CS215388B1 - Nový kmen Chlamydomonas qeitleri ETTL kmen N-Ae - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nového produkčního průmyslového kmene řasy Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1 produkujícího biomasu, který je schopný dobrého růstu za čistě autotrofních podmínek kultivace a je použitelný při dočištování mírně znečištěných odpadních vod močovinou, amonnými solemi a octanem. Jeho vzorek je uložen ve Sbírce kultur autotrofních mikroorganismů v Botanickém ústavu ČSAV v Třeboni pod ě. A 777.

Description

Vynález se týká nového průmyslového kmene řasy Chlamydomonas geitleri kmen N-Ac 1, produkujícího biomasu, jehož vzorek je uložen ve Sbírce kultur autotrofních mikroorganismů v Botanickém ústavě ČSAV v Třeboni pod č. A 777.

V masových kulturách pro produkci řasové hiomasy a jejich hospodářsky významných složek se dosud pěstují převážně chlorokokálni řasy, ale některé vhodné druhy rodu Chlamydomonas se v těchto kulturách již také uplatnily (viz. např. BURLEW, J. S. ed.): Algal culture from laboratory to pilot plant, Carn gie Inst. Wash. Publ. 600, Washington, 357 p., 1964; NEČAS, J. (ed.): Izučenije intěnsivnoj kultury vodoroslej I., ČSAV, Třeboň, 290 p., 1965; NEČAS, J. (ed.): Izučenije intěnsivnoj kultury vodoroslej II., ČSAV, Třeboň, 293 p., 1975). V poslední době se řasy uplatňuji v biologickém čištění odpadních vod a při biologické koncentraci vzácných látek ze zředěných roztoků. Také v této oblasti se dobře osvědčují volvokální řasy (SOEDER, C. J. a BINSACK, R. (ed.): Microalgae for food and feed (Ergebnisse der Limnologie, Heft 11), E. Schweizerbart, Stuttgart, 299 p., 1978).

Pro všechny standardní kultury Chlamydomonas geitleri, kam přísluší nový kmen, je charakteristické (ETTL, H.: Nova Hedwigia 49, J. Cramer, Vaduz, 1122 p., 1976): Buňky 20 až 24 μιη dlouhé a 15 až 22 μιη široké jsou vejčité nebo vejčitě elipsoidní, vpředu poněkud zúžené, na bázi více zakulacené. Někdy mají poněkud asymetrickou formu, alt: neodchylují se příliš od základního tvaru. Mladé dceřiné buňky nabývají vejčitého tvaru ještě uvnitř mateřské buňky. Buněčný obal je poměrně pevný, ale ne příliš tlustý, nejčastěji dobře přilehá k protoplastu. Buňky předcházejí vpředu ve zřetelnou, ale ne zvlášť nápadnou papilu. V rovině nasazení bičíků je papila zkosená s mírně zvýšeným okrajem a bičíky vybíhají ze dvou vychlípených hrbolků. Bičíky jsou asi dvakrát tak dlouhé jako podélný rozměr buňky. Chloroplast je nástěnný, plášťovitý, vybíhající v četné laloky a vyznačující se hlubokými zářezy, hvězdicovitě se rozbíhajícími. U mladých buněk je chloroplast méně členitý, s jejich růstem členitosti přibývá. Pyrenoid je zřetelný, dosti velký, elipsoidní, okrouhlý nebo až polygonální, uložený v nápadné ztlustlině chloroplastu, zpravidla blízko poloviny delšího rozměru buňky nebo blíže báze buňky. Někdy je členěn do dvou až tří dílů vzájemně spojených. Červená, světločivá skvrna je dosti veliká. Jádra buňky jsou v přední části buňky. Zpravidla dvě pulsující vakuoly bávají rovněž umístěny v přední třetině buňky, blíže papily.

