CS225792B1

CS225792B1 - The method of the aerobe yeast culturing

Info

Publication number: CS225792B1
Application number: CS325382A
Authority: CS
Inventors: Lubomir Dr Adamek; Miloslav Ing Rut; Jiri Ing Karnet; Frantisek Ing Csc Stros
Original assignee: Lubomir Dr Adamek; Rut Miloslav; Jiri Ing Karnet; Frantisek Ing Csc Stros
Priority date: 1982-05-05
Filing date: 1982-05-05
Publication date: 1984-02-13

Description

Vynález se týká způsobu aerobní kultivaoe kvasinek s průběžným doplňováním obsahu živin v kultivačním médiu, především způsobu řízení doplňkových dávek Živin.The invention relates to a method of aerobic yeast culture with continuous replenishment of the nutrient content in the culture medium, in particular to a method of controlling supplemental nutrient doses.

Při některýoh typech aerobníoh kultivacích kvasinek se používá kultivační postup, při němž není růst kvasinek limitován zdrojem uhlíku ani jinou živinou, protože ee živiny spotřebované z kultivačního média rostoucími kvasinkami průběžně do média doplňují. Taková kultivaoe se nutně dostává do limitu kyslíku, v němž je růst kvasinek omezován výkonem aeračního zařízení fermentoru. Popsaný kultivační postup má proti běžnějším kultivacím limitovaným substrátem výhodu v tom, že umožňuje plně využít výkon fermentoru a dosáhnout optimální měrné spotřeby energie a že se při něm často dosahuje vyšší výtěžnosti biomasy (USA patent č. 3 865 691). Zralé médium odcházejíoí z fermentoru obsahuje část nevyužitých živin, a proto je postup vhodný především pro kultivaoe e reoirkulaoí odstředěného média. Při kultivacích bez vracení odstředěného média do fermentoru je třeba za produkční fermentor zařazovat dozrávaoí káč.In some types of aerobic yeast culture, a culture procedure is used in which yeast growth is not limited by carbon source or other nutrient, since ee nutrients consumed from the culture medium by the growing yeast are continually replenished into the medium. Such a culture necessarily reaches an oxygen limit in which yeast growth is limited by the performance of the fermenter aeration equipment. The described cultivation process has the advantage over more conventional limited substrate cultivations in that it allows to make full use of the fermenter performance and achieve optimum specific energy consumption, and often achieves a higher biomass yield (U.S. Patent No. 3,865,691). The mature medium leaving the fermenter contains part of the unused nutrients, and therefore the process is particularly suitable for culturing and re-circulating the centrifuged medium. In cultivations without returning the centrifuged medium to the fermenter, a ripening mat must be added as the production fermenter.

Pro realizaci kultivačního postupu probíhajícího v limitu kyslíku je nutný systém řízení dávek zdrojů biogenníoh prvků, kterými se doplňuje obsah živin v kultivačním médiu. Pro dávkování zdroje uhlíku byl např. navržen postup založený na změnáoh koncentrace rozpuštěného kyslíku (čs. patent č. 116 642, USA patent č. 3 384 553), metodaIn order to carry out the cultivation process taking place in the oxygen limit, a system of dose control of the sources of biogenic elements is necessary to supplement the nutrient content in the cultivation medium. For example, a method based on varying dissolved oxygen concentration has been proposed for dosing a carbon source (U.S. Patent No. 116,642, U.S. Patent No. 3,384,553), a method of

