CS230908B1 - Sorbent na bázi silikagelu pro dělení oligosacharidů - Google Patents

Abstract

Sorbent urěený pro dělení’ pomocí kapalinové chromatografie se podle vynálezu vyznačuje tím, že sestává z celkově porézního silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až 2,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 m^/g a středním průměrem pórů 10 až 20 nm, který obsahuje koválentně vázanou alkaníckou stacionární fázi s alkylem obsahujícím 12 ažw24 atomů uhlíku, s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních, u něhož jsou zbytkové silanolové skupiny metylov vány. Sorbentu podle vynálezu lze využít pro analýzu a preparaci oligosacharidů v biochemických, zemědělských a potravinářských produktech.

Description

Vynález ae týká sorbentu na bázi alkylovanáho silikagelu pro dělení oligosacharidů kapalinovou chromatografií,,

Sálaní oligosacharidů podle jejich molekulové hmotnosti (stupně polymerizace monosacharidových jednotek) v enzymatických naho kyselých hydrolyzátech přírodních polyaacharidů je velmi důležité v biochemii, v zemědělství a v potravinářském průmyslu.

Zrychlení eluce a zvýěení účinnogti dělení proti současnému stavu u gelové chromatografie je velmi obtížné a ohledem na malou tlakovou odolnost používaných homogenně sírovaných bobtnajících gelů například pólysacharidových nebo pólyakrylamidových materiálů.

Aplikaoe rigidních gelově chromatografických materiálů, jako je silikagel, porézní sklo nebo makroporézní kopolymemí sorbenty se při dělení sacharidů gelovou chromatografií omezuje pouze na vysloveně makromolekulám! sloučeniny.

Velmi běžná je metoda dělení sacharidů na měničích aniontů. Obecnou nevýhodou použití anexů v borétových pufrech je však dlouhé trváni analýzy, protože rychlejšímu ustavování rovnováh brání snížený přenos hmoty v gelové matrici bobtnajících iontově výměnných pryskyřic} totéž jeětě ve zvýšené míře platí i pro rozdělovači ehromatografii sacharidů na anexech ve směsi vody s organickým rozpouštědlem. Při pokusu odstranit tuto nevýhodu se ukazuje, že na makroporézních semirigidnich nebo rigidních nosičích k dělení oligomerů podle molekulové hmotnosti nedochází. Je tedy zřejmé, že se na separačním mechanismu určitou měrou podílí molekulárně sítový efekt.

Dělení sacharidů na katexech v Ca⁺⁺ nebo Ag⁺ formě dovoluje také používat jako mobilní fáze vody, na závadu je věak opět vysoká botnavost iontoměničů a nízké tlaková a mechanická odolnost sloupce. 1 zde se výrazně podílí na mechanismu dělení molekulárně sítový efekt. Rozdělovači ehromatografie na katexech může být omezena rozpustností dělených látek v mobilní fázi a úroveň separace je obdobná anexům.

Při chromatografických procesech založených na interakcích se silikagelem (impregnace kolony aminy přidávanými do mobilní fáze), případně s aminoalkylovým derivátem silikagelu, je nutno pracovat se směsnou mobilní fází (nejčastěji acatonitřil-voda).

Dělení oligodextrinů s vyšší molekulovou hmotností je komplikováno sníženou rozpustností v mobilní fázi. Užití gradientově techniky je s ohledem na refraktometrickou detekci omezeno nebo zcela vyloučeno.

V poslední době bylo dosaženo dělení oligomerů na speciální koloně v módu obrácené fáze. Nevýhodou této metody je však rozlišení alfa a beta anomerů, které nemá technologický význam a chromatogramy zbytečně komplikuje. Pokusy s posunem rovnováhy mezi anomery s použitím chemických činidel byly neúspěšné s výjimkou redukce. Citlivost postupu je příliš nízká pro stanoveni oligomerů glukózy v maltózové sérii s DP vyšším než 6, při dělení cellodextrinů je metoda poměrně časově náročná (asi 30 až 40 minut pro DP 4).

Předmětem předloženého vynálezu je sorbent na bázi silikagelu pro dělení oligoeacharidů podle molekulové hmotnosti pomocí kapalinové ehromatografie, který spočívá v tom, že sestává z’ celkově porézního silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až 2,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 m²/g a středním průměrem pórů 10 až 20 nm, který obsahuje kovalehtně vázanou alkanickou stacionární fázi s alkylem obsahujícím 12 až 24 atomů uhlíku, s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních, u něhož jsou zbytkové silanolové skupiny metylovény.

S výhodou lze zejména pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií používat sorbentu ve sférické nebo mikrosférické formě.

Výhodou sorbentu podle předloženého vynálezu je ve srovnání s obvyklými iontově výměnnými pryskyřicemi jeho vynikající mechanické stálost, které dovoluje práci za vysokých průtokových rychlosti mobilní fáze a za vysokých tlaků. Tato skutečnost podstatně přispívá k urychlení analýzy. Sorbenty je možno připravovat ve sférické a v mikrosférioké (3 až 5 μπι) formě. Dosahuje se tak nižších tlakových spádů na koloně než u sorbentů s nepravidelným tvarem částic a vysokých účinností dělení. Kovalentně vázaná stacionární fáze mé oproti sorbentům, připraveným saturací nosiče nízkomolekulérními sloučeninami nebo kationty značnou přednost ve vysoké reprodukovatelnosti a stálosti vlastností a v podstatně delší životnosti.

