a gelové filtrace. Tyto postupy jsou pracné, časově náročné a poskytují enzymové preparáty o nízkém celkovém výtěžku.
Byla popsáno i afinitní ’chromatografie SAli-hydrolázy z krysích jater na nosiči s vázaným 8-./3-aminopropylamino/-adenosinem /E. O. Kajander, A. M. Raina: Biochem. J. 193.
50.3 (1981)/. Tato metoda je nedostatečně účinná pro izolaci uvedeného enzymu ze surového extraktu.
Tuto nevýhodu odstraňuje vynález, jehož podstatou je nový typ afinitních nosičů na bázi dextranových gelů obecného vzorce I
R-NHCO/CH2/6-R /1/ kde R'je zbytek makromolekulátního dextranového gelu a R je zbytek vzorce II nebo III nh2
/11/,
23,239
Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy látek vzorce I, spočívající v tom, že se dextranový gel nesoucí omega-karboxyalkyl, s výhodou 6-karboxyhexyl, uvede do reakce s 9-/RS/-[3-/3-aminopropylamino/-2-hydroxypropyl]-8-hydroxyadeninem vzorce* IV
CH2CHCH2NH|CH2)3NH2
OH nebo 9-/RS/-[2-/3-aminopropylamino-3-hydroxypropylJ-8-hydroxyadeninem vzorce V
l ch2ch-nhich2)3nh2 ch2oh a/, v poměru 1 až 10 molárních ekvivalentů na počet karboxylových skupin dextranováho gelu a soli rozpustného karbodiimidu obecného vzorce VI r’/+/
R2-N-/CH2/nN=C=N-R4 X” /VI/,
12 kde n je 2 až 4, R až R jsou methylskupiny, nebo R a R spolu tvoří skupinu -GHgGHgOCHgCHg- a R^ je methyl- nebo ethylskupina, R4 je cyklohexyl- nebo ethylskupina a X je chloridový nebo p-toluensulfonanový aniont a to ve vodném roztoku při pH 5 až 6 a při teplotách 0 °C až 30 °C, po skončení reakce se nerozpustný materiál odsaje, promyje vodou a roztoky neutrálních pufrů.
Aktivní monomerní ligandy, které tvoří základní složku pro uvedenou afinitní chromatografii enzymů, jsou snadno dostupné z 9-/RS/-2,3-dihydroxypropyl/ derivátů 8-bromadeninu nebo 8-hydroxyadeninu (čs. autorské osvědčení č. 231 238). Jejich vazba na polymerní nosiče se provádí tvorbou amidové vazby z látek vzorce IV nebo .V na karboxylové funkce polymeru prostřednictvím reakce s rozpustnými karbodiimidy ve vodném slabě kyselém prostředí.
Polymerní matrice může být např. Sepharóza, Agaróza, celulóza. Lze použít i jiný polymerní materiál, který obsahuje karboxylové skupiny kovalentně vázané prostřednictvím dostatečně dostatečně dlouhých řetězců /s výhodou hexamethylsnových/. Takto získané polymerni materiály obecného vzorce 1 jsou stálé po dobu několika měsíců při teplotách 0 °C až +10 °C ve vodě nebo s výhodou v nasycených roztocích chloridu sodného nebo draselného. Stálost a jednoduchost jejioh přípravy dovoluje připravit potřebné objemy afinitnich nosičů bezprostředně před jejich použitím. Podle použitého molárního poměru ligandu IV nebo V vzhledem k počtu karboxylových skupin nosiče lze připravit látky vzorce I β různým množstvím navázaného ligandu.
Speciflcita takto připravených afinitních nosičů vzorce I vzhledem k SAH-hydrólázám je vysoká a umožňuje vysoké zatížení nosiče celkovou bílkovinou /až 100 mg/ml/. Inertní bílkoviny se snadno odstraní promytím roztoky inertních anorganických solí /chloridů, fosforečnanů, pudrovaných podle povahy enzymu, nejlépe za chlazení na teploty pod +10 °C. SAH-Hydrolázy se pak eluují roztoky adenosinu, jejichž koncentrace se mění v závislosti na druhu /zdroji/ enzymu.
