CS218890B1

CS218890B1 - Způsob izolace neutrálních proteáz

Info

Publication number: CS218890B1
Application number: CS402379A
Authority: CS
Inventors: Manfred Kuhn; Peter Mohr; Jiri Coupek; Barbara Neumann
Original assignee: Manfred Kuhn; Peter Mohr; Jiri Coupek; Barbara Neumann
Priority date: 1978-07-03
Filing date: 1979-06-08
Publication date: 1983-02-25
Also published as: DD142272A3

Abstract

Vynález se týká chromatografické izolace neutrálních proteóz obsahujících zinek použitím nových nerozpustných, nosičů. Proteózy oddělené těmito nosiči se používají v oblasti lékařství,v potravinářském průmyslu a v průmyslu nápojů.Izolace se provádí tak,Že se slabě zásadité roztoky obsahující neutrální proteázy,uvádějí do styku s heterocyklickými nosiči,přičemž heterocykly obsahují nejméně jeden endocyklický terciární dusíkový atom s volným elektronovým párem.Za účelem oddělení jiných proteinů se provádí eluce tlumivými roztoky vyšší iontové síly a ve slabě alkalickém prostředí a neutrální zinek obsahující proteázy se eluují ve slabě kyselém prostředí.Dialýza se provádí pomocí C,1 % roztoku octanu vápenatého

Description

- 1 - 218 890 CIIOCQB BbUaJifiHiaa HEgTPAJIBHHX ΠΡ0ΤΕΑ.3 O Π H C a Η Η 8 OQjiaCTb ΠΡΜΜβΗΘΗΚΒ H30dpeTeHHfl ΜβούρβτβΗΗβ othocmtch κ xp0MaT0rpa$HqecK0uy cnocody Bbixe-JieHHH HeílTpaJiiHbix UHHKOcoxepstamHx npoTea3 πρπ ηοπολβ30βοημμ He-pacTBopHUiix HOCHTeJiefl. BhmeJieHHue c πομοιιιβμ sthx HOCHTejieij Heří-TpaJitHue miHKCOsepjKatuHe npoTea3u MoryT πρμμθηητβοη b MeswíHHe,ΠρΟΜΗΠΙΛβΗΗΟΟΤΜ ΗΜΠξβΒΗΧ npOflyKTOB H HanHTKOB.

XapaKTepHCTHKa Μ3βθοτηηχ tsxhhhsckmx pemeHHfl ÍIpOTea3H, KOTOpue ΠρΟΗΒΛΗίΰΤ eso» liaKCHMaflBHyíO aKTHBHOCTBΠρΗ pH-3Ha^eHHM ΟΚΟΛΟ 7 Η ΛΛΑ aKTHBHOCTH KOTOphlX C^UieCTBeHHO co-sepjsaHHe umnca, πρηηηοληϊοτοη k HefíTpantHUM προτββββΜ. Εολη bKaHBHeUmell qacTH βτογο οπηοηηηη γοβορητοη o ΗβϋτρβΛΒΗκχ npoTea-3ax, TO ΠΟΛ HHMH nO£pa3yiieBaiOTCfl, TaKHM, 0dpa30M, τολβκο sth,UHHKCOAepjKaiHHe, Η0ίξ3ΒΛΗΘΜΒΙβ Odpa3yiOlIlHMH ΜβΤ3ΛΛΗΗ60ΚΗ6 xeaaTHareHTaMH, ΚβΚ E$TA OH 0-φθΗ3ΗΤρ0ΛΜΗ ΗΘΜΤρβΛΒΗΗβ npoTea3bi. OHM BNpadaTHBaiOTCfl pa3HHHHHMH ΜΗΚΡ00ρΓ3ΗΗ3Μ3ΜΗ H B COCTOH“HHH pa3pjUiaTB ΖΗΛρΟΛΗΤΜτίβΟΚΗ 0ΟΛββ ΒΗΟΟΚΟΜΟΛΘΚ^ΛπρΗΒΙΘ ΠΘΠΤΗΛΗ ΗΠρΟΤβΗΗΒΙ, πρκ φΗ3ΗΟΛΟΓΗτΐβΟΚΗΧ yCflOBHHX, ,ΙξΟ donee HH3K0M0H6KyΛΗΡ“hux tíacT90. Μχ ββιλθλθηηθ η iwiyqeHMe β whctom βηαθ nosTOMy ημθ-θτ 3HaqeHMe noBCKwy Tau, rite BajKHO pacmenaeHwe προτβΗΗΟΒ πρκ3THX yCflOBHflX, ΟΛθ,ΒζΟΒΗΤβΛΒΗΟ, Β ΠρΟΜΒΜίΛβΗΗΟΟΤΗ nHBOBapeHHH Η Jty—dMJIBHOfí npOMUUIáeHHOCTH, ΠρΗ Η3ΓΟΤΟΒΛβΗΗΗ ΟΗρΟΒ, ΠρΗ ρβ3Λ0Η6ΗΗΗ(ΟΤΛβΛβΗΗΜ) ΧΗΒΟΤΗΒ1Χ TKaHefl, Β GJlynaQ Cy Cn©H3H0HH0řj KyflBTyptl ΚΛβ-TOK Η ΠΡΗ ΓΗΓΗβΗΘ 3ydOB. 3ΤΗ ΟβΛβΟΤΗ ΠρΗΜβΗβΗΗΗ TpeÓyíOT, 0,ΛΗ8Κ0,ΟΤΗβΟΤΜ nOflyqeHHfl Β HHCT0M ΒΗΛβ 3ΤΗΧ Ηβ^ΤρβΛΒΗΒΙΧ ΠρθΤβ83, ΤΗΚΚ3Κ ΠΟ ρβ3ΛΗ<ΙΗΒΙΜ ΠρΗΗΗΗβΜ, Κ3Κ ΟΛΗΙΙΙΚΟΜ Ηβ3Η3ΗΗΤβΛΒΗ3Η aKTHBHOCTB, 218 890 TOKCHKOJiorHqecKafl onacHOOTB, βηοοκοθ cojtepacaHHe qy3Eepo,KHax προ-ΤβΗΗΟΒ, Ηβ MOryT ΠΡΗΜΘΗΗΤΒΟΗ KJJIBTypaJIBHae KOKOCTH ΜΗΚΡ00Η0Γ0upOMGxoaOTeHHB c HeijTpaJihHOK npOTeaeaofl ©κτηβηοοτβιο.

