CS218777B1 - Způsob výroby peptidů obsahujících lysin - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů obsahujících ve své molekule zbytek lysinu. Tento způsob se vyznačuje tím, že se pro chránění ε-aminoskupiny lysinu používá fenylacetylová skupina, která se z vybudovaného peptidů odštěpí působením penicilinamidohydrolasy E. C. 3.5.1.11. Vynález by měl nalézt uplatnění ’ve farmaceutické chemii, zabývající se přípravou biologicky aktivních peptidů obsahujících lysin, kdy pro jejich přípravu lze aplikací uvedeného způsobu očekávat výrobu lysinových peptidů s vyššími technickými parametry a nižší výrobní náklady.

Description

Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů obsahujících ve své molekule zbytek lysinu.

Většina dosud popsaných a používaných způsobů syntézy peptidů je založena na použití chránících skupin [Schroder E., Lubke K.: The Peptides. Academie Press, New York 1966; Jakubke H. D., Jeschkeit H.: AminOsauren-Peptide-Proteine, Akademie-Verlag, Berlin Ϊ969; Synthese von Peptiden (E. Wůnsch, Ed.j, Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), svazek XV/1. Thieme, Stuttgart 1974], Principiálně můžeme rozdělit chránicí skupiny na pohyblivé (mnohokrát odstraňované během výstavby peptidového řetězce) a stabilní, které chrání funkční skupiny v postranních řetězcích aminokyselin a které procházejí všemi syntetickými stupni a odštěpují se v posledním stádiu syntézy. Požadavkem kladeným na stabilní chránicí skupinu je z jedné strany dostatečná odolnost v průběhu jednotlivých syntetických stupňů, z druhé stratny ovšem možnost takového způsobu jejich odštěpení, který by žádným způsobem nenarušil již vybudovaný peptidový řetězec. Tyto dva požadavky jsou ve vzájemném rozporu a žádná z dosud popsaných chránících skupin pro ε-aminoskupinu lysinu je zcela nesplňuje.

Novost předmětu vynálezu spočívá ve zjištění, že fenylacetylová skupina jako chrániči skupina ε-aminoskupiny lysinu je dostatečně stabilní za běžných podmínek používaných při syntéze peptidů, a že se dá Odstranit působením enzymu penicilinamidohydroilasy E. C. 3.5.1.11., který prakticky neštěpí peptidové vazby.

Podstatou způsobu výroby peptidů obsahujících lysin je, že se pro chránění ε-aminoskupiny lysinu používá fenylacetylová skupina, která se z vybudovaného peptidů odštěpí půsiobením penicilinamidohydrolasy E. C. 3.5.1.11.

Způsob výroby peptidů obsahujících lysin se dále objasňuje v příkladech provedení.

Chromatografie v tenké vrstvě byla prováděna na destičkách se silikagelem (Silufol) v systémech:

2-butanol — 98% kyselina mravenčí — voda (75: 13,5 : 11,5; Sl),

2-butanol — 25% vodný amoniak — voda (85 : 7,5 : 7,5; S2),

1-butanol — kyselina octová — voda

4:1:1; S3),

1-butanol — kyselina octová — pyridin — voda (15 : 3 : 10 : 6; S4),

1-butanol — kyselina octová — ethylacetát — voda (1 : 1 : 1 : 1; S7), chloroform — methanol — kyselina octová — voda (32 : 8 : 2 : 1,2; Sil).

Papírová elektroforesa byla prováděna ve vlhké komůrce v 1M kyselině octové (pH

2,4) a v pyridin-acetátovém pufru (pH 5,7) na papíru Whatman 3MM při potenciálovém spádu 20 V/cm po dobu 1 hodiny. Hodnoty E udávají relativní pohyblivost látek vzhledem ke glycinu či histidinu. V případě chromatografie i elektroforesy byla detekce látek prováděna ninhydrinem nebo chlorační metodou. Vzorky pro aminokyselinové analýzy byly hydrolyaovány 20 hodin při 105 °C v 6 M HCI (v ampulích zatavených při 105 Paj. Analýzy byly prováděny na automatickém analyzátoru. Presorická aktivita byla stanovena způsobem popsaným v literatuře (Krejčí I., Kupková B., Vávra I.: Brit. J. Pharmacol. Chemother. 30, 497 [1967]).

