CS230890B1 - Sposob produkcie enzýmu é-glukozidázy pomocou mikroskopických húb rodu Blastobotrys - Google Patents

Description

230890 4 3

Vynález sa týká sposobu produkcie enzý-mu (S-glukozid glukohydrolázy (i(3-glukozidá-zá, EC 3.2.1.21) pomocou mikroskopickýchhúb rodu Blastobotrys kultivovaných navhodných živných podach. Pře priemyselnú produkciu β-glukozidázysa najčastejšie používajú následovně mikro-organizmy: Aspergillus oryzae, Meruliuslachrymans (G. de Stevens v Methods in En-zymology, 1. diel, S. P. Collowick a N. O.Kaplan, Acad. Press. New York 1955, str. 173až 178). Sú však aj iné mikroorganizmy, oktorých nebolo doposia! známe, že majúschopnost produkovat enzým /3-glukozidázu.Pomocou gélovej metody (A. O. č. 183 169)sme zistili výraznú produkciu β-glukozidázyu 3 popísaných druhov rodu Blastobotrys,a to Blastobotrys aristata, Blastobotrys pro-liferans a Blastobotrys nivea.

Druh Blastobotrys proliferans je novopo-písariý druh rodu Blastobotrys izolovaný zpara orechov (Bertholletia excelsa) z poš-kodeného jadra, druh Blastobotrys aristatabol izolovaný zo vzorky plesnivěj omietky,dodanej pracovníkmi pamlatkovej starostli-vosti z hradu Bítov [oba nové druhy popisu-je Marvanová L.: Two new Blastobotrys spe-cies. Transactions of the British MycologicalSociety 66, 217 (1976)]. Druh Blastobotrysnivea izolovaný z kompostu popísal vonKlopotek A.: Blastobotrys nivea gen. nov.,sp. nov., Archiv fur Mikrobiologie 58, 92(1967). Rod Blastobotrys klopotek patří dočeíade Moniliaceae, rodu Moniliales, triedyDenteromycetes. O produkcii hydroláz poly-sacharidov uvedenými druhmi rodu Blasto-botrys nie je v literatuře nič známe.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že kul-tiváciou nasledovných troch kmeňov roduBlastobotrys:

Blastobotrys proliferansBlastobotrys aristataBlastobotrys nivea CCMF — 493CCMF — 410CCMF — 433 jednotlivo alebo ich zmesí na živnej podeobsahujúcej celobiózu, celulózu alebo jejhydroxyetyl, hydroxypropyl, karboxymetylderiváty alebo natívny derivát celulózy po-lysacharid tamarind pri teplote 25 až 37 °Ca hodnotě pH 4,8 po dobu 72 až 120 hodinprodukuje enzým ^-glukozidázu, ktorý sazískává v surovom stave odpařením rastovejpůdy, připadne v čiastočne zušlachtenomstave zrážaním síranom amonným alebo or-ganickými rozpúšťadlami, s výhodou etanolua acetonu. K dalšej purifikácii surového enzýmu β--glukozidázy po dialýze možno použit napří-klad adsorpciu ,ό-glukozidázy zo zmesi biel-kovín na metahydroxyd hlinitý a následovněuvofnenie enzýmu pomocou NažCOs tak, akouvádza G. de Stevens v hoře uvedenej citá-cii. Výhodou uvedeného postupu je predo-všetkým to, že příprava (S-glukozidázy jevelmi jednoduchá a ako súčast kultivačnejpůdy možno použit aj neprečistené nativně substráty l'ahko dostupné ako rožne druhypolnohospodarskeho odpadu. V případe, žesurový enzýmový preparát má obsahovat ce-lý komplex celulolytických enzýmov, výhod-né sú kombinácie za účasti Blastobotrys pro-liferans, nakolko uvedený kmeň produkujepopři /J-glukozidázovej aktivitě aj celulázyCx a G| (/3-1,4-glukán glukánohydroláza EC3.2.1.4 a celobiohydroláza EC 3.2.1.-). Ďalšou výhodou je vysoký výťažok /Ž-glu-kozidázovej aktivity. Na druhej straně, po-kial' je požiadavka na čistú /3-glukozidázovúenzýmovú aktivitu bez sprievodných celulo-lytických enzýmov, možno uvedený prepa-rát získat jednoducho a bez sprievodnýchcelulolytických enzýmov, navrhovaným no-vým postupom pomocou kmeňov Blastobo-trya aristata a Blastobotrys nivea jednotlivoalebo v ich zmesi. Nakolko uvedené kmenerodu Blastobotrys produkujú popři ,/2-gluko-zidázovej aktivitě aj enzýmy schopné odště-povat xylczu, nový enzýmový preparát získa-ný zahuštěním kultivačnej půdy po kultiváciiuvedených zástupcov rodu Blastobotrys mož-no použit aj k sacharifikácii polysacharidutamarind (Tamarindus indica). Příklad 1