JiO CHX πορ flJIfl BfeWeJieHHfl Η ΠΟΛ^ΗβΗΜΑ B qHCTOU ΒΗ^β Bblpada-TblBaeMHX MMKpOQpraHH3MaMH HeflTpaJILHHX npOTea3 πρθϋΡξθ Bcero npH-BJieKaJiHCB ρβεκίξΗΗ ocaaaeHHfl, HanpHMep, c íiomohíbío opraHHnecKHxpacTBopuTeJieií, κβκ aueTOH, σππρτ, hjih HeopraHHqecKHX conefi, KaKcyJiB$aT aiíMOHHA. 3th Μβτο,ζξω, ojmaico, πωβωτ τοτ Ηβιχοοτβτοκ, ντοτακΗΜ odpa3OM nojiýqeHHHe He^TpaíiBHue προτβββΗ Bcer^a coflepacáTeqe dojiee hjih ueHee dojiBiiiHe KOJwqecTBa HHopouHax προτβΗΗΟΒ, ko-Topae ocaamaDTOfl βμθοτθ c HeflTpaJiBHUMH npoTea3aMH. Πο 3tož$ npn-qwHe sth cuecn φβρΜθΗτοΒ Torna odJianaíOT TaKste tojibko dojiee He-3HaqHTeJiBHOí5 yjieJiBHOfl (cneuH$HqecK0$) 3κτηβηοοτβϊο, ηθμ ^EHCTaeφβρΜΘΗΤΗ, H H3-3a JÍOJIH ΗΗΟρΟβΗΗΧ ΠρΟΤθΗΗΟΒ CíIOCOÓCTByiOT UpOTeKa-hhk> HesceJiaTeJiBHUx nodonHax peaKUníí. W3 JiHTepaTypu H3B6CTHbi xpOMaTorpa$HqecKHe Mecona, κοτορκβHe coflepacaT BameonHcaHHax HěnocTaTKOB η κοτορκβ πρηβομητ k sho-tům HafíTpaJiBHbíM np0Tea3HiíM npony&Tau. B KaqecTBe HocnTeJiefi npn3TOM HCnOJIB3ytOTCA ΟΗΟΟρΡΒΗΗΠΘΌΚΗβ HOHOOdMSHHHKH Ha ΟΟΗΟΒΘ ϋθΛ-JH0JIO3U, HanpHMep, $EAE- HJIH Cy-ljeJIJIIOJI03a, ΟΟΟΤΒβΤΟΤΒβΗΗΟ, Ηβ“opraHHqecKiie ηοοητθιιη, k3k rHípoKCHJianaTHT. Ηθομοτρα Ha H3B6CT—Hafl nporpecc, οηΗβκο, Tarae sth MaTepnaJia HOCHTenefi η πρΗΜθΗΗβ—Mae aeTOfla odnanaioT ηθηοοτ3ΤΚ3μη, κοτορΰθ orpaHHHHBaioT hx Bce-OÓmyiO ΠΡΗΜΘΗΗΜΟΟΤΒ. 3τθ 0ΒΗ33Η0, O 0£H0$ CTOpOHbl, C CaMHMH HC-noiiBsy ©mhmh MaTepHaaaMH HocHTeneiJ h, c npyrofí ctopohh, c ηοποιιβ-3yeuauH λλα ποιι^ηθηηη 3thx HeilTpaJiBHax προτβββ hcxo^humm uaTe-pnaJiaMH. CxyfóamHe b KanecTBe hcxokhhx uaTepnanoB KyJiBTypaJiBHaekhhkocth MHKpoopraHH3MOB b KanecTBe ocHOBHax $epweHTOB conepsaTaMHJia3a, rJiioKaHa3a, KCHJiaHasa, meJiOHHae npOTea3a h npyrne b óojibmou H3ÚUTK6, a HeflTpanBHue npoTeaea Bcerna tojibko b οηθηβ He3Ha-HHT6JIBHUX KOJIHHSCTBaX. (MOlUHOCTB) EuKOCTB HOHOOČMeHHUX HOCHTeJlefíb a~-T0M cJiynae hjih HeflTpanBHax προτβ33 tojibko οηθηβ He3HaqHTeJiB-Haa, T3K K3K npH ΠρΗΜβΗβΗΗΗ 3THX ΗΟΟΗΤΘΛβ^ 0ΒΗ3ΚΒ3Κ)Τ0Η Τ3Κ3ΚΘHMeromnecfl b H3daTKe φβρΜβΗτκ. BcnencTBHe 3τογο ηθοΟχοκημο nepenCOOCTBeHHO Xp0MaT0rpa$HH6CKHM ΒΗββϋβΗΗβΜ H OHHCTKOfl OCymeGT-BJIflTB T3K3K© peaKUHK OcajKfleHHfl, ^ITOÓa CHH3HTB KOHUeHTpaUMK) OCHOB“HUX φΘρΜβΗΤΟΒ. IlpH ΠρΗΜΌΗΘΗΗΗ ΓΗ^ΡΟΚΟΗJianaTMTa B Κ3ΗβΰΤΒθ HOCH“TeJifl TaKJse HeoOxoflHMH npenBapHTeJiBHae ocaHneHHfl, HTOda iiojihoctbio 3 218 890 y^aoTB </-a>MHJia3y. C πομοβιβ» βτογο ηοοητθο ηθβο3μοκηο οτ-Αθοτβ flpyp οτ jipyra -aiíMJiasy η HeíiTpanBHue npoTeaga. B HacTonmee BpeMfl, οοποΒβτβΟΗΟ, xpoMaTorpa$miecicne Μβτο-βΗ ΒΗββΟΗΗΗ H 0HHCTKH HeflTpaJIBHhK npOTea3 eme OqeHB EOporOCTO-no h HeaKOHOMM^Hbí, hto Be.neT κ TOMy, hto sth npoTeaeH HeflOGTyn-HH B JíOCTaTOHHHX ΚΟΟΗβΟΤΒβΧ C ΛΟΟΤβΤΟΗΗΟ dOEBinHMH aKTHBHOCTHMH.