225 792225 792

225 792 současného přidávání substrátu a zdroje dusíku založená na změnáoh pH kultivačního média určitého složení (čs. autorská osvědčení č. 158 954, čs. autorské osvědčení č. 158 991), příp. způsob využívající změn redox-potenoiálu média při spotřebování zdroje uhlíku (čs. autorské osvědčeni č. 181 337). Pro aerobní kultivaoe mikroorganismů na etanolu nebo metanolu jsou vhodné postupy dávkování zdroje uhlíku založené na stanovování hořlavýoh par ve výdeohu z fermentoru metodou katalytického spalování (čs. patent č. 142 889, čs. autorská osvědčení č. 164 315, čs. autorské osvědčení č. 192 622). Podstatně méně pozornosti bylo zatím věnováno způsobu dávkování ostatních biogenníoh, příp. mikrobiogenníoh prvků. Dávkování zdroje dusíku, kterým bývá většinou amoniak, se obvykle spojuje s úpravou pH fermentujíčího média. Minerální živiny, jako jsou zdroje fosforu, draslíku a hořčíku, příp. i zdroje mikrobiogenníoh prvků se do kultivačního média většinou přidávají ve formě koncentrovaných směsných roztoků společně se zdrojem uhlíku nebo dusíku (čs. autorské osvědčení č. 202 379, čs. autorské osvědčení č. 210 225), přičemž se vzájemný poměr zdrojů jednotlivýoh biogenníoh prvků určuje podle výtěžnosti koeficientu a podle zastoupení prvků v biomase obvyklého složení.225 792 concomitant addition of substrate and nitrogen source based on changes in pH of the culture medium of a certain composition (Czech Author's Certificate No. 158 954, Czech Author's Certificate No. 158 991), respectively. a method utilizing changes in the redox-potential of the medium to consume a carbon source (cf. No. 181,337). For aerobic cultures of microorganisms on ethanol or methanol, suitable methods of dosing the carbon source based on the determination of flammable vapors in the fermenter effluent by the method of catalytic combustion (US Patent No. 142,889, US Patent Certificate No. 164,315, US Patent Certificate No. 6,396). 192 622). Much less attention has been paid so far to the dosing of other biogenic, resp. microbiogenic elements. Dosage of a nitrogen source, which is usually ammonia, is usually associated with adjusting the pH of the fermenting medium. Mineral nutrients, such as sources of phosphorus, potassium and magnesium, respectively. sources of microbiogenic elements are usually added to the culture medium in the form of concentrated mixed solutions together with a source of carbon or nitrogen (cf. author's certificate no. 202 379, cf. author's certificate no. 210 225). according to the coefficient recovery and the proportion of elements in the biomass of usual composition.

Každý z uvedených známých postupů pro řízení přídavku živin do kultivačního média má své přednosti i nevýhody. Společnou nevýhodou je to, že při postupech používaná čidla vesměs reagují na nedostatek jediného biogenního prvku. Při dávkování se pak předpokládá, že ve stejné míře byly spotřebovány i dalěí biogenní prvky a společně s dávkou defioitního prvku se přidávají v určeném poměru i zdroje dalěíoh živin. V případě, že se nepodaří správně určit vzájemný poměr jednotlivýoh živin, může být některý z biogenníoh prvků předávkován nebo naopak je ho v médiu nedostatek.Each of the known methods for controlling the addition of nutrients to the culture medium has its advantages and disadvantages. A common disadvantage is that the sensors used in the processes generally respond to the lack of a single biogenic element. At dosing, it is then assumed that other biogenic elements have been consumed to the same extent and, in conjunction with the dose of the defio-element, additional nutrient sources are added at a specified rate. If the ratio of the individual nutrients is not correctly determined, some of the biogenic elements may be overdose, or there may be a lack of it in the medium.

Tyto nevýhody částečně řeší způsob aerobní kultivaoe kvasinek s průběžným doplňováním obsahu živin v kultivačním médiu a za průběžného stanovování konoentraoe draslíku v kultivačním médiu, při němž se minerální živiny, tj. zdroje draslíku, fosforu, hořčíku a mikrobiogenníoh prvků, příp. i zdroj uhlíku do kultivačního média, přidávají v závislosti na změnáoh konoentraoe draslíku v kultivačním médiu.These disadvantages are partially solved by a method of aerobic yeast culture with continuous replenishment of the nutrient content in the culture medium and with a continuous determination of the potassium concentration in the culture medium. As a carbon source into the culture medium, they add, depending on the variations in the potassium conentraent in the culture medium.

