CS230943B1

CS230943B1 - Method of oligosacheride separating by liquid chromatography

Info

Publication number: CS230943B1
Application number: CS832629A
Authority: CS
Inventors: Pertr Vratny; Jiri Coupek; Stanislav Vozka
Original assignee: Pertr Vratny; Jiri Coupek; Stanislav Vozka
Priority date: 1982-10-22
Filing date: 1982-10-22
Publication date: 1984-08-13
Also published as: CS262983A1

Abstract

Způsob dělení oligosacharidů kapalinovou cjiromatografií, vyznačující se tím, že se směs oligosacharidů, která je urěena k dělení, zavádí na vrchol sloupce silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až22,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 nr/g, středním objemem pórů 10 až 20 nm, který obsahuje koválentně váženou alkaníckou stacionární fázi s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních s alkylem obsahujícím 12 až 24 atomů uhlíku s methylovenými zbytkovými silanolovými skupinami, přičemž se.sloupec eluuje vodou při teplotě 20 až 80 C. Způsobu podle vynálezu se používá k dělení oligosacharidů v analytičkám i preparativním měřítku a uplatněním v biotechnologii, zemědělství a v potravinářstvíiMethod of liquid oligosaccharide separation by radiography, characterized in that a mixture of oligosaccharides that is designed for dividing, introducing a silica gel column having a pore volume of 1.0 to 22.0 ml / g, surface area 350 to 500 m / g, medium a pore volume of 10 to 20 nm contained therein metal-weighted alkali stationary a phase with a carbon content of at least 20% by weight with an alkyl containing 12 to 24 carbon atoms with methylated residuals silanol groups, with a column eluted with water at 20 to 80 ° C. The method of the invention is used to divide oligosaccharides in analytes and preparative scale and application in biotechnology, agriculture and food

Description

Vynález se týká způsobu dělení oligosacharidů kapalinovou chromatografii podle molekulové hmotnosti isokratickou elucí ve vodě.The invention relates to a method for separating oligosaccharides by liquid chromatography by molecular weight by isocratic elution in water.

Dělení, oligosacharidů podle jejich molekulové hmotnosti (stupně polymerlzace monosecharidových jednotek) v enzymatických nebo kyselých hydrolyzátech přírodních polysacharidů je velmi důležité v biotechnologii, v zemědělství a v potravinářském průmyslu.The division of oligosaccharides according to their molecular weight (degree of polymerization of monosecharide units) in enzymatic or acid hydrolysates of natural polysaccharides is very important in biotechnology, agriculture and the food industry.

Teoreticky se zdá být nejvhodnější pro dělení oligomerů sacharidů metoda gelová permeační chromatografie. Dělení se provádí zásadně za zvýšené teploty, jako elučního činidla se používá voda, avšak metoda je poněkud zdlouhavá a k úplnému rozdělení je zapotřebí několika hodin. Zrychlení eluce a zvýšení účinnosti dělení je velmi obtížné s ohledem ne malou tlakovou odolnost používaných homogenně sílovaných botnajíclch gelů jako jsou trojrozměrná polysacheridová nebo akrylamidové kopolyméry.Theoretically the gel permeation chromatography method seems to be the most suitable for separation of carbohydrate oligomers. Separation is generally carried out at elevated temperature, water is used as the eluent, but the method is somewhat lengthy and requires a few hours for complete separation. Acceleration of elution and increase in separation efficiency is very difficult due to the low pressure resistance of homogeneously cross-linked swelling gels such as three-dimensional polysaccharide or acrylamide copolymers.

Rigidní celkově porésní materiály nacházejí v gelová chromatografii uplatnění jen pro dělení vysloveně vysokomolekulárnich sloučenin. Určitou nevýhodou metody pro preparativnl účely je i poměrně nízká záitěžová kapacita používaných gelově chromatografických materiálů.Rigid, generally porous materials find use in gel chromatography only for the separation of explicitly high molecular weight compounds. A certain disadvantage of the method for preparative purposes is the relatively low load capacity of the used gel-chromatography materials.

Velmi běžná je metoda dělení saoharidů na iontoměničich. Způsob je velmi selektivní a hodí se zvláště pro rozlišení sacharidů podle rozdílů ve struktuře a v konfiguraci.A very common method is the separation of saoharides on ion exchangers. The method is very selective and is particularly suitable for distinguishing carbohydrates according to differences in structure and configuration.

