CS230943B1 - Způsob dělení oligosacharidů kapalinovou chromatograflí - Google Patents

Abstract

Způsob dělení oligosacharidů kapalinovou cjiromatografií, vyznačující se tím, že se směs oligosacharidů, která je urěena k dělení, zavádí na vrchol sloupce silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až22,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 nr/g, středním objemem pórů 10 až 20 nm, který obsahuje koválentně váženou alkaníckou stacionární fázi s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních s alkylem obsahujícím 12 až 24 atomů uhlíku s methylovenými zbytkovými silanolovými skupinami, přičemž se.sloupec eluuje vodou při teplotě 20 až 80 C. Způsobu podle vynálezu se používá k dělení oligosacharidů v analytičkám i preparativním měřítku a uplatněním v biotechnologii, zemědělství a v potravinářstvíi

Description

Vynález se týká způsobu dělení oligosacharidů kapalinovou chromatografii podle molekulové hmotnosti isokratickou elucí ve vodě.

Dělení, oligosacharidů podle jejich molekulové hmotnosti (stupně polymerlzace monosecharidových jednotek) v enzymatických nebo kyselých hydrolyzátech přírodních polysacharidů je velmi důležité v biotechnologii, v zemědělství a v potravinářském průmyslu.

Teoreticky se zdá být nejvhodnější pro dělení oligomerů sacharidů metoda gelová permeační chromatografie. Dělení se provádí zásadně za zvýšené teploty, jako elučního činidla se používá voda, avšak metoda je poněkud zdlouhavá a k úplnému rozdělení je zapotřebí několika hodin. Zrychlení eluce a zvýšení účinnosti dělení je velmi obtížné s ohledem ne malou tlakovou odolnost používaných homogenně sílovaných botnajíclch gelů jako jsou trojrozměrná polysacheridová nebo akrylamidové kopolyméry.

Rigidní celkově porésní materiály nacházejí v gelová chromatografii uplatnění jen pro dělení vysloveně vysokomolekulárnich sloučenin. Určitou nevýhodou metody pro preparativnl účely je i poměrně nízká záitěžová kapacita používaných gelově chromatografických materiálů.

Velmi běžná je metoda dělení saoharidů na iontoměničich. Způsob je velmi selektivní a hodí se zvláště pro rozlišení sacharidů podle rozdílů ve struktuře a v konfiguraci.

Při použití katexů v Ca⁺⁺ a Ag⁺ formě s vodnou mobilní fází je na závadu vysoká botnavost iontoměničů, nízká tlaková e mechanická odolnost nosičů a v neposlední míře i vymývání iontů ze struktury gelu projevující se v úbytku kapacity s časem. '

Při chromatografických procesech založených na interakcích se silikagelem (aminofáze) je možno pracovat se směsnou mobilní fází (nejčastěji acetonitril-voda), v níž může být dělení oligosecharidů s vyšší molekulovou hmotnostní komplikováno sníženou rozpustností složek. V poslední době bylo dosaženo dělení oligosecharidů na speciální koloně v módu obrácené fáze; nevýhodou této metody je věak rozlišení alfa- a beta- anomerů, které separaci zbytečně komplikuje.

Pokusy s posunem rovnováhy mezi anomery pomocí chemických činidel byly s výjimkou redukce neúspěšné. Citlivost známého postupu je příliš nízké pro stanovení oligomerů glukózy v maltosové sérii s DP vyšším než 6, při dělení cellodextrinů je metoda poměrně časově náročná (pro DP 4 ca 30 až 40 minut).

Předmětem vynálezu je způsob dělení oligosecharidů na silikagelovém sorbentu, který má měrný objem pórů 1,0 ež 2,0 ml/g, měrný povrch 350 až 500 m^/g, střední objem pórů 10 až 20 nm a který obsahuje chemicky vázanou alkalickou stacionární fázi s obsahem uhlíku aspoň 20 % hmot., u něhož jsou zbytkové silanolové skupiny metylovány. K dělení určená směs oligosacharidů se zavede na povrch sloupce a eluuje se vodou při teplotě 20 až 80 °C,

Hlavní předností způsobu dělení oligosecharidů podle vynálezu je iBokratická eluce při použiti vody jako mobilní fáze. Tento způsob js zvláště výhodný přihlédne-li se k rozpustnosti dělených systémů, která je ve směsných vodně-organických rozpouštědlech omezená, k jednoduchosti obsluhy a konečně i k ceně mobilní fáze.

Použití vody má svoje výhody i při refraktómetrická detekci oligosacharidů. Sorpční interakce podle tohoto způsobu dělení je silně teplotně závislá, takže při vhodně zvolená teplotě mezi 20 až 80 °C lze dosáhnout podstatného urychlení separace vedle úplného potlačení tvorby alfa e beta anomerů, která mohou při dělení rušit.

V následujícím je předmět vynálezu vysvětlen a doložen příklady, aniž by vSek byl těmito příklady jeho rozsah jakkoli omezován.

Přikladl

Sorbent se silikagelovou matricí o středním průměru pórů 14 nm, měrným objemem pórů 1,9 ml/g a měrném povrchu 400 m^/g obsahující chemicky vázanou oktadecylovou fázi (obsah G 23,5 % hmot.) se střední velikostí částic 10 yum sférického tvaru byl suspenzní technikou naplněn do nerezavé kolony 25P x 6 mm. Chromátografická kolona byla opatřena nastřikovacím ventilem s přerušením toku (stop-flow) a refraktometrickým detektorem.

Mobilní fáze (voda) byla čerpána vysokotlakým lineárním čerpadlem. Do kolony byla zavedena směs maltodextrinů a při teplotě 25 °C byla kolonou čerpána voda s průtokovou rychlosti 50 ml/h při přetlaku 1,6 MPa. Za uvedených podmínek došlo k úplnému rozdělení sedmi maltodextrinů podle molekulové hmotnosti.

Příklad 2

Sorbent i uspořádání zařízení pro dělení oligosacharidů je stejné jako v příkladu 1. Dělení směsi oligomerických cellodextrinů probíhá při teplotě kolony 80 °C, při průtoku vody jako mobilní fáze 60 ml/h a při přetlaku na koloně 0,8 MPa během 10 minut. Cellodextriny do DP 6 se na koloně zcela oddělí a prokazují se refraktometricky.

Příklad 3

Sorbent i zařízení je stejné jako v příkladu 1. Rozdělení směsi maltodextrinů probíhá při teplotě 60 °C, při průtokové rychloti vodné mobilní fáze 60 ml/h a při přetlaku 1,0 MPa. Během 7 minut se oligomery rozdělí až po meltodekaosu. Prokazují se detekcí na diferenciálním refraktometru.

Claims (1)

1. Způsob dělení oligosacharidů kapalinovou chromatografií, vyznačující se tím, že se směs oligosscharidů, která je určena k dělení, zavede na vrchol sloupce silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až 2,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 m /g, středním objemem pórů 10 až 20 nm, který obsahuje kovalentně vázanou alkanickou stacionární fázi s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních s alkylem obsahujícím 12 až 24 atomů uhlíku a s metylovanými zbytkovými silanolovými skupinami, přičemž se sloupec eluuje vodou při teplotě 20 až 80 °C.