Apyrne npHHHHU, KOTOptie ΓΟΒΟρΗΤ npOTHB HCn0JIB30BaHHfl ŮH0-opraHHqecKHx h HeopraHHnecKHx HOOHTeJiefl fljxn BbwejieHHH μ nonyne-HHH B HHCTOM ΒΗΧξβ HefiTpaJIBHHX Πρ0Τβ83 H3 όΗΟΟΓΗΗβΟΚΟΓΟ Μ3ΤβρΚ—ana, KaK KyiiBTypaJiBHue jkhjxhocth ho φβρΜβΗΤθίχΜΟΗΗωβ dyJiBOHu daicTepnaJIBHOrO npOHCXOJfmeHHH, ΟθΒξβΗ3ΒβΟΤΗί)Ι. bHOOpraHiFieCKHe ΗΟΟΗΤβΟMHKPOÓHO HeyCTOfíqHBH H pa3pyUiaiOTCfl COCTaBHHMH HaCTHMH CMeceflφβρΜβΗΤΟΒ H3 OaKTepHaJIBHHX HCTOHHHKOB, THK ΗΤΟ OHH ΗΟΠρΗΓΟίζΗΗχαα τόχημηοοκογο HcnoJiB3OBaHMn. HeoprammecKue hochtso, no npH-ΗΗΗβ HH3KOÍ5 ΚΟΗΐχβΗΤρβίΧΗΗ βΚΤΗΒΗΗΧ IXeHTpOB Ha ΠΟΒβρΧΗΟΟΤΗ, OOJia-aaiOT TOJIBKO MaJIOfl βΜΚΟΟΤΒΙΟ (MOIRHOCTBíO) βΟ 0ΒΗ31ΙΒ3ΗΗΗ OHQCneííH-φΗπβοκΗΧ θφφβκτορΗΗχ opraHOB dJiarojiapn noOMepaHa-ttorHHHHM npe-BpameHHHM, TaK hto, HanpHMep, c hx πομοιββιο ΗφφκΗΒ^κ) xpoMaTorpa-*φΗΙΟ HeJIB3fl OCymeCTBOTB 3φφβΚΤΜΒΗ0 .

HeJiB H3Qgpeo?eHHfl

UeJiBio M3O(5peTeHHfl ΗΒΛηβτοη pa3padoTKa BceodmenpHMeHHMOro,npOCTOrO Η 3Ι6ΓΚΟ OCy ΙΒβΟΤΒΐΐΗβΜΟΓΟ 3φφΗΗΗ0χρ0Μ3Τ0Γρ3φΜΗβ0Κ0Γ0 0Π0-coda BtweJieHHfl h nojiyqeHHn b hmotou bhjxo He^TpaJiBHtix npoiea3,KOTOpHij ΟΒΙβΗ HenOCTaTKOB so CWX πορ ρρΗΜΘΗΗβΜΗΧ ΜβΤΟΧίΟΒ. Bbi;ne-πβΗΗβ flOJiacHO ocymecTBflflTBOfi dJiaroxxapn MaKponopHCTUM chht6thh6c—KHM COnOJlHMepaM H3 0Κ0Η3ίΙΚΜίΙΜβΤ3ΚρΗ7Ι3Τ0Β (θ2·*θ6“3ίϊΚΜΛ) C BUÓpaH-HUMH Cpe.nCTBaMH CBIHBKH H3 ΓΡ^ΠΠ ftHBHHHJlOBHX HO ΠΟΟΒΗΗΗΕΟΒΜΧMOHOiaepOB ΜβΤΗΚΡΗΗΟ'ΒΟΓΟ THna .

EteaoateHHe cyuiecTBa η300ρθτ6ηηη

CornacHO H30dpeTeHHio, cosepscatUMfl HefiTpajiBHhie προτβββκ Óho-norHHecKHřl MaTepnaji, HanpHMep, KyJiBTypaJiBHue jehjucocth hhh paoT-BopeHHue cyxne npoEyKTu HyJiBTypaJiBHux οΕΚΟοτβΑ, ββοοτοη b koh-thkt, no KOJiOHOHHOMy ho batch —onocody (”nopnHOHHOMy” cnooo-dy), c HepacTBOpHMHMH ΗΟΟΗΤβΟΜΗ, KOTopue conepoaaT KOBaoHTHO0Bfl3aHHtie Γβτβροηκκο no MeHBiuefí Mepe c oxxhhm sxmoijHKOHecKHMΤρβΤΗΗΗΗΜ aTOMOM 830Ta CO CBOÓOJXHOřj 3ΕβΚΤρΟΗΗΟβ napO$. 4 218890

CosepacamMfl HefiTpaoHbie npoTea3bi όΗΟΗΟΓίπβοκΜβ MaTepnan npesCTaBUíieT coóofó πρββπο^τΗΤθΟΗΟ noJtyqeHHNe H3 ÓaKTepHaJibHux hc-to^ihhkob, He co^epacainiie κτιθτοκ pacTBopti, KaK KyBBTypanBHue jkhs-kocth $epMeHTa-maoHHbix ó^blohob ηλη pacTBopu cyxux ΠρΟΒ^ΚΤΟΒ3THX $epMeHTailHOHHHX dyJILOHOB HO qaCTMqHO OlíHlUeHHhie paCTBOpti,κοτορΗθ noJiyqaioT η3Βθοτηημη cnocočaMH ο^ηοτκη, k3k sto onucaHOBHUI6 .

MojKHO HCXO,HHTB H3 JItOČblX ÓaKTepHaflbHblX HCTOqHHKOB, KOTOpbiecoflepsaT ηθ^τρολβηηθ npoTea3H. OcočeHHO npe.nnoqTHTeJibHHe φβρΜβΗ-TauHOHřiue dyjibOHbí m pacTBOpeHHHe cyxne nponyKTH $epMeHTaiíHOH-hux ÓyJiLOHOB τακκχ bhjxob óaííHBJE, kok B. tf/wy , 3. cereus,

, 3. , 3. , 3. SU&fr&S $.theťinoprotto&jh‘W3 f B. ťZa/ť/vy/etfS/S' H 3. purrLyliS , KOTOpbieMOryT nOJlyqaTBCH nyTeM MHKpOÓHOfí $spM6HTaUHH H3BeCTHblMH φθρΜβΗ-TaiíHOHHHMH cnocodaMH.