Malý použitý objem nosiče tak dovoluje eluovat SAH-hydrolézy malými objemy elučního roztoku. Celý postup je možno stejně dobře provést na sloupci nosiče, jakož i v suspenzi s následující filtrací po každém elučním kroku. Adenosin se z eluátu enzymu snadno odstraní gelovou filtrací /např. na Sephedexu 0-25 nebo Biogalu/, přičemž se enzym eluuje jako první. Celý postup afinitního čištění SAH-hydroléz je časově nenáročný, což je zvléšl důležité vzhledem k omezené stálosti těchto enzymů. Tímto postupem je možná připravit SAH-hydrolázy prakticky homogenní podle kritérií elektroforézy v gelu, a to z různých /živočišných i rostlinných/ zdrojů.
V dalSím je příprava afinitních nosičů vzorce I i jejich použití pro čištěni SAH-hydroláz osvětleno na příkladech, aniž se tím jakkoliv omezuje.
Přikladl
Suspenze 1 g /cca 4 ml vlhkého gelu/ lyofilizované CH-Sepharézy 48 v 50 ml 0,5 mol.l”' iChloridu sodného se třepe 20 h při teplotě místnosti, odsaje, promyje 0,5 mol.l”' chloridem sodným /200 ml/ e vodou /200 ml/. Vlhký gel se suspenduje v 8 ml vody, krátce evakuuje při 2 kPa, přidá se 100 jumolů látky vzorce IV, pH se nastaví na 5,0 kyselinou chlorovodíkovou a přidá se 1,1 mmolů p-tolueneulfonátu 1-cyklohexyl-3-/3-trimethylamonlumpropyl/karbodiimidu a směs se míchá 30 min za stálého udržování hodnoty pH mol.l”' kyselinou chlorovodíkovou mezi 5,0 ež 5,5. Přidá se dalších 1,1 mmolů karbodiimidu, pH se upraví na 5,0, suspenze se míchá při teplotě místnosti 24 h. Pak se odsaje, promyje 0,5 mol.l”' chloridem sodným /500 ml/, 1 mol.l”' chloridem sodným /500 ml/ a získaný materiál se suspenduje v témže roztoku a uchovává při +4 °C.
Příklad 2
Reakce se provede s 1 g CH-Sepharózy 4B a 0,1 mmol látky vzorce V s p-toluensulfonanem 1-cyklohexyl-3-N-methylmorfolinium-methylkarboiimidu /2 x 1,1 mmol/. Bále se postupuje podle příkladu 1.
Bále jsou uvedeny příklady použití látek podle vynálezu.
SAH-Hydroléza z krysích jater
Částečně purifikovaná frakce SAH-hydrolázy z krysích jater, získaná podle popsaného postupu /1. Votruba, A. Holý: Collect. Czech. Chem. Commun. 45. 3039 (1980)/ /20 ml, 1,8 g bílkovin, spec. aktivita 0,3 I. U./mg proteinu/ /1. U. » mezinár. jednotka enzym, aktivity/ se nanese ne sloupec 3 x 0,8 cm nosiče podle příkladu 1 a sloupec ae postupně promývá při 4 °C /a 4 ml/: 0,2 mel.l“' SÓrensenův pufr - pH 7,4 obsahující 10”^ mol.l”' dithiothreitol, mol.l”' KC1, 1,5 mol-l‘' KC1, 2 mol.l”' KC1 /věechny s obsahem 10”·^ mol.l“' dithiothreitolu/. Enzymová aktivita ee eluuje roztokem 0,25 x 10“^ mol.l“' adenosinu v 0,75 mol.l”' KC1 a jímají se frakce objemu 2 ml. V těchto frakcích se stanoví aktivita SAH-hydrolasy dále uvedenou metodou. Frakce s aktivitou, která poskytuje více než 50% konverzi substrátu se spojí a okamžitě nanesou na sloupec , ,2 x 60 cm Sephadexu O-25H v 0,01 mol.l”' SÓreneenově pufru pH 7,4 s obsahem 10 mol.l”' dithiothreitolu a sloupec se eluuje tímtéž pufrem frakce 2 ml, rychlost eluce 18 ml/h. Eluční objem enzymu 39 ml, adenosinu 137 ml· Enzymová aktivita jednotlivých frakcí se stanoví déle uvedenou metodou, frakce s konverzí substrátu vyšší než 50% se spojí a stanoví v nich celkové enzymová aktivita a obsah proteinu. Získá se 0,425 mg proteinu o specifické aktivitě 0,615 I. U./mg, podle gelové elektroforézy je protein homogenní.