Vegetativně se množí dělením na 2, 4, 8, 16 dceřiných buněk podle růstových podmínek, za kterých probíhají buněčné cykly (TETÍK, K. a NEČAS, J.: Arch. Hydrobiol. (Suppl 51), Algological Studies 19: 164—183, 1977). Během dělení mizí pyrenoid a světločivná skvrna a chloroplast se tvarově zjednodušuje. Vyvinuté zoospory se uvolňují rozšířeným otvorem v obalu mateřské buňky.

Pohlavně se množí jen po indukci přechodu buněk z buněčného do životního cyklu (např. převodem do bezdusíkatého média). Potom se z vegetativních buněk vytvářejí isogamety. Nový kmen je stejně jako kmen homothalický (NEČAS, J. a PAVINGEROVÁ, D.: Arch. Hydrobiol. (Suppl.), Algological Studies (v tisku), (1980). Isogamety mají tvarově zjednodušený chloroplast. Po splynutí gamet se vytvářejí kulovité zygoty (průměr 12 až 16 z<m) s pevnou, tlustou, na povrchu hluboce zvrásněnou stěnou. Zygoty klíčí hromadně a rovnoměrně teprve po třítýdenním až čtyřtýdenním zrání ve tmě po přenesení na světlo. Vznikají z nich nej častěji 4, vzácněji 8 zoospor, které se mohou libovolně dlouho množit, opět vegetativně.

Fyziologické a biochemické charakteristiky druhu Chlamydomonas geitleri jsou dosud jen málo prostudovány, neboť druh byl popsán teprve v roce 1969. Již v tomto popisu se upozorňuje na možnost očekávat u něho zvýšené fotosyntetické produkce i v nižších úrovních ozáření vzhledem ke stavbě chloroplastu. Potvrdilo se to již v prvních studiích jeho produkční aktivity. Produkčně významná je schopnost Chlamydomonas geitleri . růst a produkovat biomasu za mnohem· nižších teplot, než je tomu u dosud převážně používaných chlorokokálních řas v produkčních velkokulturách (10 až 25 °C). Tento druh není vhodný pro kultury rostoucí v teplotách nad 30 °C. Vyšší teploty nejdříve brzdí a potom zcela blokují průběh buněčných cyklů.

Běžným způsobem růstu a produkce biomasy je pro Chlamydomonas geitleri autotrofie. Schopnost růst v médiích s octanem sodným za mixotrofních nebo i čistě heterotrofních podmínek může být šlechtitelským cílem podle analogie s jinými druhy rodu Chlamydomonas. Regulace metabolismu změnami růstových podmínek nebylo u tohoto druhu dosud propracována.

Nové druhy v rámci druhu Chlamydomonas geitleri, vhodné pro různé způsoby svého praktického použití, je možno získávat výběry v rámci populací vykazujících přirozenou dědičnou variabilitu nebo po její indukci účinnými mutageny. Vzhledem k možnosti indukce gametogenese u tohoto druhu je možno využívat pro tvorbu nových forem také hybridisace. V široce variabilních populacích kmenů sbírkových nebo isolovaných z přírody je možno získávat nové typy hromadnými výběry dlouhodobým pasážováním kultur v selektivních médiích nebo za selektivních růstových podmínek. Jedinci se změnami větších rozměrů se isolují individuálními výběry a vedením isolátů v udržovací kultuře s opakovaným klonováním.

Původ nového kmene

Chlamydomonas geitleri kmen N-Ac 1 se získal několikaletou pasáži isolovaného potomstva jedné zygoty z prokřížení původní kultury po indukci gametogenese. Dlouhodobou pasáží tohoto potomstva za mixotrofniho růstu v médiu A 41 (Prát et al. 1971) s dvojnásobnou koncentrací živin a s 0,1 % octanem sodným se získala populace buněk, které již dobře rostou na tomto médiu. Původní kmen na něm záhy po naočkování buď zcela odumírá, nebo jenom živoří. Pasáží se zřejmě vyselektovaly klony schopné růstu na médiu s acetáty. Současně se zjistilo, že roste rovněž dobře na agarovém médiu s močovinou a čpavkovou formou dusíku. Původní kmen roste jen v tekutém médiu také s močovinovou formou dusíku, ale nikoliv na agarovém médiu s touto formou dusíku. Nový kmen má tedy širší použití co se týče typu použitelných médií a bylo možno ho také použít ve zkušebních kulturách dočišťujících odpadní vody za snížených teplot ve venkovních kulturách.