McxouHue pacTBopu npifl οββ3ηβ3ηηη HeKTpaBBHNx npoTea3 aoJi»-hu HMeTL pH-3HaqenMe 7-10, npeanoqTHTeJiBHO 8,5-9,6, πτο JiericoaocTuraeTCfl η3βθοτηημη cnocoóaMH. Οποοοδ οββ3ηβ3ηηβ yicasaHHbixnpoTea3 mojkho ocyiuecTBJíflTB no KOJiOHoqHOMy hjim -cnoeotíy.

KaK b CJiyxiae κοβοηο^ηογο, tbk h Tanace b cjiyqae -cnocoda

ΠρΜΜΘΗΗβΤΟΒ npOCTOfí npOIjeCC npOMUBKH £JIfl ΠΟίΙΗΟΓΟ yflaJieHHfl nyace-pouHbix (HHopojcHbix) προτθΗΗΟΒ c πομοιηβκ) dy^epHux pacTBOpoB dojieeBHCOKOií ΗΟΗΗΟ0 GHJIbl Η C ρΗ-3Η3ΉβΗΗβΜ 8,0-9,5, ΠρΜ Μ3ΒβΟΤΗΗΧ yC-BOBHflX npn .noóaBice He3HatíHTejiLHbix KOOwecTB pacTBopn&áoro Kpaxwa-Jia. BaTeií CBfl3aHHbje c cojíepaiamHMH reTepoiíHKJibi a^copdeHTaMH Heři-TpajibHEie npoTea3H aJHOHpytoT Óy^epHHMH pacTBopaMH c ρΗ-sHaqeHHSMH 4-7, npn H3B6CTHHX ycJiOBHBX npn ja;odaBKe HeopraHHqecKMx cojieíifíJIfl nOBUUieHHfl HOHHOfí CHEhl. IlOCJie 3 JIK) HP o Ba HUB He0TpaJIí>HHX προτβ-a3 sjíioaTbi mokho jiHaJiH30BaTi>· no οτηοιιιθηηκ) k 0,01%-hhm pacTBopaMaiteiaTa κητιβιιηη h 3aTen ίΐΗθφπτΐΗ3ΗρθΒ3ΤΒ, npHqeu noJiynaioT ηθΗτ-paJiLHae npoTea3H b TBepjxofí φορωε, hjih pacTBopu mojkho ηοποββ30-b3tb opa3y flaJiee de3 saflBHeíinieč} odpadOTKH. JIjib πρΗΓΟτοΒίίθΗΗΗ yKa3aHHbix, cojíepacamHX reTepomMbi hoch-Tejiefí, κοτορωβ HcnoaB3yioTCfl flan stopo a^^HHHOxpoMaTorpa^HqecKO-ro npHHií^na BbifleJieHHB η ομηοτκη HeřjTpaJiBHbix npcnTea3, moscho npn-BJieKaTB ΜΗΟΓΗβ Η3ΒΘ0ΤΗΗβ H3 OpraHHqeCKOfl XHMHH Η XHMHH FkOJIHMe-poB peamíMH coqeTaHHB πρπ πρημθηθηηη caniux pa3JiHqHHx HOCHTenefí.43iíi 3T0fó ueJiH, HanpHMep, ÓHOopraHHqecKue ηοοητθλη Ha οοηοβθ itea^— - 5 - 218 890

JiiOJi03bi, noJiHfleKCTpaHOB h apar03bi, hjih opraHoecKHe οηητθτη^ϊθο—KH6 nOJlHMeptl THIia aKpHKOBOfí KHCJIOTa, MeTaKpHlftofl KHCJIOTU H CTH“pOJia, C00TB6TCTBSHH0, HeOpraHHqeCKHO HOCHTeHH, K3K nopucToectckjio , cnJiMKareíiL h okhcb aJiiOMHHHB, nocjie hx 3κτηβηιιημ, moschobboehtb bo B3anMO,nei5cTBHe o a3OTcoaepscainHMH reTepomiKJiaMH, ko-Topue coaep&aT 3K30~ h/hjih SHflOUMKJiHqecKHe HyKJieo$MJiBHbie rpyn-ΠΗ.