SAH-Hydroláza z krysích jater ml částečně čištěné frakce SAH-hydrolézy z krysích jater se míchá s 2 ml nosiče podle příkladu 2 20 min při 0 °C /v supemantantu je pak nulová enzymové aktivita/, filtruje se a nosič postupně suspenduje a odsává s promývacími roztoky stejně jako v předchozím případě. Poté se nelije na sloupec a eluuje 0,25 χ 10-ληο1.1-1 adenosinu v 0,75 mol.l.“1 KC1 a zpracuje déle podle předchozího postupu. Získá se 0,8 mg proteinu /homogenního podle gelové elektroforézy, specifická aktivita 0,60 I. U./mg.
f SAB-Hydroláze z hmyzích ovarií kusů overií třídenních samic Pyrrhocoris apterus se desintegruje ultrazvukem v /1.min, 22 kC, amplituda 7,5/ v 1 ml 0,01 mol.l-1 Sorensenově pufru pH 7,4 obsahujícím
1O“3 mol.l-1 dithiothreitol, odstředí se při 30 000 g /25 min, při 4 °C/, k supernatantu se přidá 60 yul 15% streptomycinsulfétu a znovu se odstředí při 26 000 g /20 min při 4 °C/. Extrakt se zředí výše uvedeným pufrem do 5 ml /35 mg proteinu spec. aktivita 0,13 I. U./mg a přidá se 2 ml nosiče podle příkladu 1. Další zpracování se provede podle předchozího postupu. Získá se 1,1 I. U. SAH-hydrolasy ovarií Pyrrhocoris apterus, homogenní podle gelové elektroforézy.
Stanovení SAH-hydrolázy
Inkubační směs sestává z 200 yul roztoku o koncentraci 0,1 mol.l-1 hydrogenfosforečnanu draselného pH 7,37, 3 x 10-^ mol.l mol.l 1 dithiothreitol, 3,75 x 10”^ mol.l-1 L-homocystein, 2,5 x 10“^ mol.l-1 adenosin s 2 50 (ul testovaného roztoku enzymu neředěného nebo vhodně ředěného 0,01 mol.l-1 Sorensenovým pufrem pH’7,4 s obsahem l0-^ mol.l-1 dithiothreitolu. Směs se inkubuje 10 min při 37 °C a vzorky 10 fil směsi se dělí na sloupci Separonu Sl C18 /5 put/ /3,3 x 150 mm/ elucí 0,0i mol.l-1 dihydrogenfosforečnanu draselného pH 2,8 obsahujícím 10 objemových procent methanolu.
Rychlost eluce 0,4 ml/min, detekce při 254 nm /citlivost 0,01 až 0,04 AUPS/. Průběh eluce se kontinuálně registruje na registračním UV-detektoru a planimetricky se stanoví obsah ploch píků adenosinu a vzniklého S-adenosyl-L-homocysteinu, jejichž poloha byla předem určena pomocí srovnávacích sloučenin. Počet mezinárodních jednotek enzymové aktivity /1 I. U. je množství enzymu, které konvertuje 1 /imol substrátu za 1 min/ v 50 μ! vzorku a enzymu se vypočte podle vztahu
I. U. = 0,5 x 1O-5K, t
kde K je konverse adenosinu na S-adenosyl-homocystein vyjádřená v procentech.
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (2)
1. Aflnitni nosiče na bázi dextranových gelů obecného vzorce I r-nhco/ch2/6-r' /1/.
kde R'je zbytek mekromolekulémího dextranového gelu a R je zbytek vzorce II nebo III
23,239
OH
I
CH2CH -CH2NH(CH2 )2CH2- /11/, ch2oh /111/,
2. Způsob přípravy afinitních nosičů obecného vzorce I podle bodu 1, vyznačený tím, že se dextrenový gel nesoucí omege-karboxyalkyl, s výhodou 6-karboxyhexyl, uvede do reakce s 9-/RS/- [3-aminopropylamino/-2-hydroxypropylJ-8-hydroxyadeninem vzorce IV
CH2CH-CH2NH(CH2)3NH2
OH nebo 9-/RS/-[2-/3-aminopropylamino/-3-hydroxypropyl]-8-hydroxyadeninem vzorce V
CH2CH-NH(CH2)3NH2 ch2oh /V/, v poměru 1 až 10 solí rozpustného molémích ekvivalentů na počet karboxylových skupin dextranového kerbodlimidu obecného vzorce VI
R1 gelu, a y+/
RyN-/CH2/nN=C=N-R4 &
AI/, kde n je 2-4, R1 až R^ jsou methylskupiny, nebo R1 a R2 tvoří spolu skupinu -CHgCfígOCHgCHga r3 je methyl- nebo ethylskupina, R4 je cyklohexyl- nebo ethylskupina a X je aniont chloridový nebo p-toluenaolfonanový, a to ve vodném roztoku při pH 5 a 6 a při teplotách 0 °C až 30 °C, načež po skončení reakce se nerozpustný materiál odsaje, promyje vodou a roztoky neutrálních pufrů.
