CS214056B1 - způsob kontinuální výroby α-amylázy - Google Patents

Abstract

Předměte· vynálezu je způsob kontinuální výroby alfa-aaylázy. Jako produkční kmen se používá a výhodou Bacillus amyloliquefaciens A 32 CCM 3502. Vynález spočívá v přesné regulaci zřeďovací rychlosti a v udržováni hladiny cukru v médiu během kontinuálního procesu na maximálně 3 g/1 při pH 7,2 až 7,8.

Description

Vynález ee týká způsobu výroby o^-amylázy kontinuální fermentaoi mikroorganismů.

Ke štěpení škrobu se užívají amylolytické enzymy různého původu. Jde především o amylázy rostlinného původu, které jsou obsaženy např. v ječmenném sladu. Pro nedostatek těchto rostlinných surovin a pro některé speciální účely, kdy je nutné mlt k dispozici pouze jeden z komplexu amylolytických enzymů, ee hledaly jiné zdroje a jako nejvýhodnějěí se ukázaly mikroorganismy, které jsou schopny produkovat bud směs, nebo jeden ze tří základních typů amylolytických enzymů, a to <7Č-amylázu (E.C.3.2.1.1.), která se nahodile štěpí o<-D (1,4) vazby v molekule škrobu a dextrinů, a konečným produktem její činnosti jsou oligodeztriny a maltóza. Tento enzym neštěpí °<-D (1,6) vazbu v amylopektinu. Dalšími typy jaou /5-amyláza (E.C.3.2.1.2.) a glukoamyláza (E.C.3.2.1.3.), (T.E.Barman Enzyme Handbook, Springer - Verlag Berlin Heidelberg New York 1969).

K produkci ^-amylázy se z mikroorganismů používají bud plísně, např. Aspergillus Oryzae, Penicillium expansum, a bacily, jako Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (J.C.Johnson. Industrial Enzymes, Noyes Data Corporation, New Jersey, USA, 1977).

Známý způsob výroby enzymu «-amylázy sa provádí periodicky (vsádkově) kultivací na médiích obsahujících škrob a anorganické soli. Vyprodukovaný enzym se pak různým způsobem z média izoluje nebo se jen médium zahustí. Je známo, že uvedený způsob má řadu nevýhod, zejména: dlouhou dobu potřebnou k nárůstu mikroorganismů, vypouštění a čištění fermentoru po každé vsádco, časové ztráty vznikající po zaočkování, častou přípravu inokula a obtížnou automatizaci a řízení procesu. Proto se již řadu lot studují možnosti, jak převést jednorázovou produkci enzymů na kontinuální proces, obdobný, jaký se používá při produkci mikrobnl biomasy nebo mikrobitím čištění odpadních vod. Jak vyplývá z literatury, zatím se tento problém pro exocelulárňí enzymy, jakými jsou amylázy nebo proteázy nepodařilo vyřešit, neboť v průběhu kontinuálního procesu začne hladina enzymu a specifická rychlost produkce klesat. L. G. Leglnova, I. A, Tsaplina, Mikrobiologyia, Vol. 45, No. 3. p. 395, 1977, a dále U. S. Patent 3.826 715.

I když se v některém případě v kontinuálním procesu podařilo zvýšit celkovou produkci některého z těchto exocelulárňích enzymů, bylo to na úkor jeho koncentrace, čímž ae ztížila izolace enzymu do té artry, žo žádný z těchto postupů nebyl ve výrobě realizován. Důvodem byla i skutečnost, že šlo o vícestupňové postupy, čímž ae celý proces velmi komplikoval.