ConomiepH H3 0KCKaJlKHJlM6TaKPHJiaT0B (C2“CQ-aJlKHJl) C BuO-paHHHMH CpeflCTBaMH CIHHBKH H3 Γρ^ΠΠ flHBHHHJIOBUX HJIH ΠΟJIHBHHHJIO-BHX ΜΟΗΟΜβρΟΒ Μ6Τ3ΚΡΗΙΙ3ΤΗΟΓΟ THIia, OflHaKO, ΟΟΟ0ΘΗΗΟ XOpOlBO npH“ΓΟίξΗΗ £JIfl Π0ΗΗΜβρ3Η3Λ0ΓΜΐϊΗίίΧ ΠρβΒρβΒΙβΗΗϋ C 3THMH ΓΘΤβρΟΐίΗΚΑΗΜΗ.Buconoe cojtepjEaHHe b hhx HefiTpaJiBHux γηλροκοοβηηχ rpynn h HxrHflpOJIHTHqeCKaH CTadHJIBHOCTB nO3BOJIal0T OC^meCTBJIflTL npOCTbie HcaMue pa3Hoodpa3Hue μο^ηΦηκθηηη noJiHuepHux noBepxHOcTefl, KaK bopraHnqecKHx, τβκ η τ3Κ3κθ b bo#hhx pacTBopnTeJiflx npa chjibho kh-CJIUX HJIH IlíeJIOqHHX peaKIÍHOHHHX yCJIOBHflX. 0ηΗΤΘ3 HCnOJIB3yeMUX a$$HHHOfí χρ0Μ3Τ0Γρ3φΗΗ COnOJiWMepOBOKOHaJiKHJiMeTaKpHJiaTOB c KOBaJieHTHO οβη33ηηημη ΓβτβροιχΗκΛβΜΗ, ko-ΤΟρΗβ ,ΖξΟΖΧΗΗ HM6TB ΠΟ ΜβΗΒΙΠβΗ Μβρβ O^HH SHflOIÍHKJlHqeCKHř} ΤρΘΤΗψ"hhA aTOM a30Ta co CBOdojiHOřj 3JieKTpoHHOfí napo®» προοτ h ocymecT-BJifleTCfl corJiacHO 3koHonímeckomj naTeHTy ΓΛΡ C 08 2//205 174/. BKaqecTBe reTepouHKUOB yKaaaHHoro Tuna πρηηημηιοτ bo βηημ3ηηθnpe^nOqTHTeJIBHO HMHJCa3O3I, 0βΗ3ΗΜΗΛδ30Β HJIH HX Πρ0Η3Β07ξΗΗΘ, aTaKffie np0H3B0ffHHe ΠΗρΗ,ϊζΗΗ3, H T3KHM 0dpa30M 0ΗΗΤ63Ηρ0Β3ΗΗΗ6, co-KepjKamwe reTepouHKJiH nojiHMepu odJiajiaioT bucokoA cneun$injecKOílcnocodHocTBio CBfl3HBaTB HefíTpaJiBHue, UHHKCo.nepiKaiHHe npoTea3u. OhhJiHUieHbí HeflocTaTKQB η3βθοτηεχ h b HacTOsmee BpeMfl HcnoJiB3yeMuxwaiepnaJiOB «jir xpoiiaTorpa$HH. Ha οοηοβηηηη hx χΗΜΗ^βοκοίΐ h mhk-pOdHOfl CTadHJIBHOCTH HX MOKHO ΠΟΒΤΟρΗΟ Η0Π0ΙΙΒ30Β3ΤΒ nOCJie ρθΓβΗβ-pHpoBanHH. ťadoTa npH pa3JinqHux pH-3naqeHHflx η πρκ pa3Hux hoh-HUX CHJiaX He npHBOflHT HH K K3KHM ΗΘ]Κβ3Ι3ΤβΛΒΗΗΜ H3M6H6HHHM ΟθΈβ-Ma hochtcjih. BuseJieHHue HeflTpajiBHue npoTea3u BCJie^CTBHe γηλρο-φΗΗΒΗΝΧ CBOflCTB HCnOJIB3y βΜΗΧ Η ΜΟϋΗφΗΙΙΗρΟΒΗΗΗΗΧ ΟΟΠΟΟΜβρΟΒ Η30Κ0Η3ϋΚΗ3ΙΜ6Τ3ΚΡΗ3Ι3Τ0Β Ηβ HeHaTy pHpyíOTCH Η Ηβ HHaKTHBHpyíOTCfl,κβκ qacTO HadJiKweTCfl β cJiywae ΓΗΖξροφοΟΗΗΧ HOCHTeJieíí. Βϋβοτβ c3ΤΗΜΗ npeHMymecTBaMH hobux, cosepaamHX reTepoiiHKJiu MaicponopHC-thx conoJiHMepoB, προοτβπ ocyiqecTBHMOCTB h TexHOJiorHqecKaH pemae-moctb cnocoda, a TaKsce JierKaa flocTynHOCTB Bcex MaTepnaJioB κβκΑΛΑ πρΗΓΟΤΟΒίίβΗΗΗ ΗΟΟΗΤβΛββ, T3K h Taitse flJIfl nojiyqeHHH φβρίίβΗΤβ 6 218 890 naioT peHTaGeHLHuíj cnocoG BHfíeneHHH h nojiyqeHHH b mhctom BwnoHe#TpajiBHHX iíHHKCOflepatamHx npoTea3.

CnenyioiuMe ηρΗΜβρυ ποηοηηιοτ M30GpeTeHHe, He orpaHHWMBasOGEewa Η3θ0ρβΤβΗΗΗ.