Severografia, n. p„ MOS
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS828920A CS231239B1 (cs) | 1982-12-09 | 1982-12-09 | Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS828920A CS231239B1 (cs) | 1982-12-09 | 1982-12-09 | Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS892082A1 CS892082A1 (en) | 1984-01-16 |
| CS231239B1 true CS231239B1 (cs) | 1984-10-15 |
Family
ID=5440434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS828920A CS231239B1 (cs) | 1982-12-09 | 1982-12-09 | Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS231239B1 (cs) |
-
1982
- 1982-12-09 CS CS828920A patent/CS231239B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS892082A1 (en) | 1984-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Johnson et al. | Early nuclear events in the induction of lymphocyte proliferation by mitogens: Effects of concanavalin A on the phosphorylation and distribution of non-histone chromatin proteins | |
| O'Connor et al. | Phosphorylation of intermediate filament proteins by cAMP-dependent protein kinases | |
| Casnellie et al. | Phosphorylation of synthetic peptides by a tyrosine protein kinase from the particulate fraction of a lymphoma cell line. | |
| Pattison et al. | Relation of zinc ion to the structure and function of the 7S nerve growth factor protein | |
| CS200196B2 (en) | Method of creatincynasis-mb efficieny determination | |
| Siekevitz et al. | Cytochemical study on the pancreas of the guinea pig: VII. Effects of spermine on ribosomes | |
| Weber et al. | Adenosine‐3′: 5′‐Monophosphate‐Binding Proteins from Bovine Kidney: Isolation by Affinity Chromatography and Limited Proteolysis of the Regulatory Subunit of Protein Kinase II | |
| Kaplowitz et al. | Nuclear phosphoproteins: III. Increase in phosphorylation during histone-phosphoprotein interaction | |
| Ayling et al. | Participation of covalently linked fatty acryl coenzyme A products in the action of yeast fatty acid synthetase | |
| Ikeda et al. | Phosphylation and protein kinase activity of platelet tubulin. | |
| Smith et al. | Mammalian fatty acid synthetase is a structurally and functionally symmetrical dimer | |
| Gould et al. | Involvement of sulfhydryl groups in the activity of anti-A hemagglutinins of Phaseolus lunatus | |
| CS231239B1 (cs) | Afinitní nosiče na bázi dextranových gelů a způsob jejich přípravy | |
| KR100963031B1 (ko) | 포름알데히드 오염 검출을 위한 마커 및 키트 | |
| Urushizaki et al. | Phosphorylation of hydroxylysine residues in collagen synthesized by cultured aortic smooth muscle cells. | |
| Chen | Alkaline phosphatase | |
| Eger et al. | The preparation and use of pyridoxal [32P] phosphate as a labeling reagent for proteins on the outer surface of membranes | |
| JPH0438392B2 (cs) | ||
| Stellwagen et al. | The influence of culture conditions on the induction of tyrosine aminotransferase by cyclic nucleotides in rat hepatoma cells | |
| Siekevitz et al. | A cytochemical study on the pancreas of the guinea pig | |
| Wikman-Coffelt et al. | Comparison of antigenic properties of ribosomal proteins from Novikoff hepatoma and normal liver | |
| Speth et al. | The purification of a detergent‐soluble glucose‐6‐phosphatase from rat liver | |
| Wolfson | Location of alpha-2-globulin by demonstration of alkaline phosphatase during paper electrophoresis | |
| Dixon et al. | Immobilized lactate dehydrogenases | |
| Sawai et al. | Change of nuclear ribonuclease H activity following deoxyribonucleic acid synthesis in liver of protein-deficient rat |