Značný průměr i specifický objem trvalých pórů sorbentu má ve srovnání s gelovou strukturou sorbentů na bázi homogenních sílovanýeh pryskyřic četné výhody při ustalování rovnováh mezi mobilní a stacionární fází, při transportu hmoty mezi fázemi.

Důsledkem je vysoká účinnost kolon plněných sorbentem podle předmětu vynálezu, menší závislost účinnosti na průtokové rychlosti eluentu, velmi dobrá selektivita při prakticky zanedbatelné asymetrii chromatografických píků. Výhodou je i možnost použití vody jako mobilní fáze.

V následující části je předmět vynálezu vysvětlen a doložen příklady. Tyto příklady však rozsah vynálezu v žádném případě neomezují.

Přikladl ' 100 g makroporázního silikagelu s měrným objemem pólů 1,8 ml/g a měrným povrchem 450 m²/g o velikosti částic 5 fim * 2 jam se rozmíchá v 3 000 ml destilované vody, do které se přidá 300 ml 36% (% hmotnostní) chlorovodíkové kyseliny. Suspenze se povaří 30 minut a po vychladnutí se přefiltruje a sorbent se promyje na filtru 2 000 ml destilované vody, _tsuspenduje ve 3 litrech destilované vody a povaří se po dobu 30 minut. Po vychladnutí se suspenze odsaje na skleněném filtru a promyje se 2 litry destilované vody až do pH 5. Silikagel se ponechá na skleněném filtru a prosévá se vzduchem po dobu 4 minut, pak se suší 4 hodiny při 60 °C a déle 16 hodin při teplotě 110 °C.

Takto aktivovaný silikagel se smísí s 500 ml sušeného toluenu, směs se řádně protřepe a přidá se 80 ml oktadecyltrichlorsilanu, zamíchá se a potom se přidá 80 ml hexametyldisilazanu. Nádoba se opatří uzávěrem obsahujícím chlorid vápenatý a směs se ponechá reagovat po dobu 120 hodin. Pak se suspenze odsaje, promyje se 2,4 litru toluenu, 1 400 ml nesušeného toluenu, 1 700 ml acetonu, 1 400 ml metanolu, směsi metanolu a vody (2:1), acetonem a volně se vysuší. Poslední sušení se provádí během 3 hodin při teplotě 80 °C. Elementární analýzou byl zjištěn obsah uhlíku 25 % hmotnostních.

Příklad 2

Sorbent se silikagelovou matricí středního průměru pórů 12 nm, měrným objemem pórů 1,8 ml/g a o měrném povrchu 440 m²/g obsahující oktadecylitvou chemicky vázanou fázi (obsah uhlíku 25 % hmotnostních) se střední velikostí částic 10 pan sférického tvaru (podle příkladu 1 ) se naplní suspenzní technikou do nerezové kolony dlouhé 250 mm s vnitřním průměrem 6 mm s

Chromatografická kolona je opatřena nastřikovacím ventilem s přerušením toku (stop-flow) a refraktometrickým detektorem. Mobilní fáze (voda) se čerpá vysokotlakým lineárním čerpadlem. Do kolony se nastříkme směs maltodextrinů a při teplotě 25 °C se kolonou čerpá voda s průtokovou rychlostí 50 ml/h při přetlaku 1,6 MPa. Za uvedených podmínek dojde během 12 minut k úplné separaci sedmi maltodextrinů podle molekulové hmotnosti.

Příklad 3

Sorbent na bázi silikagelové matrice o středním průměru pórů 14 nm, měrným objemem pórů 2,0 ml/g a měrným povrchem 400 m²/g obsahující oktadecylovou chemicky váženou fázi (obsah uhlíku 27,5 % hmotnostního) se střední velikostí sférických Sástic 5 /un byl suspenzní technikou neplněn do skleněné vysokotlaké kolony délky 150 mm s vnitřním průměrem 3,2 mm. Čerpadlo, nastřikovací ventil a detektor jsou shodné se zařízením popsaným v příkladu 2. Sluce směsi oligomemích cellodextrinů se provádí při teplotě 70 °C, průtoko vé rychlosti 31 ml/h a při přetlaku 4,0 UPa. Dělení oligome^ů po DP 6 proběhne během 8 minut.

Příklad 4

Kolona a přístrojové uspořádání je shodné jako v příkladu 3, sorbent má stejnou matri ci a liěí se obsahem elkanické stacionární fáze (30 % hmotnostních). Dělení maltodextrinů (do DP 10) při teplotě 70 °C ve vodné mobilní fázi proběhne během 10 minut.

Claims (2)

1. Sorbent na bázi silikagelu pro dělení oligosacharidů podle molekulové hmotnosti pomocí kapalinové chromatografie, vyznačující se tím, že sestává z celkově porézního silikagelu s měrným objemem pórů 1,0 až 2,0 ml/g, měrným povrchem 350 až 500 m²/g a středním průměrem pórů 10 až 20 nm,'který obsahuje kovalentně vázanou alkaniekou stacionární fázi e alkylem obsahujícím 12 až 24 atomů uhlíku, s obsahem uhlíku alespoň 20 % hmotnostních, u něhož jeou zbytkové silanolové skupiny metylovány.

2. Sorbent podle bodu 1, vyznačující se tím, že částice silikagelu mají sférický tvar

Severografia, n. p., MOST