CS223461B1 - Tyčinka pre diagnostiku leukémie a spósob jej přípravy - Google Patents

Description

• 1 - 223 481

Vynález sa týká tyčinky pře diagnostiku leukémie a inýchonemocnění a spdsobu jej přípravy·

Leukóza hovadzieho dobytka sa šíři ako infekčná chorobav stádach· Chorobu spdsobuje virus· Krátko po infekci! zvieratvírusom sa v sérach postihnutých zvierat vyskytujú protilátkyproti tomuto virusu· Táto skutočnost je základem pře vačšinuvčasných diagnostických metod bovinnej leukózy·

Doteraz sa diagnostikuje bovinná leukóza niekolkými spd-sobmi· Hematologicky sa zistuje len pokročilý stav choroby,nie je to metoda včasnéj diagnostiky /Černý L·, Závada J·,Altaner Č., Pravda D. a Volejníčekí Veterinářství 28, 15Ρ-153»/1978//· Ďalší spdsob hojné užívaný je detekčia protilátok protivirusu metodou imunoprecipitácie v agare· Tento spdsob je málocitlivý a dokazuje len zvieratá s vysokým obsahom protilátok/Mammerickx M·, Portetelle D·, Kettmann R·, Chysdael J·, BurnyA·, Dekagel D., Europ. J. Cancer 12, 433-439 /1976/7· Novšiespdsoby ako séroneutralizačný test využívájúci VSV (BLV) pseudo-typy /Závada J·, Černý L·, Závadová Z·, Božonová J. a Altstein A.D., J. Nati· Cancer Inst. 62, 95-101 /1976/7 a rádioimunolo-gické spdsoby detekcie protilátok v sére sú spdsoby vysoko,citlivá a preto vhodné pre včasnú diagnostiku fi&vy D·, Des-hayes L·, Parodi A.L. a Levý J.P.·, Int. J. Cancer 25; 147-152/1980/ a Zajac V·, Altaner Č·, Závada J·, černý L·, Neoplasma.27; 517-523 /1980/7· Majů však niekolko nevýhod. Séroneutrali-začný test vyžaduje virologické laboratórium s možnostou ste-rilně j práce, rádioimunologické metody vyžadujú laborátoriaa pracovníkov oprávněných pracovat s rádioizotopmi a nákladnépřístroje na meranie radioaktivity. a

Uvedené nevýhody odstraňuje tyčinka pre diagnostikuleukémie a iných onemocnění, ktorej podstata spočívá v tom,že je vytvořená z umelej hmoty, například z polystyrénu a jejpovrch je potiahnutý antigénom, například ďezintegróvaným ma-teriálom virusu bovinnej leukózy· Podstata spdsobu přípravytyčinky pre diagnostiku leukémie a iných onemocnění spočíváv tom, že na tyčinku z umele j hmoty napr.polystyrénu, siliko-nové j gumy sa naadsorbuje v prvom stupni antigén pri teplote4 až 37°C v priebehu 2 až 18 hodin a v druhom stupni sa povrch - 2 - 223 «1 aktivněj časti tyčinky saturuje roztokom želatiny v pufrovacomroztoku například 0,02 M 2-am±no-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-hydrochloride pri pH 7,6. Výhoda vynálezu spočívá vo vysokej citlivosti a Specifič-nosti a v možnosti spracovaí velké množstvo vzoriek. Nie súpotřebné žiadne nákladné přístroje, odstraňuje sa práca s rá-dioizotopmi, spdsob přípravy je ekonomicky nenáročný na mate-riál a dá sa prevádza£ aj v terénnych podmienkach.

Tyčinky pre diagnostiku leukémie a iných onemocnění sú schop-né Specificky viazaí protilátky proti virusu bovinnej lakozyvo vyšetřovaných sérach. Detekcia a vizualizácia týchto proti-látok sa prevádza pomocou konjugátu antihovadzieho gamaglobu-línu s peroxidázou. Diagnostická tyčinka v sére leukemickýmvírusom infikovaných zvierat sa zafarbí na hnedo-červeno, za-tial čo v sére zdravých jedincov zostáva nezmenená.