Při kultivačním pH 4 se minerální Živiny do kultivačního média přidávají, klesne-li konoentraoe draslíku v médiu pod 110 až 100 mg.I¹. Při nižším případně vyšším kultivačním pH se hranioe konoentraoe draslíku rozhodující pro dávkování zvyšuje, příp. snižuje, na každé 1 pH rozdílu o 20 mg.l^-^.At a culture pH of 4, the mineral nutrients are added to the culture medium when the potassium concentration in the medium falls below 110 to 100 mg.l ¹ . At lower or higher cultivation pH, the potassium conoentration decisive for dosing is increased or decreased. decreases, for each 1 pH difference by 20 mg.l ^- .

Fosfor, hořčík a mikrobiogenní prvky jsou v dávce minerálních živin obsaženy v témže poměru jako v kvasničné biomase obvyklého složení, obsah draslíku v dávoe je proti tomuto poměru zvýše o 20 až 50 %,Phosphorus, magnesium and microbiogenic elements are contained in the mineral nutrient dose in the same ratio as in yeast biomass of the usual composition, the potassium content in the dose is increased by 20 to 50% against this ratio,

Zdroj uhlíku se do kultivačního média přidává, stoupne-li konoentraoe draslíku v médiu nejméně o 25 mg.I*¹ nad hranioi určenou pro dávkování minerálníoh živin.The carbon source is added to the culture medium when the potassium concentration in the medium rises by at least 25 mg.I * ¹ above the threshold for mineral nutrient dosing.

V případě, že se v závislosti na změnáoh konoentraoe v kultivačním médiu přidávají do média minerální živiny i zdroj uhlíku, smí jedna dávka minerálníoh živin zvýšit konoentraoi draslíku v médiu nejvýše o 20 mg.I*¹.If, depending on the changes in conoentrao in the culture medium, both the mineral nutrient and the carbon source are added to the medium, a single dose of mineral nutrients may increase the conoentrao of potassium in the medium by not more than 20 mg.I * ¹ .

225 792225 792

Předností postupu podle vynálezu je to, že umožňuje dávkovat minerální živiny nezávisle na přídavoíoh zdroje uhlíku, příp. dusíku, a zmenšuje tak nebezpečí chybného živení v případech, kdy dojde k neočekávaná změně výtěžnosti nebo ke změně obsahu dusíkatých látek v biomase. Při dávkování minerálníoh živin postupem podle vynálezu ee přihlíží také ke skutečnosti, že poměr mezi koncentrací draslíku v médiu a obsahem draslíku v biomase se mění s kultivačním pH, což umožňuje dosahovat vyrovnaný obsah draslíku v produkovaných kvasinkáoh.The advantage of the process according to the invention is that it allows the mineral nutrients to be metered independently of the addition of the carbon source or the carbon source. This reduces the risk of erroneous feeding when there is an unexpected change in recovery or a change in the crude protein content of biomass. When dosing the mineral nutrients with the process according to the invention, it is also taken into account that the ratio between the potassium concentration in the medium and the potassium content in the biomass varies with the culture pH, which makes it possible to achieve a balanced potassium content in the yeast produced.

Dávkování zdroje uhlíku postupem podle vynálezu je založeno na skutečnosti, že po spotřebování zdroje uhlíku uvolňují kvasničné buňky do média draslík. Rychlý vzestup koncentrace draslíku v kultivačním médiu je využit k indikaci nedostatku substrátu v médiu a k řízení doplňkovýoh dávek zdroje uhlíku. Po nadávkování zdroje, uhlíku přijímají kvasničné buňky uvolněný draslík nazpět a koncentrace draslíku v kultivačním médiu opět rychle klesá na původní hodnotu. Další výhodou postupu podle vynálezu je možnost dávkovat na základě údajů jediného čidla nezávisle na sobě jak minerální živiny, tak i zdroj uhlíku. V případě, že je doplňování zdroje uhlíku do média zajišťováno jinou metodou, může sledování kcnoentraoe draslíku v médiu sloužit alespoň ke kontrole dostatečného dávkování zdroje uhlíku.The dosing of the carbon source by the process of the invention is based on the fact that after the carbon source is consumed, the yeast cells release potassium into the medium. A rapid increase in potassium concentration in the culture medium is used to indicate substrate deficiency in the medium and to control supplementary doses of carbon source. After dosing the carbon source, the yeast cells absorb the released potassium back and the potassium concentration in the culture medium again rapidly decreases to its original value. A further advantage of the process according to the invention is the possibility of dosing, on the basis of a single sensor, independently of each other, both the mineral nutrients and the carbon source. In the case where the supply of carbon source to the medium is provided by another method, monitoring of potassium carbonation in the medium may serve at least to control sufficient carbon source dosing.