Morfologické, vývinové a fysiologické charakteristiky nového selektovaného kmene Chlamydomonas geitleri N-Ac 1 je možno shrnout takto:

Morfologické a cytologické znaky

Morfologické a cytologické znaky nového kmene se dobře shodují s' popisem standardní kultury Chlamydomonas geitleri, (Ettl 1976), jak je uveden vpředu (obr. 1 a 2). Za nízkých teplot nebo naopak při teplotách nad 30 °C, kde je inhibován průběh buněčného cyklu, mohou buňky tohoto kmene dosáhnout větších rozměrů. V podmínkách intenzivního růstu převládají buňky dělicí se na vyšší počty zoospor (8 nebo 16).

Fysiologické znaky

Fysiologické znaky jsou u původního nového kmene dosud jen málo prostudovány. Biotechnologicky významná je schopnost růst a produkovat biomasu za snížených teplot (rozmezí 5 až 28 °C). Schopnost růst v prostředí s dusíkem ve formě močoviny a čpavku, který se z ní uvolňuje, i v prostředí s očtanem (tab. 1), rozšiřuje možnosti jeho použití v experimentech a pro jiné praktické účely (např. k dočišťování odpadních vod - (tab. 2).

Biochemické znaky

Analýza biomasy, původního kmene v komerční analytické laboratoři ukázala obsah bílkovin v sušině nad 60 % (Tetík 1979) a také příznivé aminokyselinové složení (tab. 3). Lze předpokládat, že nový kmen se v tomto směru od původního kmene významně neliší.

Kultivační charakteristika

Chlamydomonas geitleri kmen N-Ac 1 je možno dobře využít zejména pro autotrofní, ale také pro mixotrofní kultivace v médiích s octanem sodným (0,1 až 0,2 %), a to v kultivačních zařízeních různých typů, mohou-li se přizpůsobit potřebnému režimu kultivace pro tento týp řas. Dobré produkční výkony je možno od nového kmene očekávat i za nižších teplot a nižších úrovní ozáření (Tetík a Nečas 1977). V mixotrofních kulturách s pomalým, ale stálým přísunem acetátu se dosáhne zlepšení fysiologické kondice buněk, a to i v indukčních podmínkách pro přechod z buněčných do životních cyklů (Nečas a Pavingerová 1980). Základní produkční charakteristiky kmenů isolovaných v rámci druhu Chlamydomonas geitleri jsou podrobněji popsány v důkladnějších studiích (Tetík, K. a Nečas J.: Arch. Hydrobiol. (Suppl. 51), Algological Studies 19: 164—183, 1977).

Z uvedených charakteristik je patrno, že nový kmen Chlamydomonas geitleri N-Ac 1 se shoduje s popisem standardní kultury Chlamydomonas geitleri ETTL téměř ve všech hlavních morfologických znacích, které jsou významné pro jeho rodovou i druhovou příslušnost.

Liší se však od něho v některých fysiologických a kultivačních charakteristikách. Selektovaný kmen je mnohem vyrovnanější v klonové skladbě, čehož se dosáhlo vnitřním prokřížením výchozího kmene po předchozí indukci gametogenese. Z vybraných potomstev jednotlivých isolovaných zygot se pomocí dlouhodobých pasáží isoloval nový kmen, který proti velmi vyhraněné autotrofii původního kmene je schopen i dlouhodobě růst na močovinovém agarovém médiu s acetátěm. To umožňuje použít nový kmen i v podmínkách pozvolného přísunu octanu a močoviny do čistě minerálního média a zvyšovat tak produkci biomasy při omezeně mixotrofních podmínkách kultivace. Nový kmen je také možno použít k dočišfování mírně znečištěných odpadních vod zmíněnými organickými látkami. Protože nový kmen je potomstvem zygoty, je v tomto kmeni zachována určitá potenciální dědičná variabilita, která umožní při dalším vnitřním prokřížení nebo pomocí indukce mutačního procesu z něho další nové typy pro jejich různé specifické použití.

Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1

Kmen získaný z výchozího kmene Chlamydomonas geitleri ETTL kmen ETTL 1966/3 dlouhodobou pasáží za podmínek mixotrofního růstu na agarových médiích s močovinou, amonnými solemi a oetanem sodným.

Roste:

a) dobře za podmínek čisté autotrofie na minerálních médiích typu Bjórkman et. al. (1955) Solution Nr 2 při 1/4 koncentraci a především s nitrátovou (Šetlík 1968), ale také čistě močovinovou formou dusíku (Nečas 1971). Dlouhodobé sbírkové kultury se dobře udržují na agarovém médiu typu Prát et. al. (1971) - Solution Nr A 41 s dvojnásobnou koncentrací a s 10 ml půdního dekoktu na 1 1 média;

b) velmi dobře za podmínek omezené mixotrofie při stálém mírném přísunu octanu sodného do čistě minerálního média (Šetlík 1968) v poloviční koncentraci při osvětlení kultury podle odpovídajícího vztahu teploty a ozáření.

Dále jsou uvedeny tabulky, a to tabulka 1, kde je provedeno srovnání růstu původního a nového kmene řasy na různých médiích, tabulka 2, která sleduje růst nového kmene ve vakuových podmínkách, a tabulka 3, kde je uvedena analýza aminokyselin v čisté bílkovině této řasy.

Tabulka 1 Růst původního a nového Jcmene Chlamydomonas geitleri ETTL na médiích různého složení

Typ	Kmen	Kmen
média	ETTL 1966/3	N-Ac 1
1	—	+ +
2	—	++++
3	+ +	++
4	—	++

Typy kultivačního média:

1: živný roztok č. 2 podle Bjorknian et al. (1955) ve 1/4 koncentraci;

2: týž živný roztok jako č. 1 s 0,10 % octanu sodného;

3: živný roztok podle Šetlik (1968) v poloviční koncentraci a dusík ve formě KN0₃;

4: týž živný roztok jako č. 3 s 0,10 % octanu sodného.

Tabulka 2 Růst nového kmene Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1 ve venkovních podmínkách

Doba kultivace (dnů)	Optická hustota (E7.0)	Teplota (°C)	pH
0	2,0
1	2,3
2	2,7
3	3,1
4	3,8	>0	CC 00
5	4,5	>ES)
6	5,1	I-	CC
7	6,0		cO
8	7,3
9	9,4
10	10,6

Kultivace na odpadní vodě při zředovaeí rychlosti 0,1 den“¹:

Odstraněno 53 % dusíku a 77 % fosforu.

Tabulka 3 Obsah aminokyselin v čisté bílkovině řasy Chlamydomonas geitleri ETTL

Amino- kyselina	Obsah v čisté bílkovině (%)	Amino- kyselina	Obsah v čisté bílkovině (%)
lysin	6,79	glycin	6,12
histidin	2,19	alanin	8,02
arginin	10,04	valin	6,22
cystin kys. aspara-	0,67	methionin	2,65
gová	6,38	isoleucin	4,56
threonin	5,39	leucin	9,11
šeřin kys. gluta-	4,87	tyrosin	3,99
mová prolin	12,44 4,77	fenylalanin	5,79

Dále jsou uvedeny obr. 1 a 2. Obr. 1 znázorňuje vegetativní buňky Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1, obr. 2 představuje kulturu Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1.

Claims (1)

1. Nový produkčně průmyslový kmen Chlamydomonas geitleri ETTL kmen N-Ac 1 produkující biomasu, schopný dobrého růstu za čistě autotrofních podmínek kultivace, použitelných při dočišfování mírně znečištěných odpadních vod

   YNÁLEZU močovinou, amonnými solemi a octanem, jehož vzorek je uložen ve Sbírce kultur autotrofních mikroorganismů v Botanickém ústavu ČSAV v Třeboni pod č. A 777.