CS215891B1 - činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras - Google Patents

Abstract

Vynález se týká činidla pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras. Tyto látky jsou významné pro klinickou enzymologii; jejich stanovení je důležitým diagnostickým prostředkem noužívaným v humánní medicíně při onemocnění jaterního parenchymu, žlučových cest, kostního aparátu apod. činidlo podle vynálezu obsahuje dané množství sodíku. Dále může činidlo obsahovat dané množství neutrálního plnidla na bázi draselných solí, glukosy nebo sacharosy, pufru s obsahem D(-)-N-methylglukaminu a D(-)-N-methylgluksminiumchloridu, hořčíku ve formě soli a popřípadě vody.

Description

Předmětem vynálezu je činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesterae.

Alkalické fosfomonoesterasy představují skupinu enzymů významných zejména pro klinickou enzymologii. Jejich stanovení je důležitým diagnostickým prostředkem při onemocnění jaterního parenchymu, žlučových cest, kostního aparátu a podobně. Toto stanovení je běžnou součástí palety enzymových vyšetření, prováděných i v základních laboratorních nemocničních odděleních.

Stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesterae se většinou provádí tak, že se vzorek biologického materiálu, obvykle krevní sérum, plasma, likvor, mléko a podobně, smíchá s vhodným pufrem o pH 9,5 až 10,8. Po vytemperování na požadovanou teplotu, obvykle 25, 30 nebo 37 °C, se enzymová reakce nastartuje roztokem chromogenního substrátu a měří se zrnina absorbance inkubačního média v čase. Měření se provádí bud kineticky, sledováním změny dA/dt, nebo diskontinuálně, po zastavení enzymové reakce vhodným inhibitorem. Aktivita enzymu ve vzorku je úměrná absorbanci, to je množství produktů enzymové hydrolýsy substrátu. Nejčastěji se měří v alkalickém prostředí žlutě zbarvený nitrofenol.

Výtěžek enzymové reakce závisí nejen na katalytické aktivitě enzymu, ale jé výrazně ovlivněn reakčními podmínkami, zejména složením inkubačního média. Závisí na druhu, pH, koncentraci a čistotě pufru, na druhu a koncentraci substrátu, teplotě a přítomnosti modifikátorů katalytické aktivity. Modifikátory rozumíme další látky vnášené do inkubačního média buď záměrně, nebo jako příměsi nebo nečistoty obsažené v použitých chemikáliích, nebo i ve vzorku biologického materiálu, které mohou enzymovou reakci aktivovat nebo inhibovat.

V poslední době se jako substrátu užívá téměř výhradně 4-nitrofenylfosfátu ve formě různých anorganických nebo organických solí, například dvoj sodné a dvojamonné soli nebo soli s tris(hydroxymethyl)aminomethanem, dicyklohexylaminem a podobně.

Jako pufry se užívají tak zvané transfosforylaění pufry na bázi alifatických aminoalkoholů. Jsou to například diethanolamin, 2-amino-2methyl-l-propanol, 2-amino-2-methyl-1,3-propanol nebo D(-)-N-methylglukamin a další látky. V těchto pufrech vykazují alkalické fosfomonoesterasy vysokou katalytickou aktivitu. Jak je však patrné z publikací v odborném tisku má řada těchto látek^závažné nevýhody. Zejména kapalné, polotuhé nebo voskovité alifatické aminoalkoholy, například diethanolamin, 2-amino-2-methyl-l-propanol a další, obsahují často nečistoty, které výrazně a proměnným způsobem, v závislosti na jejich koncentraci, snižují katalytickou aktivitu alkalických fosfomonoesterae, a to až o 30 $>. Tyto látky přitom nelze jednoduše odstranit. Diethanolamin má další závažnou nevýhodu, nebot aktivita většiny isoenzymů, s výjimkou placentárního, neustále vzrůstá s rostoucí koncentrací pufru a není tedy dosaženo společného pracovního optima.

