CS225066B1 - Způsob výroby syřidlového enzymového preparátu - Google Patents

Description

(54)

Způsob výroby syřidlového enzymového preparátu

225 066

225 Οββ

Vynález se týká výrooy syřidlového preparátu kultivací vybraných druhů streptomycet.

Dosud se vyrábí přírodní syřidlo z telecích žaludkůj obsahujících převážně jako syřidlový enzym chymosin a z vepřových žaludků, které obsahují převážně pepsin. repsinové syřidlo lze samostatně použít jen k výrobě tvarohů a měkkých sýrů, zatímco chymosinového syřidla stále ubývá pro nedostatek telecích žaludků na trhu. Proto jsou konány pokusy a vyvíjena syřidla mikrobiální, které mají také koagulační schopnost, aniž by se zvyšovala kyselost. K pokusným výrobám mikrobiálního syřidla bylo použito řady různých mikrobů. V m rých případech byl tento vývoj ukončen, použití mikrobiálních druhů a kmenů popsáno, případně patentováno, lak je patentována výrooa syřidla mikrobiálního původu za použití dacillus subtilis, macillus megaterium, tfacillus polymy. a, mucor puscillus, mucor miehei, Dndothia parasitica, některých druhů nub z třídy 8asidiomycetes a dalších. Také u streptomycet oyly konány pokusy se získáním enzymů s koagulační aktivitou.

Nedostatkem mikrobiálních syřidel, vyrobených za použití výše uvedených mikroorganismů, je méně výhodné a převážně vyšší proteolytická aktivita oproti přírodnímu syřidlu chymosinovému, velikož proteolytická i koagulační aktivita jsou pravděpodobně realisovány jedním enzymem, je malá pravděpodODnost isolace takové mutanty, Která by i

-2 225 Οββ vykazovala podstatně zvýšenou koagulační aktivitu a naopak sníženou aktivitu proteolytickou. Nevhodná, popřípadě vysoká proteolytická aktivita, především jsou-li vytvářeny v převaze alkalické proteázy, má při výrobě sýrů za následek hořkost, špatnou konzistenci a rychlé přezrávání v distribuci.

Výše uvedené nedostatky se odstraní použitím způsobu podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivují kmeny Streptomyces rimosus, Laktoflora č. 950 a/nebo Streptomyces albogriseolus, Laktoflora č. 951 v prostředí obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku a živné soli, při teplotě 26 až 28 °c a počátečním pH 6,9 až 7,0, po dobu 24 až 144 hodin, načež se vyprodukovaný syřidlový preparát od kultivačního media oddělí a koncentrace syřidlových enzymů se zvýší například odpařením, vysolením a/nebo membránovými metodami. Případně je možno získat preparát práškový vhodným sušením, například vakuovým, kryodesikačním nebo fluidním.

Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že vyrobený syřidlový preparát má ve vhodném poměru koagulační a proteolytickou aktivitu a zajištuje vhodný rozklad kaseinových. frakcí. Koagulační aktivita získaného syřidlového preparátu i proteolytická vlastnosti jsou podobné vlastnostem přírodního syřidla ohymo sinového, získaného z telecích žaludků. Při výrobě syřidlového preparátu kmenem Streptomyces rimosus, označeným v Československé sír225 066 ce -i.ikroorganiamů Laktoflora č. 950 , a kmenem ^treptomyces albogriseolus, Laktoflora č. 951 , bylo dosaženo překvapivého zvýšeného technického účinku tím, že získaný syřidlový preparát má podobné vlastnosti jako přírodní syřidlo chymosinové a svou koagulační a především proteolytickou aktivitou zajišíuje daleko vhodnější jakost sýrů a tvarohů., než dosud známá mikrobiální syřidla.

Postup výroby syřidlového enzymového preparátu je zřejmý z následujících příkladů.

Příklad 1

a) Příprava laboratorních kultur produkčního mikroorganismu

Kmen Streptonyces rimosus Laktoflora č. 950 byl kultivován 10 dní při teplotě 28 °C na agarové půdě, obsahující ;

fíacto-yeast-extract ......... ...... 4,0 g

8acto malt-extract ........ 10,0 g glukosa ........... 4,0 g agar Oxoid No. 3..... 30,0 g destilovaná voda.............. .1 000,0 ml pH půdy oylo před sterilisací upraveno na 7,3 .

4·

225 Οββ

Vyrostlé kultury byly uchovávány při 4 °C a používány pro přípravu vegetativního inokula nejdéle po dobu 2 měsíců.

Dvoustupňová submersní kultivace kmene byla provedena na reciprokém třepacím stroji s frekvencí l_t6 Hz, tj. s 96 kyvy/min a délkou kyvu 10 cm, při 28 °C v 500 ml varných buňkách, obsahujících 80 ml tekutého živného prostředí následujícího složení:

glukosa........................10,0 g škrob rozpustný....................15,Og cornsteep /suš./ ................... 5,0g /NH₄/₂So₄ :......................3,5 g

NaCl.........................5,0 g

CaC0₃.........................5,0 g destilovaná voda . ................ 1 000,0 ml pH půdy před sterilizací bylo upraveno na 6,95.

