CS223118B1 - Sposob kvantitativné;} anylýzy obsahu stopových množstiev herbicídov - Google Patents

Description

223 118

Vynález sa týká sposobu kvantitatívnej analýzy obsahu her-bioídov, inhibujúcich Hillovou reakciou·

Rozsiahle používanie pesticíďov a narastajúci počet kombino-vaných prípravkov s rožnou strukturou účinných látok vyvolává stá-le naliehavejšiu potřebu analyzovat rezíduá týchto multizložkovýchzmesí v zložká<jh životného prostredia· V posledných desaťročiaohnašli široké uplatnenie v boji proti burinám najma selektívne her-bicidy zo skupiny substituovaných triazínov a derivátov močoviny·Pri hodnotení rizika z kontaminácie životného prostredia vystupu-je do popredia aj problematika stanovenia stopových množstiev týchto herbicídnych zmesí vo vodách, pode, připadne v rastlinnom orga-nizme. Velmi dóležité je tiež poznanie hladiny perzistentných her-bicídov před sejbou následných kultúr, voči ktorým tieto herbici-dy majú velmi malú, alebo žiadnu selektivitu· Najma pri používa-ní niektorých perzistentných triazínových herbicídov v kukuřici móže dójsť vplyvom nepriaznivých klimatických podmienok, kedy roz-klad účinnej látky bývá velmi spomalený, k podstatnému zníženiuvýnosov pri následných obilninách· V případe včasného zistenia zvýšenej hladiny herbicídov v pode možno včas změnit osevný programz aspektu selektivity příslušných herbicídov· Pre tento účel tře-ba mať k dispozícii analytičku, metodu s velmi nízkou medzou stano-venia hladiny rezidui herbicídov v pode, bezprostredne před sej-bou následných kultúr. Analytický postup musí byť rýchly /ide vždy v o velký počet analyzovaných vzoriek pódy/, ale zároveň aj jedno-duchý a přístrojové nenáročný, aby sa analýzy mohli uskutočniť ru-tinně aj v podmienkach okresných polnohospodárskych stanic· Medzoustanovenia a presnosťou sa musí vyrovnat modemým metodám inštru-ment álnej analýzy·

Na stanovenie herbicídov v životnom prostředí sa prevažne používajú metody chromátografické, z ktorých najma metody plynovejchromatografie sú velmi náročné na drahé přístrojové vybavenie, vyžadujú špeciálne, selektívne detektory, inqaortované zo zahraničia - 2 223 118 a zvlášť zaškolené kádre. Všetky tieto metody vyžadujú predbež-nú separáelu rušiacich koextraktov, čo značné predlžuje analytic-ký postup a ovplyvňuje přesnost stanovenia. V posledných rokoch boli zverejnené povodně analytické postu-py /Kováč J., Henselová U. s J.Chromátogr·, 133. 420-422, /1977/,Kováč J., Henselová M·: Photosynthetica, 10, 343-344, /1976/, Sack-mauerová M., Kováč J.: Z.Anal.Chem., 292, 414, /1978/, Kováč J.,Henselová M., Sackmauerová M.: Agrochémia, 1, 20-22, /1980/ na se-mikvantitatívne stanovenie rezidui herbicidov v životnom prostře-dí, ktorých mechanizmus účinku spočívá v inhibíoii Hillovej reak-cie. Metoda je jednoduchá, má potřebná selektivitu a medzu stano-venia· Bola úspěšně použité na stanovenie reziduí linuronu v ze-mi akoch a zme /Lawrence J.P., J.A.O.A.C., 63 , 758-761 /1980//,ako aj pri studiu metabolizmu herbicidov v rastlinnom organizme. Táto metoda napriek svojim přednostiam, poskytuje iba semi-kvantitatívne výsledky.

Teraz sa zistllo, že kvantitativná analýza obsahu stopovýchmnožstiev herbicidov, inhibujúcich Hillovou reakciou, je možná spo-sobcm podlá vynálezu.