BPMM6P I 50 un MaicponopucToro cononuMepa H3 2-0KGH3THJiMeTaKpHHaT--CO-STHJieHflHMeTaKpHJiaTa = 300 000 asjiltohob) c con&pacaHH- ew HMMfla3oaa 61 μγ/γ ηοοητθη» (0,y mmohb) (πο^ηθη cqíji&kho na-TeHTy rjLť 0 085/205 174) ypaBtíOBeiflHBaioT c nOMomB® Ο,ΘΙ M óo-paTHoro Oy$epa no pH~3HaHeHMfl 9,0 h CMeuiHBafOT c 500 mu KyHBTy--p anBHOfl oakocth &a,včCus pcvrtyčis f KOTopan GJiaronapa naGaB-Ke Ih paoTBopa ennoro HaTpa npn TeMnepaType Kaiiepu χοηο,ηο&ηη-Ka noBeneHa no pH-3HaqeHHH 9. CycneHgnio nepeMeuioaioT b TeqeHHe8 qacOB b KaMepe χοηοηοβηηκη, n 3aTen ηοοητθηθμ 3anoHHflioT ko-noHKy, rne oh npoMUBaeTCH c πομο^β» 0,1 M GopaTHoro 6y$epa cpH-3HaneHHeM y,0 no τβχ nop, nona Gojiee He GyneT aJHoupoBaTBOíiHHKaKHX COnyTCTByramiiX ΠρΟΤβΗΗΟΒ. IlyTeM 3HKJHpOBaHKH C'n®MOmB$0,1%-ηογο pacTBopa aneTaTa KasBiian c ťH=6,5 b I-mojihphom xnopac-ΤΟΜ HaTpHH H KOTOpufl COnepatHT 0,5 Γ CyJIB$aTa UHHKa Ha I JIHTppacTBopa aneiaia κη^βιιηη, HeiíTpajiBHyíQ npOTea3y οτηβΗΗ®τ οτ an~ -copoeHTa. BaneHAramnecH npn stom φρβκίξΗΗ He eonepacaT hhkhkhx H3-MepuMux aKTHBHOCTeM conyTCTByiomHX φβρΜβκτοΒ h nonaBJíHioTCH fí£TAΜ Ο—φβΗ3ΗΤρ0ΗΗΗ0Μ· 9ΤΗ φρβΚΙΪΗΗ ΟβΒβϊξΗΗΗίΟΤ, nHSJiH3y®T 24 qaca ΠΟοτηοβιθηηκ) κ 4χ2 ji 0,01%-ηογο pacTBopa aiíeTaTa κηηβηηα c pH =6,5,KOHiíeHTpHpyioT nyreii ynBTpa$nJiBTpaiíHH h ano$HiiH3npyioT. Bhixon coc-TaBJíaeT 6 μγ προτβΗΗΗ c 18-KpaTHKM yBeJiHneHHeM yneíiBHOfí ηκτηβ—HOCTH ΠΟ ΟΤΗΟΗΙβΗΗ® K HCXOnHO^ KyJIBTypaJIBHOM ÍKHnKQCTH. IIpHMep 2 30 r Hežipa3U (nponaxHHfl nponyKT φκρΜκ ΗθΒθ-JleHMapK) pacT-BopaioT b 300 mh conepnamero 0,5 r pacTBopHMoro KpaxMaJia 0,01 MGopaTHoro Gy$epa c pH-3HaneHHeM 9 h nepeMeínoaioT b TeqeHHe 30MHHyT b Kanepe xojionHHBHHKa. 3aTeM cycneH3HíO neHTpH$yrHpyioT bτβηβΗΗβ 30 MHHyT πρκ 15 000 οόοροτΟΒ b MHHyTy. HanocanonHy® ran~kootb nnaJiH3y©T b τβηβΗΗβ 24-x nacoB no OTHOineHH® κ TOMy ace ca-Mouy ÓopaTHOMy Gyφepy h 3aTeM bhocht b kojiohí^ , 3anoJiHeHHy® 50mji HcnoHBsyeMoro Taicwe b npHMepe I HMHna3O2iconep»amero hochtójih.ΠοοΗβ βπητηβηηηη (norpyaceHHH) pacTBopa ΗΟΟΗΤβηΒ προΜΗΒβιοτ co-nepacamiiM KpaxMan 0,1 M GopaTHUM Gy^epoM o pH-3HaneHfleM 9,0 , 7 218 890 <íT0<5h Π0ΗΗ00ΤΒΗ) 33Π0ΗρθΒβΤΒ COnyTCTByiQlUHe ΠρΟΤΘΗΗΗ. 3aTeM C a,H-copdeHia BnnenaioT HeižTpaoH^io npoiea3y c πομο^βιο Ο,Ι^-ηογο paci-Bopa aqeTaTa KaatííHA c pH-3HaqeHHeM 6,o, b I-mohhphóm paoTBOpexJiopHCToro HaTpWB» h KOTopufl coaepxcHT 0,5 r cyJiB$aTa UHHKa Hahhtp pacTBOpa aitoTaia κ3Ηβηηη. 3th $paKitHH He co^epstaT ηηκ3κηχΗ3ΜΘΡΗΜΗΧ aKTHBHOCTeíí IHeJIOqHOÍj np0Tea3H, σθ -aMnaa3u, -rJnoKa~Hasu, h noaaBJíflioTCfl EDTA h 0-$eHaHTp0JiHH0M. Hx oximiiaioT snaJiHaoMB ΤβΗΘΗΗβ 24-X TiaOOB ΠΟ OTHOtilSHHIO K 4x2 JI 0,01%-ΗΟΓΟ paOTBOpaaqeiaTa KaoííHn c pH = 6,5, ΕΟΗΐξβΗτρκργίοτ HyieM yHBTpa$HHBTpa-UHH Η ΗΗ0φΗΗΜ3Ηρ^Κ)Τ. BfalXOU G0CTaBHfl6T 10 ΜΓ ΠρΟΤβΗΗΒ C ΙΙ-κρβΤ-HHM yΒβΗΗΗβΗΗΘΜ ySeJIBHOfl aKTHBHOCTH ΠΟ CpaBH6HHW C HCXOflHHM ΠρΟ-ítyKTOM.

Upaiea .¾ K I 000 MH KOHneHTpHpOBaHHOfl KyJIBTypaaBHOfl MCMflKOCTH Ot3í&bCCCiSSu&ihs· πρκ nepeueiiiHBaHHH h πρκ TeiínepaType χοηοηηηβηοα