Příklad 1

N^s-fenylacetyllysin

K roztoku hydrochloridu lysinu (9,2 g) ve vroucí vodě (125 ml) byl přidán zásaditý uhličitan mědnaitý (čerstvě připravený z 12,5 g CuSO-t. 5 H2O a 9 g NaHCOs) během 30 min. Reakční směs byla 2 hodiny zahřívána k varu za občasného promíchání. Nerozpuštěný podíl byl odfiltrován a k roztoku byl za míchání po částech přidáván fenylacetylehlorid (13 ml) a 2M NaOH (pH roztoku bylo udržováno na hodnotě 10). Po 30 min. byl vyloučený měďnatý komplex odfiltrován, na filtru promyt vodou a etherem a suspendován v kyselině chlorovodíkové (pH 2). Suspenze byla zahřála na 90 °C a 1 hodinu sycena plynným sirovodíkem. Směs byla zfiltrována s aktivním uhlím, nerozpustná část byla na filtru, promyta kyselinou chlorovodíkovou (pH 2), filtráty ochlazeny na teplotu místnosti a pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 7. Po ochlazení byl vyloučený podíl odfiltrován a krystalován z 3 M kyseliny octové. Bylo získáno 6,2 g (50 %) produktu o t, t. 232 až 234 °C, [«]□ = -1-17,5° (c = 0,9, 1 M HCI),

E₂.4^Gly = 0,62,

E_{s 7} ^Gly = 10

R_H'= 0,29’(-S1), 0,26 (S3), 0,33 (S4).

Pro C14H20N2O3 (264,3) vypočteno:

63,62 % C, 7,63 % H, 10,60 % N, nalezeno*

63,79 % C, 7,66 % H, 10,51 % N.

Ninhydrinová konstanta je 61,0 [za podmínek, kdy leucin má 56,5); začátek píku při aminokyselinové analýze je ve 129 . min. (když odpovídající čas pro tyrosin je 133. .minuta).

N-benzyloxykarbonyl-N^e-fenylacetyllysiin

K suspenzi N^s-fenylacetyllysinu (4 g) v

1M NaOH (30 ml) byl za míchání přidán benzyloxykarboňylchlorid (3 ml) a 1 M

NaOH (pH udržováno na hodnotě 10) bě218777 hem 30 minut. V míchání bylo pokračováno1 ho-dinu, směs byla vytřepána etherem, vodná fáze okyselena na pH 3, vyloučený olej byl extrahován do ethylacetátu a e:thylacetátový roztok byl vytřepán vodou, vysušen síranem sodným a odpařen. Bylo získáno 5,1 g olejovitého produktu, R_F = 0,30 (S2), 0,74 (S3), 0,69 (S4). DicyklohexylamonioVá sůl připravená běžným způsobem, byla krystalována z ethylacetátu: t. t. 134 až 135 °C, [a]_D = +2,4° (c = 1, methanol), —3,3° (c = 1, dioxan).

Pro C34H49N3O5 (579,8) vypočteno:

70,44 % C, 8,52 % H, 7,25 % N, nalezeno:

70,58 % C, 8,45 % H, 7,52 % N.

Amid N^a-benzyloxykarbonyl-N^e-fenylacetyllysyl-glyclnu

K roztoku derivátu lysinu (5,2 g) a 1-hydroxybenztriazolu (1,76 g) v dimethylformamidu (15 ml) byl přidán roztok hydrobromldu amidu glycinu (2,0 g) a N-ethylpiperidlnu (1,78 ml) v dimethylformamidu (15 ml). Směs byla ochlazena na —10 °C a byl k ní přidán dicyklohexylkarbodiimid (2,7 g). Směs byla míchána 1 hodinu při —5°C a 16 hodin při teplotě místnosti. Dimethylformamid byl odpařen, odparek byl přelit vodou, ochlazen na 0 °C a pevný (podíl byl odfiltrován a promyt nasyceným roztokem N-aHCCb, vodnou 0,5 M HCí a opět vodou, Krystalizací z ethanolu bylo získáno 5,2 g (89 %) produktu o t. t. 155,5 až 156 °C,

R_f - 0,67 (Sl), 0,52 (S2), 0,66 (S3),

0,74 (S4), [«]d = —2,8° (c = 0,3, dimethylformamid) Pro C24H28N4O5 (454,5) vypočteno:

63,42 % C, 6,65 % H, 12,32 % N, nalezeno *

63,70 θ/ο C, 6,80 % H, 12,30 % N.

Amid lysyl-glycinu

K roztoku chráněného dipeptidu (45 mg) v kyselině octové (0,5 ml) byl přidán 4M NBr v kyselině octové (0,5 ml) a po 30 min. byl ke směsi přidán ether, vyloučený hydrobromid byl dekantován s etherem a vysušen; Rp = 0,13 (S3), 0,45 (S4),

E_{5 7} ^hís = 0,65, _ E_2j4 ^hís - 0,68.

Část produktu (2,6 mg) byla rozpuštěna v

0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,5 (260 μΐ) a k roztoku byl přidán roztok pelnicilinamidohydrolasy (135 μΐ; roztok enzymu byl připraven rozpuštěním 10 mg enzymu v 1 ml fosfátového pufru a roztok byl zcentrifugován) a voda (135 μΐ). Směs byla mknbována při 37 °C a vzorky byly odebírány po 90 minutách a 21 hodinách. Průběh reakce byl vyhodnocován chromatograficky a elektroforeticky ve srovnání s autentickými vzorky: R_f = 0,02 (S3), 0,08 (S4),

E„^His = 1,94,

E₂,₄ ^Hls = 1,37.