Postup řízení doplňkovýoh dávek živin je objasněn, nikoliv však omezen, náeleduj íoími příklady.The procedure for controlling supplemental nutrient dosages is illustrated, but not limited, by the following examples.

Příklad 1Example 1

V mechanicky míohaném laboratorním skleněném fermentoru s celkovým obsahem 30 1,In a mechanically agitated laboratory glass fermenter with a total content of 30 liters,

byla provedena vsádková přižlvovaná kultivace kvasinky Candida utilie CCY 29-38-73 na saoharóze. Permentor je vybaven automatickou regulací teploty a pH: pro popisovaný pokus bylo vybavení fermentoru doplněno zařízením pro průběžné měření koncentrace draslíku v kultivačním médiu, které se skládalo z draslíkové selektivní elektrody Crytur a z regulačního mV metru a které také umožňovalo dávkování roztoku živných solí a roztoku saoharózy v závislosti na změnách koncentrace draslíku.batch-grown cultured yeast Candida utilization CCY 29-38-73 on saoharose was performed. Permentor is equipped with automatic temperature and pH control: for the described experiment the fermenter equipment was supplemented with a device for continuous measurement of potassium concentration in the culture medium, which consisted of potassium selective electrode Crytur and control mV meter, which also allowed dosing of nutrient solution and dependence on changes in potassium concentration.

Vztah mezi potenciálem elektrody a konoentraoí draslíku v médiu je zaohyoen v tabuloe č. 1.The relationship between the electrode potential and the potassium concentra- ture in the medium is described in Table 1.

Konoentraoe draslíku Potenoiál elektrodyPotential Potassium Electrode

320320

260260

210210

135135

-16,5-16.5

-21,6-21.6

-26,9-26.9

-38,0-38.0

-47,2-47.2

-57,4-57.4

225 792225 792

Před zahájením kultivaoe se do fermentoru napustilo 14 1 vody, v ní se rozpustilo 15 g síranu ymonnáho, načež se připustila prvni dávka roztoku živných solí (60 ml) a základní dávka roztoku saoharózy 40 % hmot./55 _mi/, kterou se obsah saoharózy v médiu upravil na 1,5 g.l“¹. K připravenému živnému médiu se potom přidalo inokulum v množství, zajištujícím počáteční konoentraoi kvasničné sušiny 2 g.l“¹. Spuštěním míohadla a vzdušnění byla kultivaoe zahájena. V jejím průběhu se teplota média udržovala na 33 °C a pH se čpavkovou vodou, která současně sloužila jako zdroj dusíku, upravovalo na 4,5. Selektivní draslíkovou elektrodou se průběžnš měřila konoentraoe draslíku v médiu a při poklesu potenoiálu pod-43 mV (110 mg K) se do fermentoru dávkoval roztok minerálních živin, ebsahujioí 35 ml kyseliny fosforečné (85 % hmot.), 38 g hydroxidu draselného, g MgSO^.7 HgO a 0,5 g ZnSO^. Jedna dávka roztoku minerálníoh živin byla 10 ml (tj.Before kultivaoe to impregnate the fermentor 14 1 of water, it was dissolved in 15 g ymonnáho sulfate and then admitted first dose of nutrient salts solution (60 mL) and the basic solution dose saoharózy 40% hmot./55 _m i / by the content saoharose in the medium adjusted to 1.5 gl ^-1 . The inoculum was then added to the prepared nutrient medium to provide an initial conoentra of yeast dry matter of 2 g / ^l . By launching the agitator and aeration, the cultivaoe was initiated. During this time, the temperature of the medium was maintained at 33 ° C and the pH was adjusted to 4.5 with ammonia water, which simultaneously served as a nitrogen source. With a selective potassium electrode, the potassium concentration in the medium was continuously measured and a mineral nutrient solution containing 35 ml of phosphoric acid (85% by weight), 38 g of potassium hydroxide, g of MgSO 2 was added to the fermentor as the potenial drop was below -43 mV (110 mg K). 1.7 HgO and 0.5 g ZnSO4. One dose of mineral nutrient solution was 10 ml (i.e.

