CS223475B1 - Způsob zvýšení aktivity buněčných enzymů - Google Patents

Abstract

Vynález,se týká způsobu zvýšení aktivity buněčných enzymů, který spočívá v tom, že se buněčná stěny částečně rozruší. Částečná destrukce buněčných stěn se provede oxydativním štěpením sacharidové složky buněčné stěny, s výhodou působením kyseliny jodisté jodistanovými ionty v množství 0,025 až 0,5 rarnolů na 1 g vlhkých buněk při pH 4 až 8 po dobu 1 až 24 hod. Takto aktivivané buňky se používají k přípravě imobilisovaných preparátů u nichž se dosahuje takto vyšší aktivity enzymů, než u původních nativních buněk.

Description

Vynález se týicá způsobu zvyšování aktivity buněčných enzymů.

Enzymových systémů buněk je v největší míře dosud využíváno v technologiích potravinářského průmyslu. V poslední době však dochází k prudkému rozvoji biotransformací i v organické chemii, kde se začínají čím dál více uplatňovat i mikrobiální transformace. Význam a možnost využití enzymových systémů buněk výrazně vzrostl ve spojení s jejich imobilisací. Použitím imobilisovaných buněk je odstraněna velmi obtížné isolace produktu z reakční směsi, přičemž aplikovaný biokatalysator může být opakovaně použit. Využití enzymových systémů buněk k biochemickým transformacím může být dále zvýhodněno podle vynálezu zvýšením aktivity na biotransformací se podílejících enzymů

Způsob zvýšení aktivity buněčných enzymů podle vynálezu» spočívá v tom, Že se na polysacharidy obsažené v buněčné stěně působí jodistanovými ionty v množství 0,025 až 0,5 mmolů na 1 g vlhkých buněk při pK 4 až 8 a teplotě 0 až 50 °C po dobu 1 až 24 hod. Doba, po kterou dochází k jodistanovému štěpení pólysacharidů, je nepřímo úměrná koncentraci jodistanových iontů.

Výhoda uvedeného způsobu zvýšení aktivity buněčných enzymů spočívá v šetrnosti a experimentální jednoduchosti použité metody, při níž si upravené buňky ponechávají ve srovnání s protoplaety potřebnou stabilitu vůči změnám osmotíckého tlaku i mechanickým vlivům. Protoplastů se používá ke studiu jejich vlastností a možnosti křížení kmenů. Příprava protoplastů s ohledem na zvýšení enzymové aktivity nebyla popsána vzhle dem k mechanické nestabilitě protoplastů a náročnosti jejich přípravy.

- 2 223 475

K částečné destrukci či úplnému odstranění buněčných stěn /za vzniku sferoplastů nebo protoplastů/ je převážně používáno lytických enzymů. Pro tvorbu bakteriálních protoplastů se běžně používá lysozymu, tj· enzymu specificky katalysujícího hydrolysu β -l->4 glykosidové vazby mukopeptidových jednotek bakteriálních buněčných stěn. Pro přípravu kvasinkových protoplastů se nejčastěji používá komplexu enzymů ze žaludečních šťáv hlemýždě Helix pomatia. Vedle těchto dvou nejběžněji používaných enzymových preparátů existuje řada dalších lytických enzymů, převážně mikrobiálního původu. K destrukci buněčných stěn byla použita též chemická činidla, tvorbu buněčných st^n negativně ovlivňuje přítomnost některých antibiotik. Vzniklé prctoplasty zůstávají zachovány pouze v prostředí o vhodném osmotickém tlaku, jinak cytoplasmatická membrána praská a dochází k úplné lysi buněk.

Výhoda způsobu zvýšení aktivity buněčných enzymů podle vynálezu spočívá v šetrné parciální destrukci buněčných stěn oxidativním štěpením polysacharidů obsažených v buněčných stěnách kyselinou jodistou, respektive jodistanovými ionty. Na 1 g vlhkých buněk se používá 0,025 až 0,5 mmolů jodistanu sodného při teplotě 0 až 20 °C.

částečně rozrušené buňky si penechévají potřebnou stabilitu vůči změnám osmotického tlaku i mechanickým vlivům za současného zvýšení enzymatické aktivity.

Vynález je dokumentován příklady použití.

Příklad 1

Buňky Saccharomyces cerevisiae kultivované v kompletním mediu se sacharosou a glukosou byly po odstředění promyty 0,05 K fosfátovým pufrem pH 6,5. K odstředěným buňkám o invertasové aktivitě 29 nkat/g vlhkých buněk /stanoveno Somogyiho metodou/ byl přidán 0,05 M acetátový pufr pH 6,5 v poměru

12,5 ml na 1 g vlhkých odstředěných buněk /v/w/ a 0,05 lí jodistan sodný /1:1, v/w/. Směs byla třepána 6 h při 4 °C za nepřístupu světla.

- 5 223 475

U oxidovaných buněk Saccharomyces cerevisiae byla po odstředění a promytí 0,05 M fosfátovým pufrem pH 6,5 stanovena invertasová aktivita 115 nkat/g vlhkých buněk·

Příklad 2

Buňky Streptomyces nigrificans kultivované v mediu s xylo· sou a glukosou byly po odstředění promyty0,05 M fosfátovým pufrem pH 6,9· K odstředěným buňkám o isomerasové aktivitě 149 nkat/g vlhkých buněk /stanoveno cystein-karbazolovou metodou dle Dische a Borenfreunda/ byl přidán 0,05 ti fosfátový pufr pH 6,9 v poměru 12,5 ml na 1 g vlhkých odstředěných buněk /v/w/ a o,05 K jodistan sodný /2:1, v/W/. Směs byla třepána 6 h za nepřístupu světla.

U oxidovaných Duuěk Streptomyces nigrifikana byla po odstředění a promytí 0,05 M fosfátovým pufrem pH 8,5 stanovena gluxosa isomerasová aktivita 241 nkat/g vlhkých buněk.

Příklad 5

K oxidovaným buňkám Saccharomyces cerevisiae připravených podle příkladu 1 byla po promytí 0,05 U fosfátovým pufrem pH

6,5 a odstředění přidána lOStaí želatina v tomtéž pufru v poměru 20 ml roztoku želatiny na 1 g vlhkých buněk /v/w/. Za intensivního míchání byl ke směsi přidán 5%ní vodný roztok glutaraldehydu /5:1, v Au/. Po zapolymerování byly imobilisované buňky důkladně promyty 0,05 M fosfátovým pufrem pH 5,0. Somogyiho metodou byla stanovena jejich invertasová aktivita 54 nkat/g vlhkého preparátu.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob zvýšení aktivity buněčných enzymů, vyznačující se tím, že se na polysacharidy obsažené v buněčné stěně působí jodistanovými ionty v množství 0,025 až 0,5 mmolů na 1 g vlhkých buněk při pH 4 až 8 a teplotě 0 až 50 °C po dobu 1 až 24 hod.