Příklad 2

Amid N^Ír-benzyloxykarbonylprolyl-N^£-fenylaceityllysyl-glycinu

K roztoku chráněného dipeptidu (2,26 g), v kyselině octové (10 ml) byl přidán 4M HBr v kyselině octové (10 ml) a po 30 minutách při teplotě místnosti byl hydrobromid dipeptidu vysrážen etherem, vyloučená sraženina byla odfiltrována, promyta etherem a vysušena. Hydrobromid byl rozpuštěn v dimethylformamidu (10 ml) a pH bylo nastaveno N-ethylpiperidinem na hodnotu 10 a byl k němu přidán roztok benzyloxykarbonylprollnu (1,25 g] a 1-hydroxybenztriazolu (0,68 g) v dimethylfiormamidu (10 ml). Směs byla ochlazena na —10 °C a byl k ní přidán dicyklohexylkarbodiimid (1,1 g). Směs byla míchána 1 hodinu při —10 °C a při teplotě místnosti 15 hodin. Vyloučená dicyklohexylmočovina byla odfiltroválna, dimethylformamid byl odpařen a odparek byl rozetřen s 2% HC1, pevný podíl byl odfiltrován a na filtru promyt vodou, nasyceným roztokem NaHCO3, vodou a etherem. Krystalizací ze směsi methanol—ether bylo získáno 2 g (72 %) produktu o t-1. 197 až 199 °C, [a)_D = —34,5° (c = 0,2, dimethylformamid),

R_F = 0,53 (Sl), 0,40 (S2), 0,50 (S3), 0,67 (S4), 0,77 (S7).

Pro C29H37N5O6 (551,6) vypočteno:

63,14 % C, 6,76 % H, 12,69 % N, nalezeno:

63,41 % C, 6,84 % H, 12,56 %N.

Amid prolyl-lysyl-glycinu

K roztoku chráněného tripeptidu (55 mg) v kyselině octové (0,5 ml) byl přidán 4M HBr v kyselině octové (0,5 ml). Po 30 minutách při teplotě místnosti byl hydrobromid ivysrážen etherem, promyt etherem a vysušen:

R_F - 0,18 (Sl), 0,50 (S4),

E_5j7 ^hís = 0,60,

E₂.₄ ^Gly = 0,98.

Hydrobromid tripeptid-amidu (2,3 mg) byl rozpuštěn, v 0,1 M fosfátovém puifru o pH

7,5 (260 μΐ) a k roztoku byl přidán roztok penicilinamidohydrolasy (Ϊ35 ,ul; roztok en218777 zymu byl připraven stejným způsobem, jak je popsáno v příkladu 1), a voda (135 /xl). Průběh reakce byl opět vyhodnocován chromatograficky a elektrofor eticky:

R_ř. = 0,08 (Sl), 0,05 (S4),

E₅,7^His = 1,44,

E₂,₄ ^His = 1,08.

Příklad 3

Amid S-benzyl-jS-merkaptopropionyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparaginyl-S-beinzylcysteinyl-prolyl-NMenylacetyl-lysyl-glycinu

K roztoku hydrazidu S-benzylmerkaptopropionyl-tyroisyl-fenylalanyl-glutamínyl-asparaginyl-S-henzylcysteínu (239 mg; Zaoral M., Kole ]., Šo-rm F.: Collect. Czechoslov. Chem. Commun. 32, 1250 [1967]) v dimethylformamidu (2,5 ml j byl přidán 1,6 M HCI v dioxanu (0,33 ml) a po ochlazení na —20 °C byl za míchání přidán butylnitrit (25,8 mg) v dimethylformamidu (1 ml). Směs byla míchána při —20 °C 20 minut, ochlazena na —40 °C a byl k ní přidán N-ethylpiperidin (na pH 7) a roztok hydrobromidu amidu prQlyl-N^£-fenylacetyllysyl-glycinu, předem připravený z chráněného tripepitidu (207 mg) způsobem popsaným v příkladu 2 a N-ethylpiperidinu (0,1 ml) v dimethylformamidu (2 ml), ochlazený na —40 °C. Směs byla ohřátá na 0 °C a při této teplotě nechána 3 dny stát. Dimethylformamld byl odpařen, k odparku byla přidána 2% kyselina chlorovodíková. Vzniklá sraženina byla odfiltrována a na filtru promyt-a vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Krystalizaci z 300 mg produktu, který byl dále čištěn gelo-vou filtrací v dimethylformamidu. Bylo získáno 280 mg (84 %) produktu o it. t. 223 až 225 °C, [of]_D = —42,6° (c = 0,2, dimethylformamid). Aminokyselinová analýza: Tyr 1,00, Phe 1,05, Glu 1,01, Asp 0,99, Lys 0,96, Pro 1,00, Gly 1,00, R_F =0,53 (Sl), 0,23 (S2), 0,60 (S3), 0,73 (S4), 0,67 (S7), 0,55 (Sil).

