CS218516B1 - Způsob přípravy isoenzymů peroxidázy E. C. 1.11.1.7. z křenu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy velmi čistých preparátů isoenzymů peroxidázy, který využívá běžného, levného a snadno dostupného laboratorního vybavení. Isoenzymy Ai—A3 se na rozdíl od skupiny Isoenzymů B—E nezachycují na CM-celulóze stabilizované 0,005 M ootanovým pufrem, pH 4,1 až 4,7. Isoenzymy B—E se uvolní z vazby na CM-celulózu 0,040 až 0,060 M octanovým pufrem o tomtéž pH. Isoenzymy Ai—A3 se dočišťují dále vsádkovou chromátagbafií na CM-celulóze při pH 8,1 až 8,7 gradientovou elueí roztokem NaCl. Isoenzymy B—E lze získat stejnou metodou na DE- -celulóze při pH 8,1 až 8,7 v 0,005 M Tris- -HC1 pufru.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy velmi čistých preparátů peroxidázy z křenu (Airmořacia rusiticana). Týká se přípravy směsi isoenzymů E. C. 1,11.1.7., donor: H2O2 oxidoreduktázy. Isoenzymy peroxidázy mají široké využití v biochemické analytice pro svoji stálost, dobrou rozpustnost i aktivitu v nejširším rozmezí pH i pro snadnou analytickou sledovatelnost nejrůznějších oxidoredukčních produktů reakcí káiťalyzovaných právě tímto enzymem. Isdlace peroxidázy byla popsána četnými autory. Popsány isolační postup vychází z práce: Shannon, L. M., Kay, E., Lew, J. Y.: J. Biol. Chem. 241, 2166 (1966). Veškeré literárně doístupné práce předchozích autorů i práce výše citovaná využívají k isolaci složitých, nákladných, drahých a často nedostupných technik, preparativní elektro-f ořezy, kolonových chromatografií, vyžadujících jednak kolony samé, jednak sběrače frakcí, průtokové spektrofotometry a další zařízení těžko použitelná v průmyslové přípravě v preparaitivním měřítku.

Podstatou vynálezu je maximální zjednodušení dosud popsaných isolačních postupů takovým způsobem, že v preparativním měřítku není zapotřebí kolon, průtokových spektrofotometrů, čerpadel a sběračů frakcí. Většina z uvedených zařízení je v ČSSR těžko dostupná, pořizuje se se značnými finančními nebo i devizovými náklady nebo je zcela nedostupná. Navíc většina z uvedených zařízení je dimenzována pouze pro laboratorní přípravu malých kvant bílkovinného materiálu. Pořízení veikoobjemových kolon i velkokapacitních sběračů frakcí je u nás tedy značný problém. Navržený postup využívá běžného, levného, snadno dostupného laboratorního vybavení, jako jsou konve, odsávačky, frity.

Isoenizymy peroxidázy značené Ai—A3 se oddělí od skupiny isoenzymů B—E vsádkovou chromatografií na CM-celulóze při pH

4.1 — 4,7 v 0,005 M octanovém pufru a isoenzymy B—E se uvolní z celulózy následnou elucí oictanovým puf-rem o tomtéž pH a koncentraci 0,040 — 0,060 M, načež se případně chromatogirafieky dočistí. Isoenzymy Ai—A3 se dočišťují vsádkovou chromatografií opakovaně na CM-celulóze při pH

8.1 — 8,7 gradientovou elucí roztokem NaCl. IsoenZymy B—E se dočišťují Vsádkovou chromatografií na DE-celulóze při pH 8,1 až 8,7 elucí 0,005 M Tris-HCl pufrem.

P ř í k 1 a d

Křen (25 kg) se rožmixuje s 50 1 0,1 M středníhoi fosforečnanu draselného. Drť se vyždímá na běžné prádlové odstředivé ždímačce v silonovém pytli a extrakce drti se opakuje s 37,5 1 téhož roztoku. Extrakty se spojí. Spojené extrakty se naisytí 35 % síranu amonného a supernatant získaný po^ odsátí sraženiny se nasytí síranem amonným do finální koncentrace 90 %. Konečným produktem tohoto vysolení je sediment. Získá se hrubým odsátím čirého supernatantu a následnou centrifugací na průtokové odstředivce. Získaná sraženina se roizpustí v minimálním objemu destilované vody a dialyzuje přes noc proti lOnásobku chlazené destilované vody. Během dialýzy se vytvoří sediment, který se odstraní druhý den centrifugám při 3000 ot/min po dobu 20 min při 4-4 °C. Čirý supernatant je opět dialyzován přes noc proti lOnásoibku chlalzené destilované vody. Tato dialýiza se opakuje celkem třikrát. Dialyzát se volně zfiltruje pres papír a rozdělí na dva shodné alikvóity. První alikvót se zpracuje níže popsaným způsobem, druhý lze buď uložit při —50 ^CC, či usušit mrazovou sublimací a zpracovat posléze.