Pri tomto stanovení sa využívá poznatek, že aj izolované chlo-roplasty sú schopné „in vitro fotolýzou rozkladať vodu na pří-slušné redukčné ekvivalenty a kyslík. Potolytickú aktivitu ohloro-plastov možno teda vyjadriť mierou redukcie vhodného akceptoraelektrónov, ktorá sa. prejaví farebnou změnou příslušného redox -- systému. Účinkom přítomného herbicidu dochádza k inaktivácii chloroplastov, ktorej rýchlosť je závislá od inhibičnej aktivity a kon-centrácie příslušného herbicidu. Vysoká dókaznosť a selektivitatejto biochemickej detekcie spočívá v samotnom mechanizme zviditel-nenia přítomných herbicidov vo formě kontrastných modrých zón nažltozelenom pozadí, po ich rozdělení chromatografiou na tenkej vratve.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že vzniknutá tmavomodrá in-hibičná zóna účinkom světla vymizne, pričom čas vymiznutia inhibič-nej zóny sa vynesie do kalibračněj křivky ako závislost času vymiz-nutia inhibičnej zóny od koncentrácie herbicidu a stanovovaný ob-sah herbicidu sa žistí odčítáním z takto zostrojenej křivky. Výhody stanovenia sposobom podlá vynálezu spočívajú hlavněv tom, že reprodukovatelnosť tejto chronometrickej metody je na ú- 223 118 3 rovni plynovéj chromátografie, pričom rušivý vplyv koextrahova-ných balastov je podstatné nižší. Metodu možno použiť na stano-venie stopových množstiev herbicídov - inhibítorov Hillovej reak-cie - vo všetkých zložkách životného prostredia, ako aj na kvan-titativné hodnotenie inhibície Hillovej reakcie jednotlivými sub-stanci ami připadne ich zmesami. Metodu je možné použit aj pri ana-lýze finálnych produktov herbicídnych prípravkov, ktorých mecha-nizmus fytotoxického účinku spočívá v inhibovaní Hillovej reakcie. Příklady sú znázorněné na přiložených výkresoch, kde obr, 1je závislosťou času vymiznutia inhibičnej zóny od koncentrácie me-toxuronu, obr. 2 je závislosťou času vymiznutia inhibičnej zónyod koncentrácie terbutylazínu a obr. 3 je závislosťou času vymiz-nutia inhibičnej zóny od koncentrácie linuronu. Na osi x je kon-centrácia nanášaného roztoku příslušného herbicidu vyug · om"^a na osi χ čas vymiznutia inhibičnej zóny v sekundách.

Nasledujúce příklady ilustrujú, ale neobmedzujú predmet vyná-lezu. Příklad 1

Kvatitatívna chronometrická analýza obsahu N-/3-chlór-4-metoxy-fenyl/-N’, N’-dimetyl močoviny /metoxuron/.

Použité chemikálie a rozpúšťadlá boli p.a.. Rozpúšťadlá bolipřed použitím predestilované. Použité Standardy boli od Póly Scienoe Corporation Chemical Division, Analytical standarde. Příprava homogenátu ohloroplastov 50 g listov 14-dňovej fazule /Phaseolus vulgaris L.ev. Hare-grus/ vypestovanej v skleníkových podmienkach sa po umytí desti-lovanou vodou a vysušení medzi vrstvami filtračného papiera zho-mogenizovalo v mixér! do kašovitéj konzistencie. Přidalo sa 25 gladu z destilovanej vody, 5 cm^ glycerínu a ešte 1 min. sa homoge-nizovalo. Eomogenát sa přefiltroval vytlačením oez 4 vrstvy gázya uskladnil v tmavěj nádobě v chladničke pri teplote 1 až 2 °C.Takto připravený homogenát má počas 5-tich dní skladovania zacho-vaná inhibičnú aktivitu. Příprava roztoku redox-indikátora /sodnéj soli 2,6-dichlórfenolin-dofenolu/.

Do 250 cm^ fosfátového tlmivého roztoku s hodnotou pH 8,5 sa 223 118 přidalo 100 mg sodnéj soli 2,6-dichlórfenolindoíenolu a za mi»-šania sa zohrieval pri teplote varu 30 minut. Po oohladení na la-boratómu teplotu sa roztok přefiltroval a uložil do chladničkypri teplote 1 až 2 °C. Příprava detekčného skúmadla.

Detekčně skúmadlo sa připraví tesne před použitím intenzív-ným premiešaním homogenátu chloroplastov a roztoku redox-indiká-tora v objemovom pomere 1:2.