Aktivitu alkalických fosfomonoesteras může významně ovlivnit přítomnost dalších modifikátorů enzymové reakce. Je například známo, že analysovaný vzorek má být v inkubačním médiu vhodným způsobem ředěn, nebot s jeho stoupající koncentrací se obvykle výsledná aktivita enzymu snižuje. Menší změny katalytické aktivity působí i kolísání iontové síly prostředí. Některé látky, například hořčík, chrání termolabilní isoenzymy alkalické fosfomonoesterasy před tepelnou denaturaci během inkubace. Látky schopné komplexovat· hořčík a těžké kovy naopak silně inhibují.

Výtěžek enzymové hydrolýsy a reprodukovatelnost stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras závisí na celé řadě vzájemně se podmiňujících faktorů, které dosud nebyly dostatečně a úplně specifikovány. Je například známo, že se i různé výrobní šarže diagnostických souprav chemikálií pro stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras stejné provenience značně liší, což je připisováno vlivu zatím nespecifikovaných látek přítomných v použitých chemikáliích. Podobné zkušenosti jsou známy i při přípravě Činidel v laboratoři spotřebitele. Stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras je proto ěasto zatíženo neúměrně vysokou chybou a rozptylem, jež snižuje diagnostickou hodnotu tohoto vyšetření a komplikuje nebo dokonce znemožňuje dynamické sledování změn katalytické aktivity tohoto enzymu. Je tedy žádoucí, aby činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras obsahovalo látky a substance takového druhu, čistoty a koncentrace, jež by uvedené nedostatky snižovaly na co nejmenší míru.

K odstranění shora uvedených závad směřuje činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras na basi 4-nitrofenylfosfátu jako substrátu, vyznačené tím, že na 1 mol substrátu obsahuje 3,5 až 22,5 molů iontu sodíku ve formě sodné soli a oopřípadě neutrální plnidlo například chlorid, síran nebo dusičnan draselný, glukosu nebo'sacharosu a popřípadě pufr na bázi D-(-)-N-methylglukaminu' a jeho chloridu a popřípadě hořčík ve formě soli, například chlorid, síran nebo dusičnan horečnatý, a popřípadě vody.

Jako neutrální plnidla obsahuje činidlo například chlorid, síran nebo dusičnan draselný, glukosu nebo sacharosu v množství 1,5 až 25 molů, vztaženo na 1 mol substrátu, činidlo dále obsahuje D(-)-N-methylglukamin a D(-)-N-methylglukaminiumchlorid ve vzájemných molárních poměrech 1 s 0,11 až 1 s 0,25. činidlo dále obsahuje 0,005 až 0,4 molu iontů hořčíku ve formě soli, například chlorid, síran nebo .dusičnan horečnatý, vztaženo na 1 mol substrátu.

Jako substrát lze S výhodou použít 4-nitrofenylfosfát ve formě sodné, amonné nebo draselné soli nebo vhodné organické solí. Při užití sodné soli je nutné kalkulovat v celkovém .množství sodíku v činidle se sodíkem vneseným do činidla substrátem. Je výhodné připravit substrát s požadovaným množstvím sodíku, například ve formě pevné směsi nebo tablet, nebot vodné roztoky substrátu jsou jen omezeně stálé. Požadované množství iontů sodíku lze vnést do činidla ve formě chloridu, síranu nebo dusičnanu draselného. Jak bylo nalezeno, má sodíkový kation specifický aktivační účinek, zejména na sérové alkalické fosfomonoesterasy, a zvyšuje jejich katalytickou aktivitu za daných podmínek v průměru o 14 %, s variačním rozpětím od 2 až do 45 %, podle typu biologického materiálu. Sodík v činidle nejen zvyšuje katalytickou aktivitu enzymu, ale zejména zamezuje kolísání aktivity enzymu vlivem malých změn koncentrace sodíku v činidle i v inkubačním médiu, upůsobených například ředěním vzorku, úpravou pH pufru hydroxidem sodným při jeho přípravě, přítomnosti sodíku v substrátu a podobně. Přítomnost sodíku v činidle podstatným způsobem zvyšuje správnost a reprodukovatelnost stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras.

Neutrální plnidla, jak bylo experimentálně ověřeno, neovlivňují aktivitu enzymu.

Usnadňují zejména výrobní a djustační operace spojené a homogenisací činidla, jeho tabletováním, dávkováním pevné směsi při odvažování a podobně.