Kauepu ueaJie.HHO ηρΗκβΠΗΒβιοτ oehh οτρ χοηοηηογο apeieHa. ΠοοπβflOdaBKH 20 r ΤΒβρίΟΓΟ aneiaia nauBmiB odpa30BaBinyiocfl cycneH3H»nepeMemHBaioT eme 30 MHHyT πρκ TeunapaType χοηοκοβηοΑ Kauepu(KauepH xoaoflHJiBHHKa). 0ca£OK 3aieM OTneHip^yrapyioT h k Han-ocaflOtiHOí} jkhukocth πρκ προπΗΧ paBHHx ycJiOBHflX, ojtHaKO, tfee bo-daBKH aneiaTa KasBuas, πρηκηπηβηιοτ saHBHeííiBHfi jihtp aueTOHa. Πο-cHe HeKaHTaiiHH HajtocanoHHQíi hmhkocth ocTawinuflCH ocanoK pacTBOpn-ωτ b 250 μη 0,01 M ÓopaTHoro óyťjepa c pH-3HaqeHHeu 9, b κοτοροΜpacTBopeHO 0,5 r KpaxMaHa. K suoMy paciBOpy gjepMeHTa jxoÓaBJíflioT50 mji TaKoro se, odpadoTaHHQro npesBapuTeJiBHO coraacHO npHMepyI, HMHsa3GJicoaep3Kamero ηοοητθεη, h oycneH3Hio nepeueuiHBaioT b τβ-qeHHe 8 nacoB b xawepe xoHOHHHBHHKa. Hochtchb οτβθΦηοτ οτ paoT-Bopa Ha φρκττβ η npouuBaioT coHepnamuM Kpaxuan 0,1 M ÓopaTHbíMόίφβρΟΜ C ρΗ-3Η3ΗβΗΗΘΜ 9, XJTOĎU OTJCeJIHTB ΟΟΠ^ΤΟΤΒ^ΚΒΙΗβ ΠρΟΤβΗΗΗ.HefiTpaJiBHyB npoTeaey οτλθμιτ ot ancopÓeHTa πρκ tskhx xce ycJiOBH-HX, XíTO Η ΟΠΗΟβΗΗΗΘ B ΒΗΙΒβΠρΗΒθΗβΗΗΗΧ ΠρΗΜβρβΧ. PaCTBOp φβρΜβΗΤβHHaHneyioT b τβπθΗΗβ 24-x nacoB no οτηοβιθημο k 4x2 ji 0,01%-ηογοpaciBOpa aueTaTa κηηβηηη, κοΗηβΗτρΗρ^ιοτ nyieu yiiB®pa$HJiBTpaiiHHH JlH0$HJIH3Hpy KJT. ΒΗΧΟβ COCTaBJIfleT 28 ΜΓ npOTeUHa C 8-KpSTHHMyBeHHHOHHeil yaeJIBHOij aKTHBHOCTH ΠΟ CpaBHOHHIO O HOXOHHOř) KyJIBTy-paJIBHOfl aCHHKOCTBK). Πρημθρ 4 20 μη MaicponopucToro conoJiHMepa H3 2-OKGH3TOMeTaKpHnaT- - 8 218 890 -C0-3THJieH£HMeTaKpa<JiaTa (IW»m = 300 000 naxBTOHOB) c coaepjKa-HHeií nHpHSHHa 78fir (0,57 μμολβ/γ ηοοητθαβ) (nGayqeH coraacHO3K0H0MHqecK0My naieHTy TJÍP C 08 L /205 174) cycneasapyioT b0,01 M ÓopaTHOM Óy$epe c pH-3HaqeHHeM 9,0, 3anoBHaK)T hm kojioh-Ky h ypaBHOBeinHBaioT τηκημ se čopaTHNM čy$epQM. B aiy KonoHicyBHOOHT 50 ΜΛ pacTBOpa ýepweHTa, KOTopag nonyseH H3 KOHueHTpupo-BaHHOfl KyflBTypaJiBHOfl kuskocth βαάΜίν sttteiCis , khk onucaHOb npHMepe 3. HocJie noraomeHHB ("norpyxeHHfl”) pacTBOpa HocnTerasrpouuBaioT 0,1 M PopaTHun Čy$epoM b 0,5 tf xxophctom ηητρηη cpH-3HaHeHweM 9,0 βπχοτβ eo ποχηογο 3Λκηροβ3Ηηη conyTCTByioniHXπροτβΗΗΟΒ. ί&τβΜ HeiiTpajiBHyio npoTea3y araonpyioT Kaic onacaHO bnpHuepax ι-a. «řpaitunn »e co^epaaT ηηκ3κηχ η3μθρημμχ 3κτηβηοοτθ$COnyTCTByiomHX φβρΜΘΗΤΟΒ H BOflaBafllOTCfl Ε&ΓΑ Η Ο-φβΗΒΗΤρΟΒΗΗΟΜ. Μχ ΟβΈββΗΗΗΙΟΤ, EHaJIH3yK>T B Τ6Ή6ΗΗ6 24-χ qaCOB ΠρΟΤΗΒ 4χ2 X0,01%-ηογο pacTBOpa aqeTaTa KaBBijHfl o pH = 6,5, KOHueHTpHpyioTnyTeM yra>TpaiieHTpH$yrHpOBaHHfl h flno$HJiH3npyiOT. Βυχοβ οοοτβΒΛΑ-βτ 1,2 μγ npoTeuHa c Io-KpaiHUM yBeraneHiiew y#eJiBHOfi ηκτηβηοοτηno cpaBHeHHK, c HCXOSHO0 KyJiBTypaJiBHOřj ολκοοτβιο. 9

218 <$opMyJia H30,6peTeHMH 1. CnocoG BHAeJieHMfl HeHTpaoHux, líHHKCO^epjsainHx npoiea3, o τ ji η q a ίο m h íj c A τβΜ, ψτο coflepjKamHe HefíTpaoHbie npo-Tea3H pacTBOpu c pH-3imeHneM 7-10, npeflnoqTHTeJiBHO 8,5-9,5, noKOJIOHOqHOMy HJIH &atch ( "nOpiIHOHHOMy”) - CnOCOGy BBOJCflT B KOH—T3KT G COflep&amHMH ΓβΤβρΟΙξΗΚΒΗ HOCHTeJIflMH, πρκςβω ΓβΤβρΟΙίΜΚΛΗSOOhh coftepacaTB no μθηβιιιθΗ Mepe o#hh 3H,nouwiiBieCKHfl, TpeTHq-HHfl aTOM a30Ta co cboGoshoH sjíeKTpoHHOfí napofl, BHMHBaroT qyste-ρΟΛΗΗβ ηρΟΤβΗΗΜ C ΠΟΜΟΙΙΙΒΗ) ό^φβρΗΗΧ ρβΟΤΒΟρΟΒ ΟΟΛβθ BHCOKOÍS HOH—HOfj ohhh" a pH-3Haq.eHHeii 8,5-9,5 η οβη33ηηη6 o coaepraaimiMH γθτθ-POUHKJIH HOCHTeJIflMH HeřjTpaJ1BHH6 «ΗΗΚΟΟΛβρ»8Ι«Ιίβ ΠρΟΤββΒΗ SJÍiQHpylOTc noMomBío dy^epnbix paoTBopoB c pH-3HaqeHHeM 4-7, npn h3B6CthhxycJiOBMflx npa sodaBKe HeopraHnqecKHx coJiefl, si4aJii43yioT προτκΒ0,01%-ηογο paoTBopa aueiaTa KaJiBmiH h Jiiio$on3iipyjoT. 2. CnocoG BijffleJieHHfl non.I, OTJiwqaiouMficfl Ten,πτο b KaqecTBe co^epscamero HefíTpajiBHue iíHHKCOEepxíamne npoTea3uGHQJiorutiecKoro waTepnana HcnojiB3yioTCH čaKTepHasBnue hcto^hhkh, B OCOÓeHHOCTH KyJIBTypaJIBHH© JKHJUCOCTH $epMeHTaUHOHHUX dyJIBOHQBOH paCTBOpa CyXHX npOJtyKTOB 3THX φβρΙίβΗΤΗΙξΗΟΗΗΚΧ GyJIBOHOB HJIHOTqaCTM OHHfiieHHbie paCTBOpu. 3. Cnocoo no n.n.I a 2, o τ ji h h a iq m η m c η τθμ,ψγο..0CnOJIB3yK)TCfl φβρΜΘΗΤΟΙξΗΟΗΗΗβ OyJIBOHH HM ρΗΟΤΒΟρβΗΗΗβ CyXHe ΠρΟ-JtyKTH φ6ρΜ6ΗΤ3ΙξΗΟΗΗΗΧ GyJIBOHOB WÓaqHJM, K3K B. B. , B. , B. , B. Stít/ibs * £ ? η B. pumyčte , KOTOptie nojiyqaioTCfl nyiew mhkpoGhoíí $epMenTauHM no h3b6cthhm $epueHTaqH-ohhuu cnocodau.