Chromátografia. na tenkých vrstvách.

Použité boli komerčně vrstvy SILUPOL /kysličník křemičitý/ 20 x 20 cm. Před použitím boli vrstvy premyté vyvíjením v aceto-ne s 0,5 %-ným obsahom vody. Po odpaření acetonu pri laboratornějteplote sa na start chromatogramu nanieslo kapilámou mikropipe-tou 2,5 mm^ roztokov metoxuronu v rozpatí od 3 do 9 jug . cm“3 a ana-lyžovaný roztok metoxuronu v koncentrácii 5,5 ^ug · cm , Chroma-togram bol vyvíjaný v sústave chloroform : octan etylový : aceton, 85 : 10 : 5 obj.. Po odpaření mobilnej sústavy volné na vzduchubol chromatogram vo zvislej polohe postriekaný detekčným skúmad-lom tak, aby tenká vrstva bola dostatočne a rovnoměrně zmáčaná,ale aby roztok nestékal. Chromatogram bol potom exponovaný zdrojůsvětla s tromi žiarivkami /3 x 40 W/, vo vzdialenosti 25 cm tak,že chromatogram bol uložený rovnoběžně s rúrkovými žiarivkami, abyosvetlenie bolo rovnoměrné. Pomocou stopiek sa zaznamenal čas, ke-dy vzniknuté tmavomodré inhibičné zóny zmizli, t.j. ich sfarbeniesa vyrovnalo so žltozeleným sfarbením pozadia. /Začiatok meraniačasu nie je podstatný, ale musí byť rovnaký pri všetkých zónách najednej tenkej vrstvě/. Do kalibračnej závislosti sa naniesli časzmiznutia zóny proti príslušnej koncentrácii herbicidu. Z času tr-vania zóny analyzovanej vzorky sa interpoláciou z kalibračnej zá-vislosti odčítala příslušná koncentrácia herbicidu vo vzorke. Přes-nost metody bola vyhodnotená statisticky z 10-tich analýz : - pomocou regresných koeficientov, ktoré v percentách vyjadrujúpravděpodobnost s akou body kalibračnej závislosti ležia na priam-kej - aritmetickým priemerom koncentrácie vzorky 5 ; - smerodajnou odchýlkou s ·

Pre metoxuron sú hodnoty regresných koeficientov v rozpatí od 92,42 do 99,73 % ; aritmetický priemer X = 5,659. cm“^ , 223 118 5 smerodajná odchylka s = O,O95^ug · cnf\ Z obrázku 1 je zřejmý lineárny priebeh závislosti Sasu t, vymiznutia inhiblčných zón v sekundách od koncentráole 1 metoxu--3 ronu v ^ug · cm · Příklad 2

Kvantitativná chronometrická analýza 2-etylamino-4-ohlór-6-tero·butylamino-l,3,5-triazínu /terbutylazln/ na tenkej vrstvě SILU-POL, po detekci! technikou inhibície Hillovej reakcie·

Postup přípravy detekčnáho skumadla a analýzy vzorky je to-tožný s príkladom 1. Ha zostrojenie kalibračnej závislosti bolipoužitá roztoky terbutylazinu v acetone, v rozpátí konoentráciíod 0,5 do 4,0.^ug · cnT^ a roztok vzorky terbutylazinu s konoentrá-ciou 2,25^ug · om“\

Hodnoty regresných koeficlentov boli v rozpátí od 96,92 do 99,89${aritmetický priemer x =» 2,384 ^ug · cm*^jsmerodajná odchýlka a « O,O45/ug · οπί“\ Z obrázku 2 je zřejmý priebeh závislosti času £ vymiznutiainhiblčných zón v sekundách od koncentrácie 1 terbutylazinu v^ug · • cm~\ Příklad 3

Kvatitatívna chronometrická analýza velmi zriedenáho roztoku/0,09/ug · om"^£ N-/3,4-dichlórfenyl/-N’-metoxy-N’-metylmočovi-ny /linuron/ na tenkej vrstvě SILUPOL technikou inhibície Hillo-vej reakcie·

Pre mimoriadne nízké koncentrácie použitých roztokov bole na-nášanie na tenkú vrstvu 10 krát po 2,5 mm^ tak, aby vznikli rovna-ko velká zóny. Ďalší postup analýzy vzorky a přípravy detekčnáhoskúmadla bol totožný s príkladom 1·

Rozpatie regresných koeficientov bolo od 97,63 do 99,71 >aritmetický priemer x = 0,0922^ · cm*^>smerodajná odchýlka s a 0,0009^ug · cn"\ Z obrázku 3 je zřejmý lineárny priebeh závislosti času £ vymiznutia inhiblčných zón v sekundách od koncentrácie 1 linuro--3 nu v^ug . cm 6 Příklad 4 223118

Kvantitativná chronometrická analýza linuronu v rašelinovej pode.