První vegetativní generace, očkovaná inokulem z agarové kultury, byla kultivována 26 h. Druhá generace, očkovaná 4 ml kultury 1. vegetativní generace, byla kultivována 96 h.

b/ Příprava syřidlového enzymového preparátu fermentační tekutiny, získané spojením 90 paralelních submerzních kultur 2. generace, starých 96 h, bylo centrifugováno 20 min při 5 000 g. Syřidlový enzymový preparát byl isolován ze supernatantu trojstupňovou frakcionací síranem amonným p.a.:

1. stupeň: balastní bílkoviny, nemající požadovanou koagulační aktivitu, byly odstraněny vysolením síranem amonným p.a. do stupně nasycení 50 % za stálého míchání. Sraženina byla po ústa

- 5225 066 vení rovnovážného stavu, tj. po 4 h stání při 4 °C, oddělena centrifugací 20 min při 5 000 2·

2. stupeň: supernatant, zbavený v předchozím stupni balastního bílkovinného podílu, byl dále frakcionován síranem amonným do stupně nasycení 75 %. Po ustavení rovnovážného stavu byla sraženina oddělena centrifugací 20 min při 5 000 2· Získaná bílkovinná frakce byla rozpuštěna v destilované vodě, jejíž množství odpovídalo 1/50 původnímu objemu fermentační tekutiny, a roztok byl dialysován proti destilované vodě 12 h při 4 °C.

Čistý syřidlový enzymový preparát, získaný ve stupni 2, vykazoval koagulační aktivitu 6 000 Hansenových jednotek.

3. stupeň: k supernatantu, získanému předchozí frakcionací, byl přidán za stálého míchání síran amonný p.a. do stupně nasycení 100 %. Další postup byl stejný jako ve stupni 2. Výsledný čistý syřidlový enzymový preparát vykazoval koagulační aktivitu 8 300 Hans nových jednotek.

Takto připravené syřidlové enzymové preparáty po 2. a 3. stupni frakcionace, obsahující převážně kyselé a neutrální proteasy /stanoveno metodou dle Turkové a sp. Biochim.Biophys.Acta, 173: 100-111, 1969/ lze přímo použít pro výrobu sýrů.

Příklad 2 a/ Příprava kultur produkčního mikroorganismu

Kmen Streptomyces albogriseolus Laktoflora č. 951 byl kulti- : vován 10 dní při teplotě 28 °C na aaarové půdě stejného složení jako v příkladu 1.

225 Οββ

Dvoustupňová submersní kultivace kmene probíhala při 28 °C na rotačním třepacím stroji při 220 otáčkách za jednu minutu s 5 cm excentritou v 500 ml varných baňkách, obsahujících 80 ml Z 3 produkčního živného media, a ve fermentoru 50 dm . Fermentor byl vybaven membránovým distributorem vzduchu, lopatkovým míchadlem a mechanickým odpěňovačem. Vzdušnění bylo nařízeno na 0,5 až 0,75 WM a počet obrátek v počáteční fázi na 150, později na 300 za 1 minutu. U obou stupňů kultivace mělo produkční živné medium následující složení:

sacharóza ................ 55,0 g corn steep 55 %........ 8,4 g melasa.......................2,5 g sojová mouka.................... 34,0 g

NaCl..... 2,5 g

CaC0₃....... 9,0 g /NH₄/₂SO₄ ....... ............... 6,5 g

MnS0₄ . 4 H₂0 . . ....... 30,0 mg

ZnSO₄ . 7 H₂0 . . . . .... . . . . ... . . . . . 20,0 mg

MgSO₄ . 7 H₂0 .... . . .............. 50,0 mg

CoCl₂ . 6 H₂0 . . ................. 3,0 mg destilovaná voda .................1 000,0 ml pH půdy před sterilizací bylo upraveno na 6,9.

První vegetativní generace, očkovaná inokulem z agarové kultury, byla kultivována 24 hodin, druhá 96 hodin.

b/ Příprava syřidlového enzymového preparátu

Fermentační tekutina, získaná z fermentoru 50 dm , byla ihned po 96 hodinové kultivaci odstředěna na odstředivce při

-1225 086

000 2 P° dobu 30 minut. Získaný supernatant byl zahuštěn v odparce na jednu pětinu svého původního objemu.

Získaný syřidlový enzymový preparát obsahoval koagulační aktivitu 6 000 Hansenových jednotek.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   225 OBB

   Způsob výroby syřidlového preparátu, vyznačený tím, že se kultivují kmeny Streptomyces rimosus, Laktoflora č. 950 a/nebo Streptomyces albogriseolus, Laktoflora č. 951 v prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku a dusíku' a živné soli, za aerace, při teplotě 26 až 28 °C a počátečním pH 6,0 až 7,0 po dobu 24 až 144 hodin, načež se vyprodukovaný syřidlový preparát od kultivačního media oddělí a koncentrace syřidlových enzymů se zvýší, například odpařením, vysolením a/nebo membránovými metodami.