Celulóza CM-50 (Whatman) se nacykluje podle návodu výrobce a stabilizuje 0,005 M octanem sodným, pH 4,4. Jeden alikvót diályzátu se míchá po dobu 15 min se 4 1 dobře usázené, stabilizované suspenze celulózy. Suspenze se odsaje na fritě o huisitotě S3. Získaný supernatant obsahuje isoenzymy peroxidázy Ai—A3. Celulóza váže ostatní isoenzymy. Celulóza se potom promývá na fritě celkem asi 70 1 0,005 M octanu sodného, pH 4,4 do konstantního poklesu absorbance při 280 nm. Koláč celulózy se rozmíchá ve skleněné konvi ve dvou litrech 0,050 M octanu sodného, pH 4,4 a ponechá 5 min eluovát. Následuje odsátí. Ve filtrátu se sleduje poměr absorbancí při 403 nm a 2^!80 nm, tžv. RZ. Celý postup se opakuje buď do poklesu měřitelnositi absorbamce, či do poklesu RZ pod 0,35; frakce s RZ minimálně 0,35 se sp ojí. Tyto frakce obsahují isoenzymy Β—E. Isoenzymy Ai—A3 lze získat analogickým postupem při vysťabilizování celulózy DE-50 0,005 M Tris-HCl pufrem o> pH 8,4 a následným uvolněním isoenzymů 0,1 M chloridem sodným, připraveným v tomtéž pufru, čili gradientovou elucí NaCl. Výchozím materiálem pro dočišťování isoenzymů Ai— —A3 je dialýzou odsolená frakce Ai—A3, získaná z předchází chromatografie (výše popsané), upravená na 0,005 M vůči Trisu a upravená pomocí HC1 na pH 8,4. Isoenzymy Ai—A3 lze dočistit rechromatografií za těchže podmínek.

Spojené frakce obsahující isoenzymy Β—E se usuší mrazovou sublimací, rozpustí v minimálním objemu destilované vody a dialyzují po třikrát proti 20násobku chlazené destilované vody. Dialyzát se upraví na 0,005 M vůči Trisu (Tris = tris-hydroxy-aminomethan) a upraví kys. chlorovodíkovou na pH 8,4. Takto upravený dialyzát se vyčisti vsádkovou chromatografií na celulóze DE-50 (Whatman). Celulóza DE-50 se nacykluje podle návodu výrobce a stabilizuje 0,005 M Tris-HCl, pH 8,4. Suspenze vysíabilizované celulózy se míchá s upraveným dialýzátem po dobu 5 min. Potom se odsaje na fritě S3 a získaný filtrát se opět proměřuje při 403 a 280 nm (RZ). Tento postup se opakuje íbuď do poklesu absorbancí frakcí, či do 'poklesu RZ pod 2,6. Frakce o RZ vyšším než 2,6 se spojí, dialyizují a mrazově sublimují. Získaný produkt je směsí isoenzymů peroxidázy Β—E, vhodnou jako vysoce čistý preparát peroxidázy k jakýmkoliv dalším biochemickým experimentům, např. .k navázání na protilátky při metodách ELISA či k enzymclogickým experimentům.

Claims (3)

1. Způsob přípravy isoenzymů peroxidázy E. C. 1.11.1.7. z křenu, vyznačený tím, že isoenizymy Ai—As se oddělí od skupiny isoenzymů B—E vsádkovou chromatografii na CiM-celulóze při pH 4,1 — 4,7 v 0,005 M octanovém pufru a isoenzymy B—E se uvolní z celulózy následnou elucí octanovým pufrem o tomtéž pH a koncentraci 0,040 až 0,060 M, načež se případně chroimatograficky dočistí.

VYNALEZU

2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že isoenzymy Ai—As se dočišíují všádkoivou chromatografii opakovaně na DE-celulóze při pH 8,1 — 8,7 gradientovou elucí roztokem NaCl.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že isoenzymy Β—E se dočisti vsádkovou chromatografii na DE-celulóze při pH 8,1 až 8,7 elucí 0,005 M Tris-HCl pufrem.