Pro C68H84Ni2Oi3Sz . 2 HzO (1377) , I ' vypočteno:

59,28 % C, 6,43 % H, 12,20 θ/ο N, l

nalezeno:

59,3-2 % C, 6,35 % H, 12,38 % N.

I

Cyklický disulfid β-merkaptopropionyl-tyrosyl-fenylalanyl-glutaminyl-asparagimyl-cysteinyl-prolyl-NMenylacetyllysyl-glyclnamidu

Chráněný nonapeptid (100 mg) byl rozpuštěn v kapalném amoniaku (100 ml) a za míchání redukován sodíkem do- modrého zabarvení přetrvávajícího 15 s. Přebytek sodíku byl rozložen NH4CI, kapalný amoniak byl odpařen ve vakuu vodní pumpy a vysušený odparek byl rozpuštěn v 0,01 M HCI (300 ml). Vodný roztok byl extrahován etherem, pH roztoku bylo nastaveno 0,1 M NaOH na hodnotu 6,75 a k roztoku byl za míchání přidán roztok 0,01 M K3Fe(CN)6 během 1 hodiny, přičemž pH roztoku bylo- udržováno na hodnotě 6,75. Potom pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 3,8 0,01 M HCI a roztok byl ly-ofilizován, Lyofilizát byl čištěn protiproudným roztřepáváním v systému 0,05% vodná kyselina -octová — 2-butanol (1 : 1). Bylo provedeno 50 posunů horní fáze, pík o rozdělovacím koeficientu K43 = = 6,14 byl zahuštěn na malý objem a lyofilizován. Produkt byl dále čištěn gelovou filtrací v 3 M kyselině octové. Bylo získáno 22 mg produktu o- [a]_D = —53,8° (c = 0,36, 50% kyselina octová), R_F -= 0,27 (Sl), 0,15 (S2), 0,31 (S3), 0,73 (S4), 0,66 (S7).

Pro C54H70N12O13S2.2 H2O (1195) vypočteno:

54,25 % C, 6,23 % H, 14,06 % N, nalezeno:

54,36 % C, 6,27 % H, 14,07 % N. Deamino-lysin-vasopresin

Chráněný cyklický nonapeptid (18 mg) byl rozpuštěn v 96% etheanolu (0,7 ml) a roztok byl zředěn vodou (6,3 ml). Penic-ilinamidohydrolasa (150 mg) byla rozpuštěna v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7 (5 ml), malá část nerozpuštěné látky byla odcentrifugována a roztok enzymu byl přidán k rozpuštěnému peptidů. Reakční -směs byla inkubo-vána 1 hodinu při 37 ³C, ochlazena na teplotu místnosti a okyselena 0,01 M HCI na pH 3. Denaturovaný enzym byl odcentrifugován a roztok byl odsolen pomocí měniče katio-ntů. Bylo· získáno 25 mg produktu, který byl čištěn beznosičovou elektroforézou v 0,5 M kyselině octové při napětí 2500 V. Bylo získáno 12,25 mg čisté látky o R_f = 0,10 (Sl), 0,40 (S4) a [a]_D = —89,8° (c = 0,2, IM kyselina oc-tová). Preso-rická aktivita, -stanovená na nefrektomisované kryse, byla 180 m. j./mg. Literatura uvádí hodnoty 125, 126 a 132 m. j./mg [du Vigneaud V., Winesto-ck G., Murti V. S. S., Hope D. B., Kimbrough R. D.: J. Biol. Chem. 235, PC 64 (1960); Kimbrough R. D., Cash W. D., Branda L. A., Chán W. Y., du Vigneaud V.: J. Biol. Chem. 238, 1411 (1963); Havran R. T.: Experlenta 29, 520 (1973)]. Aminokyselinová analýza: Lys 1,00, Asp 0,98, Glu 1,07, Pro 0,99, Gly 0,78, Tyr 1,02, Phe 1,14.

Pro C46H64N12O12S2. C2H4O2 (1101) vypočteno:

52,35 % C, 6,22 % H, 15,26 % N, nalezeno:

52,08 % C, 6,18 % H, 15,32 % N.

Claims (1)

1. Způsob výroby peptidů obsahujících lysin, vyznačený tím, že se pro chránění &-amimoskupiny lysinu používá fenylacetylová skupina, která se z vybudovaného pepti du odštěpí působením penicilinamidohydro lasy E. C. 3.5.1.11.