D(-)-N-Methylglukaminový pufr se připravuje s výhodou kombinací báze s hydrochloridem.

Na rozdíl od většiny dosud běžně užívaných aminoalkoholů je D(-)-N-methylgluk&min pevná látka vysoké čistoty β definovaným bodem tání a neobsahuje inhibitory alkalické fosfomonoesterasy. Má současně disociační konstantu v oblasti optimálního pH pro stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras. Zaručuje vysokou pufrovací kapacitu činidla. Další výhodou tohoto pufru je experimentálně potvrzená skutečnost, že. pro všechny isoenzymy alkalické fosfomonoesterasy existuje společné optimální pH i koncentrace pufru.

Hořčík je nutné vnést do inkub^čního média v činidle spolu s pufrem, aby byl zaručen jeho ochranný účinek během preinkubační fáze. Může být přidáván s výhodou ve formě síranu, chloridu nebo dusičnanu.

činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras je s ohledem na převažují-, cí kinetický způsob stanovení katalytické aktivity enzymu vhodné připravit ve formě dvou oddělených reagencií, a to pufru obsahujícího současně hořčík a substrátu obsahujícího požadované množství sodíku. Obě reagencie lze připravit v kapalné nebo pevné formě a před použitím je ředit nebo rozpouštět ve vodě.

činidlo podle vynálezu zaručuje optimální a zejména konstantní podmínky pro stanovení katalytické aktivity alkalických fosfomonoesteras, rainimalisuje kolísání aktivity vlivem přítomnosti modifikátorů a umožňuje unifikaci tohoto důležitého vyšetření v celém oboru klinické biochemie, činidlo lze snadno vyrobit z dostupných surovin.

Příklad 1

Připraví se 2 ml vodného roztoku obsahujícího 64 mg dvoj sodné soli 4-nitrofenylfosfátu a 200 mg chloridu sodného.

Příklad 2

Připraví se pevná směs obsahující 220 mg dvojamonné soli 4-nitrofenyl'fosfátu, 550 mg chloridu sodného a 730 mg chloridu draselného. Před použitím se rozpustí ve 20 ml vody.

P-íklad 3

Připraví se 200 ml D(-)-N-methylglulíaminového pufru o koncentraci 0,55 mol. a pH 10,5 (při 25 °C), obsahujícího 1 mmol.l^-^ síranu horečnatého.

Připraví se 50 ml vodného roztoku obsahujícího 45 mmol.l^-! 4-nitrofenylfosfoátu a 250 mmol.l^-^· síranu sodného. Přpd použitím se oba roztoky smíchají v poměru 4 ! 1.

Příklad 4

Připraví se tablety činidla obsahující 40 mg dvojamonné soli 4-nitrofenylfosfátu,. 40 mg chloridu sodného a 120 mg síranu draselného. Před použitím se rozpustí 1 tableta ve 4 ml vody.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. činidlo pro stanovení aktivity alkalických fosfomonoesteras na bázi 4-nitrofenylfosfátu jako substrátu, vyznačené tím, že na 1 mol substrátu obsahuje 3,5 až 22, 5 molů lontů sodíku ve formě sodné soli a popřípadě neutrální plnidlo, například chlorid, síran nebo dusičnan draselný, glukosu nebo sacharosu a popřípadě pufr na bázi D-(-)-N-methylglukaminu a jeho chloridu a popřípadě hořčík ve formě soli, například chloridu, síranu nebo dusičnanu hořečnatého, a popřípadě vody.
2. 2. Činidlo podle bodu 1, vyznačené tím, že jako neutrální plnidlo obsaiiuje například chlorid, síran nebo dusičnan draselný, glukosu nebo sacharózu v množství 1,5 až 25 molů, vztaženo na 1 mol substrátu.
3. 3. činidlo podle bodu 1, vyznačené tím, že obsahuje D(-;-N-methylglukamin a D(-;-N-methylglukaminiumchlorid ve vzájemných molárních poměrech 1 ί 0,11 až 1 : 0,25.
4. 4. činidlo podle bodu 1, Vyznačené tím, že obsahuje 0,005 až 0,4 molu iontů hořčíku ve formě soli, například chloridu, síranu nebo dusičnanu hořečnatého, vztaženo nn 1 mol substrátu.