265 mg K). Při vzestupu potenoiálu nad -38 mV (135 mg K) se do fermentoru přidával roztok saoharózy, jehož jedna dávka byla 40 ml.265 mg K). As the potenoial rose above -38 mV (135 mg K), a saoharose solution was added to the fermentor, one dose being 40 ml.

Kultivaoe byla ukončena po 5 hodináoh, když bylo spotřebováno 1 200 ml roztoku saoharózy (480 g saoharózy). Přírůstek kvasničné sušiny byl 270 g, oož odpovídá výtěžnostnimu koeficientu 0,56.The cultures were terminated after 5 hours when 1200 ml of saoharose solution (480 g of saoharose) was consumed. The yeast dry matter increment was 270 g, which corresponds to a yield coefficient of 0.56.

Příklad 2Example 2

T meohanioky míohaném skleněném laboratorním fermentoru s oelkovým obsahem 5 1 a užitečném plnění 2,3 1 byla provedena kontinuální kultivaoe kvasinky Torulopsis -ethaholitoleraas CCY 26-58-1 na etanolu. Při vzdušnění 1,0 WM a 1 500 ot. min.“¹ byla ve fermentoru dosahována ryohlost rozpuštění kyslíku 150 mmol Og.l^-1.^¹.A tertiary ethanol-lab glass fermenter with a 5 L steel content and a useful loading of 2.3 L was used to continuously cultivate the yeast Torulopsis-ethaholitoleraas CCY 26-58-1 on ethanol. At 1.0 WM and 1500 rpm aeration. min. ^"1 fermenter was achieved ryohlost oxygen dissolving 150 mmol Og.l ^-1. ^ ^1.

Kultivační teplota byla 35 °C a pH se dávkováním čpavkové vody udržovalo v rozmezí 3,9 až 4,0. V průběhu pokusu se průběžně měřila konoentraoe draslíku v kultivačním médiu selektivní elektrodou Crytur připojenou regulačnímu mV metru. Závislost potenoiálu elektrody na konoentraoi draslíku byla uvedena v příkladu 1 v tabuloe č. 1.The culture temperature was 35 ° C and the pH was maintained in the range of 3.9-4.0 by the addition of ammonia water. Potassium concentration in the culture medium was continuously measured during the experiment with a selective Crytur electrode connected to a control mV meter. The dependence of the electrode potenoial on the potassium conentrail was shown in Table 1 of Example 1.

V průběhu kultivaoe se do fermentoru dávkovaoím čerpadlem přiváděla voda obsahujíoí 1 g.l”¹ síranu amonného, a to rychlostí zajištující zřečovaoí ryohlost 0,25 h“¹. Etanol byl do fermentoru dávkován regulačním analyzátorem etanolu Metrex DEL tak, aby se konoentraoe etanolu v médiu udržovala v rozmezí 1,5 až 2,0 g.l**}*. Konoentraoe draslíku v médiu se udržovala nad 100 mg. K.l*}* tím, že se při poklesu potenoiálu elektrody Crytur pod -45 mV do fermentoru dávkovaly roztoky minerálníoh živin A a B v poměru 1 1 1.During the culture, water containing 1 g / ^l of ammonium sulfate was fed to the fermentor via a metering pump at a rate of 0.25 h / ^l . Ethanol was fed into the fermenter by a Metrex DEL ethanol control analyzer so as to maintain the ethanol concentration in the medium between 1.5 and 2.0 gl **. Potassium concentration in the medium was maintained above 100 mg. As a result of the Crytur electrode potenial drop below -45 mV, the mineral nutrient solutions A and B were dosed at a rate of 1 liter.