Vynález má použitie nielen na stanovenie protilátok 'proti bovinnej leukóze, ale sa dá využit na stanovenie proti-látok, antigénov, biologicky aktívnych íátok v humaánnej me-dicíně napr. na diagnostiku hepatitídy B, A, najrozličnejšíchparazitárnych onemocnění, stanovení hormonov a vo veterinámejmedicíně napr. na diagnostiku tuberkulózy, brucelozy, infekčnejanémie koní, moru prasiat a pod. Aplikácia spočívá len v záměněantigénu či protilátky, ktorá je naadsorbovaná na diagnostickútyčinku. Přikladl

Na tyčJnku z umelej hmoty, výhodné z polystyrénu sa na-viaže dezintegrovaný materiál virusu bovinnej leukózy pri 4°Cpočas 18 hodin.

Neobsadené adsorpčné skupiny sa potom saturuju 0,25#roztokom želatiny v 0,02 M pufri 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-hydrochloride pri pH 7,6. Příklad 2

Na tyčinku z umelej hmoty sa na viaže bakteriálny anti-gén pri teplete 57°C po dobu 2 hodin. Neobsadené adsorpčnémiesta sa saturuju 0,5# roztokom bovinného sérum albuminu -3- 223 461 v 0,02 M pufri 2-amino-2-hydroxymethy1—1,3—propandiol-hydrochlo-ride pri pH 7*6* Příklad 3 Áko zdroj virusu slúžia buňky kultivované in vitro v tka-nivových kulturách, ktoré produkujú virus bovinnej leukózy domédia. Virus z média sa koncentruje a purifikuje ultracentrifu-gáciou na sacharozových gradientech.

Testované séra zvierat podozrivých z nákazy vírusom bo-vinnej leukózy sa nariedia 1:10 s 0,2 M pufri 2-amino-2-hydroxy-methyl-l,3-propandiol-hydrochloride pri pH 7,0 s prídavkomzmáčadla (p-isooktylfenoxypolyepoxyetanol). Do takto nariedenéhoséra sa ponoria diagnostické tyčinky anechajú sa pri laborator-ně j teplote 2 hodiny alebo 1 hodinu pri 37°C. Tyčinky sa opláchnuv 0,02 M pufri 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-hydrochlo-rid pri pH 7,0 s 0,05 jí (p-isooktylfenoxypolyepoxyetanol) premý-vací pufer v troch premývacích krokoch po 1 minuté. Opláchnutétyčinky sa ponoria do konjugátu antihovadzieho gamaglobulínus peroxidázou, kde sa ponechájú 2 hodiny pri teplote miestnosti.Tyčinky sa znovu premývajú rovnakým spósobom v premývacom pufria potom přenesu do roztoku chromogénneho substrátu, ktorý sapřipraví tak, že sa 2 mg 3-amino-9-etylkarbazolu v 1 ml dimetyl-formamidu a přidá sa 4 ml 5 mM acetátového pufru pH 5,0. Bez-prostředné před reakciou sa do roztoku přidá 15 ml 3 jí peroxiduvodíka.

Vyvolávanie farebnej reakcie na povrchu diagnostickéjtyčinky trvá 5 až 10 minut s možnostou vizuálněj kontroly ty-činiek s kontrolným pozitívnym a negativným sérom. Reakcia sazastaví buS opláchnutím tyčiniek vodou alebo přidáním 10 ml1 jí azidu sodného do reakčnej zmesi. Výsledok testu sa. hodnotívizuálně. Diagnostické tyčinky v sére leukózovým vírusom infi-kovaných zvierat sa zafarbí na hnedo-červeno, zatial čo v sérezdravých jedincov zostáva nezmenené. řre případné kvantitativné stanovenie ti tra protilátokje možné farebný komplex na tyčinke rozpustit v etanole a faí-rebný roztok merat spektrofotometricky pri 450 nm.

Claims (2)

-4 - 223 «1 Uvedená diagnostická tyčinka sa dá využil taktiežpři diagnostike iných onemocnění ako napr. toxoplazmoza ana stanovenie iných chorob spósobených baktériami a vírusmi. P R E DME T VYNÁLEZU

1. Tyčinka pre diagnostiku leukémie , vyznačujúca sa tým,že Je vytvořená z umelej hmoty,například z polystyrénu a jej povrch je poťiahnutý antigénom, například dezinte-grovaným materiálom virusu bovinnej leukózy.

2. Spdsob přípravy tyčinky podlá bodu 1 vyznačujúci satým, že sa na tyčinku z umelej hmoty například poly-styrénu alebo silikonovéj gumy naadsorbuje v prvomstupni antigén pri teplote 4 až 37° C v priebehu 2 až 18 hodin a v druhom stupni sa povrch aktivněj častityčinky saturuje roztokom Želatiny v pufrovacom roztokunapříklad. 0,02 M 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol--hydrochloride o pH 7,6.