Blastobotrys proliferans CCMF-493, Blasto-botrys nivea CCMF-433 a Blastobotrys arista-ta CCMF-410 sa pomnožia na rastovej podeobsahujúcej 2 g gélu (připraveného sleto-váním hydroxyetylcelulózy podlá A. O. číslo183 169) ponořeného do polovice výšky v 20mililitroch Yaest Nitrogen Base rastovej pů-dě (0,6 g/100 ml) o pH 4,8 a kultivuje sa napovrchu po dobu 3 dní pri teplote 30 °C,kedy dochádza k steknuteniu gélu. Nahro-maděná biomasa druhov Blastobotrys sa po-užije ako zmesné inokulum půdy obsahujú-cej 20 g kukuřičného výluhu, 5 g karboxy-metylcelulózy (pH 4,8) na 1 1 vody a kulti-vácia prebieha po dobu dalších 2 dní. Potomsa biomasa Blastobotrys odfiltruje a surovýenzým /3-glukozidáza sa získá odpařenímkultivačnej půdy na vakuovej odparke (cel-ková aktivita 33 U, t. j. 0,55 ,tíkat., špecifickáaktivita 12 nkat/mg proteinu. Příklad 2

Ako inokulum sa použije kmeň Blastobo-trys aristata CCMF-410 a Blastobotrys niveaCCMF-433, ktoré sa pomnožia na půdě obsa-hujúcej 2 g síranu amonného, 1 g KH2PO4 a5 g celobiózy na 1 1 (pH 4,8). Po 120 hodi-nách kultivácie (25 °C) sa biomasa odfiltrujea zvyšná kultivačná půda sa prezráža etano-lom (2 objem, diely etanolu na 1 objem, dielkultivačnej půdy). V sedimente vypadne /3-glukozidáza 0,6<ukat o špecifickej aktivitě 2,0 nkat/mg, pri-čom tento preparát neobsahuje celulolytickúaktivitu ((3-1,4-glukán glukánohydroláza acelobiohydroláza).

Claims (1)

1. 230890 S 8 Příklad 3 Tak ako je uvedené v příklade 1 s týmrozdielom, že namiesto hydroxyetyl- a kar-boxymetylcelulózy sa použije polysacharidtamarind a ako inokulum čistá kultúra Blas-tobotrys proliferans CCMF-493. Kultiváciaprebieha pri teplote 37 °C po dobu 3 dní.Surový zahuštěný enzýmový preparát ,β-glu- Vynález má použitie v základnom mikro- kozidázy obsahuje 0,48 ,ukat a specifická ak-tivita8 jukat/mg obsahuje 0,25 ,ukat /3-1,4-glu-kán glukánohydrolázovej aktivity a 3 nkatcelobiohydrolázovej aktivity. Vynález má použitie v základnom mikro-biologickom biochemickom výskume a priprodukcii β-glukozidázy ako jedného z dó-ležitých enzýmov pri sacharifikácii polysa-charidov róznych dřevných a pofnohospo-darskych odpadov. PREDMET VYNÁLEZU Sposob produkcie enzýmu ^-glukozidázypomocou mikroskopických húb rodu Blasto-botrys, vyznačený tým, že sa kultivujú násle-dovně kmene rodu Blastobotrys: Blastobotrys proliferansBlastobotrys aristataBlastobotrys nivea jednotlivo, alebo ich zmesi CCMF — 493CCMF — 410CCMF — 433 na živnej pode obsahujúcej celobiózu, celulózu alebo jejhydroxyetyl, hydroxypropyl, karboxymetylderiváty, alebo natívny derivát celulózy po-lysacharid tamarind pri teplote 25 až 37 °C,a hodnotě pH 4,8 po dobu 72 až 120 hodin aenzým jž-glukozidázu sa získá v surovomstave odpařením rastovej pódy, připadne včiastočne zušfachtilom stave zrážaním síra-nom amonným alebo organickým rozpúšťa-dlom, s výhodou etanolom alebo acetónom.