Při použití katexů v Ca⁺⁺ a Ag⁺ formě s vodnou mobilní fází je na závadu vysoká botnavost iontoměničů, nízká tlaková e mechanická odolnost nosičů a v neposlední míře i vymývání iontů ze struktury gelu projevující se v úbytku kapacity s časem. 'When using cation exchangers in Ca ⁺⁺ and Ag ⁺ form with an aqueous mobile phase, the high swelling of ion exchangers, low pressure and mechanical resistance of the carriers and last but not least also the elution of ions from the gel structure manifested in a loss of capacity with time are impaired. '

Při chromatografických procesech založených na interakcích se silikagelem (aminofáze) je možno pracovat se směsnou mobilní fází (nejčastěji acetonitril-voda), v níž může být dělení oligosecharidů s vyšší molekulovou hmotnostní komplikováno sníženou rozpustností složek. V poslední době bylo dosaženo dělení oligosecharidů na speciální koloně v módu obrácené fáze; nevýhodou této metody je věak rozlišení alfa- a beta- anomerů, které separaci zbytečně komplikuje.In chromatographic processes based on interactions with silica gel (aminophase), it is possible to work with a mixed mobile phase (most often acetonitrile-water), in which the separation of higher molecular weight oligosecharides can be complicated by the reduced solubility of the components. Recently, separation of oligosecharides on a special column in reverse phase mode has been achieved; the disadvantage of this method is that it distinguishes between alpha and beta anomers, which unnecessarily complicates the separation.

Pokusy s posunem rovnováhy mezi anomery pomocí chemických činidel byly s výjimkou redukce neúspěšné. Citlivost známého postupu je příliš nízké pro stanovení oligomerů glukózy v maltosové sérii s DP vyšším než 6, při dělení cellodextrinů je metoda poměrně časově náročná (pro DP 4 ca 30 až 40 minut).Experiments with shifting the equilibrium between anomers with chemical reagents have been unsuccessful except for reduction. The sensitivity of the known procedure is too low for the determination of glucose oligomers in a maltose series with a DP greater than 6, and the cellodextrin separation method is relatively time consuming (for DP 4 ca 30 to 40 minutes).

Předmětem vynálezu je způsob dělení oligosecharidů na silikagelovém sorbentu, který má měrný objem pórů 1,0 ež 2,0 ml/g, měrný povrch 350 až 500 m^/g, střední objem pórů 10 až 20 nm a který obsahuje chemicky vázanou alkalickou stacionární fázi s obsahem uhlíku aspoň 20 % hmot., u něhož jsou zbytkové silanolové skupiny metylovány. K dělení určená směs oligosacharidů se zavede na povrch sloupce a eluuje se vodou při teplotě 20 až 80 °C,The present invention provides a process for separating oligosecharides on a silica gel sorbent having a specific pore volume of 1.0 to 2.0 ml / g, a specific surface area of 350 to 500 m 2 / g, a mean pore volume of 10 to 20 nm and containing chemically bonded alkaline stationary a phase with a carbon content of at least 20% by weight in which the residual silanol groups are methylated. The oligosaccharide mixture to be separated is introduced onto the column surface and eluted with water at 20 to 80 ° C,

Hlavní předností způsobu dělení oligosecharidů podle vynálezu je iBokratická eluce při použiti vody jako mobilní fáze. Tento způsob js zvláště výhodný přihlédne-li se k rozpustnosti dělených systémů, která je ve směsných vodně-organických rozpouštědlech omezená, k jednoduchosti obsluhy a konečně i k ceně mobilní fáze.The major advantage of the oligosecharide separation process of the present invention is iBratic elution using water as the mobile phase. This method is particularly advantageous when taking into account the solubility of the split systems, which is limited in mixed aqueous-organic solvents, the ease of operation and, finally, the cost of the mobile phase.