Roztok A obsahoval v litru1 ml kys. fosforečné (85 % hmot.) g hydroxidu draselného g síranu hořečnatého (7 HgO)Solution A contained 1 ml of phosphoric acid (85% by weight) g of potassium hydroxide g of magnesium sulphate (7 HgO) per liter

0,5 g síranu zinečnatého (7 HgO)0,5 g of zinc sulphate (7 HgO)

0,02 g síranu měčnatého (50.02 g of copper sulphate (5

0,05 g ohloridu manganatého (4 HgO)0.05 g of manganese (II) chloride (4 HgO)

225 792225 792

Roztok B obsahoval v litru:Solution B contained in liter:

15,6 g chloridu vápenatého (2 HgO)15.6 g calcium chloride (2 HgO)

1,06 g ohloridu železitého (6 HgO)1.06 g of ferric chloride (6 HgO)

Vzhledem k žádané konoentraoi draslíku v médiu a protože se při kultivaoi předpokládala rovnovážná konoentraoe kvasničné sušiny 15 g.l^-1, byl zvýšen obsah draslíku v roztoku minerálníoh Živin A proti poměrnému zastoupení prvků v kvasničné biomase průměrného složení o 30 %, Protože zdroj uhlíku nebyl dávkován v závislosti na změnáeh konoentraoe draslíku v kultivačním médiu, nebylo třeba dávku roztoků minerálníoh živin limitovat.Due to the desired potassium concentration in the medium, and since the culture assumed a steady-state concentration of 15 gl ^-1 , the potassium content of the mineral nutrient A solution was increased by 30% compared to the proportion of elements in yeast biomass of average composition. the dose of mineral nutrient solutions did not need to be limited.

Vyhodnooení 24-hodlnového úseku kultivace se zjistilo, že při pokusu byl dosažen výtěžnostní koefioient 0,716 (g kvasničné sušiny z 1 g etanolu). Vyrobená kvasinky obsahovaly v sušině 56,5 % dusíkatých látek, 6,85 popele a 2,02 % draslíku.Evaluation of the 24-hour culture section revealed that a yield coefficient of 0.716 (g of yeast dry matter from 1 g of ethanol) was achieved in the experiment. The yeast produced contained 56.5% crude protein, 6.85 ash and 2.02% potassium.

Claims

1. A method of aerobic cultivation of yeasts with continuous replenishment of the nutrient content of the culture medium and the continuous determination of potassium congestion in the culture medium. The carbon source also adds to the culture medium, depending on the changes in potassium conentraination in the culture medium.

2. Process according to claim 1, characterized in that, at a pH of 4, the mineral nutrients are added to the culture medium when the conoentra of potassium in the handle falls below 110 to 100 mg.l &^lt; ^-1 > the higher cultivation pH limits the potassium concentra- tions decisive for dosing increases or decreases the dosage. decreases, for every 1 pH difference by 20 mg.l “ ¹ .

3. A process according to claim 1 or 2, characterized in that the phosphorus, potassium and microbiogenic elements are present in the mineral nutrient batch in the same ratio as in the yeast biomaae of the usual composition and that the potassium content in the batch is increased by 20 to 50%. .

4. A method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the carbon source is added to the culture medium when the potassium concentration in the medium rises by at least 25 mg.l &^lt; ^-1 >

5. A method according to claim 1, 2, 3 and 4, characterized in that a single dose of mineral nutrients may increase the potassium concentration in the medium by not more than 20 mg.l ^-1 .