<. CnocoG no Π.Ι, OTJlHqaBlUHiiCH T6M, ΨΕΟ B ΙΟ 218 890

KaqecTBe co^epjKaníHx reiepouHKHn ηοοητθο$ Hcno3ih3^iOTCfl conoo-Μβρκ OKCHaJiKHJiMeiaKpHJiaTOB (Cg-Cg-aJiKHJi) c BbiópaHHUMH cpescTBa-KJH CBIHBKH H3 rpyΠΠ JÍHBHHHJI- HO IIOOBHHHJI-MOHOMepOB ΜθΤ3ΚρΗΛ3Τ“Η0Γ0 THna. 5. Cnocoó ΠΟ Π.Π.Ι H 4, OTBHqaiOIHH0Cři ΤβΜ, ψίθb κβ^βοτΒβ coflepacamHx Γβτβροΐίκκο HOCHTeJiefl πρημθηηιοτοη οοποομθpu, KOTopue cosepsaT 5-, 6-ςΐιβΗΗΗβ ho cosepatamHe óojiLiuee koo-qeCTBO WHOB ΓβΤβρΟΗΗΚΟ, ΠρβΟΟΉΤΗΤβOHO HMH«a3OJI, 0βΗ3ΗΜΗΛβ-3-oji h hx npoH3BO,nHLie, a τβκκβ np0H3B0fíHHe nupHOHa. 218 890

II cnocob BbUIBJíEHHfl HBflTťAJILHbK ΠΡ0ΤΕΑ3 AHHOTSUHfl M30GpeTenHe othocmtch k xpoMaTorpa$HqecKOMy cnocoG^ Bbwe-ΗβΗΗΗ HefíTpaJIBHUX UHHKCOJtepsaUlHX npOTea3 πρκ npHM6H6HHH HOBblXHepacTBopHMHx HOCHTeJieži. BtmeJieHHue c πομοιηβιο sthx HOOHTeJieílΠρθΤθβ3Η HCnOJIB3yBTCfl B OÓJiaCTH ΜββΗΙίΗΗΗ, B πρΟΜΗΙΒΛβΗΗΟΟΤΗ ΠΗ-ΙίθΒΗΧ npOflyKTOB Η ΗβΠΗΤΚΟΒ. ΠρΗ 3T0M CJiaGo 00Η0ΒΗΗΘ paCTBOpSI,co^epKainíie HeUTpaJiBHue npoTea3U, ββολβτ b κοΗτβκτ c ΓβτΘροπκκ-JIHqeCKHMH ΗΟΟΗΤβΠΗΜΗ, ΠρίΠβΜ ΓβΤΘρΟΙίΗΚΠΗ COflepffiaT Π0 M3HBHI6Í1aepe oshh 3HBOiíHKJiinecKHfl τρβτπηΗΗίί aTOM a30Ta co cboGoshoAΒΗβκτροΗΗοΒ napoih .ta OTfleJieHHH qyjKepo^HHe προτθηηη θηιοηρ^ιοτ cnoMOiiiBio Ο^φθρΗΗχ pacTBopoB GoJiee bhcoko0 hohhoíí coh h b caaGo-meiioqHOJi oGaacTH h HeíjTpa«BHbie UHHKCoaepjsamHe npoTea3u aJiioapyioTb cJiaGoKMOBofi oOJiacTH. AnaJiH3 ocymecTBafliQT c íiomoiubk) 0,01%-ηογοpacTBopa aueTaia κηιιβιιηη.

Claims

- 12 - 218 890 PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob izolace neutrálních proteáz obsahujících zinek,vyznačující se tím, že roztoky o pS 7 až 10, výhodně 8,5 až 9,5, obsahující neutrální proteázy, se uvádějíve styk s nosiči obsahujícími he-terocykly, buá sloup-covým nebo vsázkovým způsobem, přičemž heterocyklymusí obsahovat alespoň jeden endocyklický, terciárníatom dusíku s volným elektronovým párem,ostatní prote-iny se vymyjí roztoky pufrů vyáší iontové síly o pH 8,5až 9,5 a proteázy obsahující zinek,vázané na nosičíchobsahujících heterocykly se eluují tlumivým roztokem o pH 4 až 7 za přídavku anorganických solí,dialyzujíse 0,01 % roztokem octanu vápenatého a lyofilizují se.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím,že se jako bio-logický materiál obsahující neutrální proteázy obsahu-jící zinek, používá materál bakteriálního původu,zej-ména kultivační kapaliny fermentačních médií nebo roz-toky suchých produktů těchto enzymů nebo částečně vy-čištěné roztoky.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že sepoužívají fermentační média bakterií jako je B. amylo-liquefaciens, B.cereus, B.licheninformis, B.megaterium, B. subtilis, B.thermoproteolyticus, B.thuringiensis aB. pumylis, které se získají mikrobiální fermentací.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jakonosiče obsahující heterocykly používají kopolymeryhydroxyalkylmetakrylátů (C2-Cg-alkyl) se zesilovacímiprostředky vybranými ze skupiny divinyl-nebo polyvinyl-monomerů metakrylátového typu.

5. Způsob podle bodů 1 a 4,vyznačující se tím,že se jakonosiče obsahující heterocykly používají kopolymery,kteréobsahují 5“,6~nebo vícečlenné heterocykly,výhodně imidazolbenzimidazol a jejich deriváty a také deriváty pyridinu. Uznáno vynálezem na základě výsledků expertizy, provedenéÚřadem pro vynálezectví a patentnictví, Berlín, DD.