Použití vody má svoje výhody i při refraktómetrická detekci oligosacharidů. Sorpční interakce podle tohoto způsobu dělení je silně teplotně závislá, takže při vhodně zvolená teplotě mezi 20 až 80 °C lze dosáhnout podstatného urychlení separace vedle úplného potlačení tvorby alfa e beta anomerů, která mohou při dělení rušit.The use of water also has advantages in refractometric detection of oligosaccharides. The sorption interaction according to this separation method is strongly temperature dependent, so that at a suitably selected temperature between 20 to 80 ° C, a substantial acceleration of separation can be achieved in addition to completely suppressing the formation of alpha and beta anomers which may interfere with separation.

V následujícím je předmět vynálezu vysvětlen a doložen příklady, aniž by vSek byl těmito příklady jeho rozsah jakkoli omezován.In the following, the invention is explained and exemplified without limiting its scope in any way.

PřikladlHe did

Sorbent se silikagelovou matricí o středním průměru pórů 14 nm, měrným objemem pórů 1,9 ml/g a měrném povrchu 400 m^/g obsahující chemicky vázanou oktadecylovou fázi (obsah G 23,5 % hmot.) se střední velikostí částic 10 yum sférického tvaru byl suspenzní technikou naplněn do nerezavé kolony 25P x 6 mm. Chromátografická kolona byla opatřena nastřikovacím ventilem s přerušením toku (stop-flow) a refraktometrickým detektorem.Sorbent with a silica gel matrix with a mean pore diameter of 14 nm, a specific pore volume of 1.9 ml / g and a specific surface area of 400 m ^ / g containing a chemically bonded octadecyl phase (G content 23.5% by weight) with a mean particle size of 10 µm spherical was packed into a 25P x 6 mm stainless steel column. The chromatography column was equipped with a stop-flow injection valve and a refractometric detector.

Mobilní fáze (voda) byla čerpána vysokotlakým lineárním čerpadlem. Do kolony byla zavedena směs maltodextrinů a při teplotě 25 °C byla kolonou čerpána voda s průtokovou rychlosti 50 ml/h při přetlaku 1,6 MPa. Za uvedených podmínek došlo k úplnému rozdělení sedmi maltodextrinů podle molekulové hmotnosti.The mobile phase (water) was pumped by a high pressure linear pump. A mixture of maltodextrins was introduced into the column and at 25 ° C water was pumped through the column at a flow rate of 50 ml / h at a pressure of 1.6 MPa. Under these conditions, seven maltodextrins were completely separated by molecular weight.

Příklad 2Example 2

Sorbent i uspořádání zařízení pro dělení oligosacharidů je stejné jako v příkladu 1. Dělení směsi oligomerických cellodextrinů probíhá při teplotě kolony 80 °C, při průtoku vody jako mobilní fáze 60 ml/h a při přetlaku na koloně 0,8 MPa během 10 minut. Cellodextriny do DP 6 se na koloně zcela oddělí a prokazují se refraktometricky.The sorbent and the arrangement of the oligosaccharide separator are the same as in Example 1. Separation of the oligomeric cellodextrin mixture takes place at a column temperature of 80 ° C, at a water flow rate of 60 ml / h as mobile phase and at a column overpressure of 0.8 MPa within 10 minutes. Cellodextrins up to DP 6 are completely separated on the column and detected refractometrically.

Příklad 3Example 3

Sorbent i zařízení je stejné jako v příkladu 1. Rozdělení směsi maltodextrinů probíhá při teplotě 60 °C, při průtokové rychloti vodné mobilní fáze 60 ml/h a při přetlaku 1,0 MPa. Během 7 minut se oligomery rozdělí až po meltodekaosu. Prokazují se detekcí na diferenciálním refraktometru.The sorbent and apparatus are the same as in Example 1. The separation of the mixture of maltodextrins takes place at a temperature of 60 ° C, at a flow rate of an aqueous mobile phase of 60 ml / h and at an overpressure of 1.0 MPa. Within 7 minutes the oligomers resolved to meltodekaose. They are detected by differential refractometer detection.

Claims

Method for separating oligosaccharides by liquid chromatography, characterized in that the oligosaccharide mixture to be separated is introduced on top of a silica gel column with a specific pore volume of 1.0 to 2.0 ml / g, a specific surface area of 350 to 500 m / g, A mean pore volume of 10 to 20 nm containing a covalently bonded alkane stationary phase having a carbon content of at least 20% by weight with an alkyl of 12 to 24 carbon atoms and methylated residual silanol groups, eluting the column with water at 20 to 80 ° C.