Postup přípravy detekčného skúmadla, analýzy vzorky a Statis-tického vyhodnotenia bol totožný s príkladom 1.

Na extrakciu bola použitá rašelina v množštve odpovedajúoom 10 gsušiny, 60 cm·* vody a 240 cm^ acetonu. Po filtrácii sa o do bral o100 cm^ extraktu, aceton sa odpařil za zníženého tlaku a vodný roztok sa extrahoval 2 x 30 cnP chloroformu. Spojené chloroformovéextrakty sa odpařili do sucha a zvyšok sa rozpustil v 1 onP aceto-nu. Na tenkú vrstvu bolo nanášené po 2,5 mm^ roztoku vzorky a štandardnýoh roztokov linuronu v rozpatí od 0,1 do 0,5^ug · cm"^ v aoetóne.

Rozsah regresnýoh koeficientov bol od 99,57 do 100 aritmetický priemer x = 6,417 · 10 mg · kg i«*1 smerodajná odchýlka s a 1,11 · 10"p mg · kg . Příklad 5

Kvatitatívna chronometrická analýza prometrynu /2-metyltio-4»6--bis-izopropylamino-s-triazín/ v rastlinnom materiáli /mrkva/. 3 100 g mrkvy sa zhomogenizovalo a 25 cnr tlmivého roztokupH 7>5 v elektrickom raixéri. V modelovom pokuse sa přidalo 0,1^ugprometrynu do kašovitéj zmesi, ktorá sa dokonale premiešala so70 g SI10XIDU /aktivovaný zrážaný oxid křemičitý/ a vnieslo sa dokolony /4»5 x 80 cm/. Štipec sa eluoval 500 cnP petroléteru /fr.t.v. 35 - 65 °0/ rýchlosťou prietoku 5 cm^ · min."\ Eluát saza zníženého tlaku zahustil na 200 cm^ a pretrepal v deliacom lie-viku s 3 x 70 om^ kyseliny chlorovodíkovéj, /Cjjci " θ»1Spojené vodné vrstvy sa zneutralizovali roztokom hydroxidu sodné-ho na pH cca 7 a extrahovali 2 x 100 cm^ petroléterom. Petrolétersa za zníženého tlaku a t = 30 °C odpařil právě do sucha, odparoksa rozpustil v 1 cm^ acetonu p.a. destilovaného, roztok sa prúdomzahustil na objem 0,1 cm\ Postup pri príprave detekčného skúmadlaa analýze vzorky bol totožný s príkladom 1 5 na zostrojenie kali-bračnej závislosti sme použili roztoky prometrynu.

Ohronometrickou analýzou bolo stanovené v modelovom pokuse po od-počítaní hodnoty kontroly 0,129^ug prometrynu.

Claims (1)

1. 223 118 -7- PRBDUBT VXN/L. 1ZV . Sposob kvantit atívnej analýzy obsahu stopových množstievherbicídov inhibujúcioh Hillovu reakciu chromátográficky na ten-kej vrstvě, nanesením roztoku herbicidu so známými koncentrácia-mi, po vyvíjení v mobilněj fáze a po jej následnom odpaření, popostriekaní chromátogramu detekčným skúmadlom, pozostávajúcimzo zmesi homogenátu chloroplastov a roztoku sodnéj soli 2,6-di-chlorfenolindofenolu, vyznačujúci sa tým, že.po ukončení chroma-tografie sa ohromatogram podrobuje účinku viditelného světla aždo vymiznutia tmavomodrého sfarbenia inhibičnej zóny, pričom časpotřebný pre toto vymiznutie sfarbenej inhibičnej zóny je priamoúměrný koncentrácii stanovovaného herbicidu.