Hydrolytické enzymy, jako jsou amylázy a proteázy, jeou u bacilů syntetizovány až na konci exponenciální fáze růstu populace a během stacionární fáze před začátkem sporulace, neboť přebytek glukózy reprimujo syntézu těohto enzymů. Proto i zřeáovací rychlosti, které byly v kontinuálním procesu používány, byly nízké a odpovídaly růstové rychlosti na konci růstové fáze populace. Bylo zjištěno, že při těchto nízkých zřeáovacích rychlostech, kdy jeou růstové látky v médiu do značné míry vyčerpány, jsou v populaci bakterií preferovány neprodukční varianty, neboť tyto varianty jsou za podmínek omezeného růstu životaschopněJéí než buňky produkující enzym. Tímto selekčním tlakem eo mění složení populace a výsledkem je pokles produkce enzymu. Proto so ukázalo, jako nutná podmínka, pracovat v kontinuálním procesu s kulturou, která so během kultivace neštěpí, to znamená, že je dostatečně stabilní, a zabránit přerůstáni neprodukčnioh variant dostatečně vysokou hladinou živin, eož eo

214 056 projevuje i vyšší růstovou rychlostí.

Tyto nevýhody odstraňuje způsob kontinuální výroby <Λ -amylázy fermentaci mikroorganismů, jehož podstatou je, že se produkční aktivita kontinuálně fermentovahého mikroorganismu, který produkuje «<--amylázu, udržuje regulací zřeďovací rychlosti v rozmezí mezi 0,18 - 0,32 (h^-1), hladina redukujících cukrů v médiu, přepočtená na maltózu, v průběhu kontinuálního procesu se udržuje maximálně na 3 g/1 a pH se řídí autoregulacl v rozmázl 7,2 až 7,8. Jako vysokoprodukčnl kmen mikroorganismu pro kontinuální výrobu at-amylázy je výhodné použít zejména kmen Bacillus amyloliquefaciens, uložený ve sbírce mikroorganismů pod č. CCM 3502 nebo kmen Bacillus subtilis A 32.

K produkci bylo použito několik typů médií. Jako zdroj uhlíku sloužil bud čistý ěkrob, nebo rostlinné substráty obsahující škrob, jako např. rozemletá zrna, otruby apod. Obsah škrobu v kultivační půdě se může pohybovat od 0,5 hmot.% až do 10 hmot.%. Dusíkaté látky byly převážně organického původu s přídavkem minerálního dusíku. Jako organický dusíkatý zdroj lze použít hydrolyzát kaseinu, zahuštěný kukuřičný extrakt nebo syrovátku, respektive směs těchto dusíkatých látek. Obsah dusíku v médiu, je-li použit 1% zdroj uhlíku, by měl být 2 g/1, a je výhodou, je-li část tohoto dusíku organického původu. Půda se doplňuje minerálními solemi, jako jsou fosfáty, soli obsahující železo, mangan, vápník a hořčík. Množství těchto látek závisí na jejich množství v organických surovinách. Celkový obsah fosforu v půdě dostačuje v rozmezí od 0,01 do 0,1 g/1, železa od 0,001 do 0,01 g/1, manganu od 0,001 do 0,01 g/1, vápníku od 0,01 do 0,1 g/1 a hořčíku od 0,01 do 0,1 g/1. pH se upravuje před sterilizací média na hodnoty mezi 6,8 - 7,5, pH se dáíe nemusí upravovat, nebol v průtokové kultivaci je udržována téměř konstantní autoregulacl na hodnotách mezi 7,2 až 7,8. Teplota při fermentaci nemá klesnout pod 27 °C a nemá přesáhnout 32 °C. Kultivace probíhá za aerobních podmínek v případě fermentoru míchaného normalizovanou turbinou a přivádí se 1/2 až 1 objem vzduchu/min. Po rozkvaěení, které trvá asi 18 až 20 hodin, kdy se v médiu již neprodukuje enzym a pH stoupne k hodnotě 8,0 i vyšší, se zahájí průtok zřeňovací rychlostí D = 0,18 až 0,32 (h^_1). Během dalších 24 hodin se koncentrace enzymu stabilizuje a zůstává již po celou dobu další formentaco nezměněna. Je to umožněno tím, že v kontinuálním procesu zůstává hladina redukujících cukrů velmi nízká a je na úrovni koncentrace z konce jednorázové kultivace. Tim se neprojeví jejich katabolická represe, která jinak ve vsádkové (periodické) kultivaci brání tvorbě enzymu.

Průběh fermentaci za různé zřeňovací rychlosti a jednotlivé typy fermentaci na různých médiích jsou uvedeny v příkladech provedení. Hodnoty získané analýzou kontinuálních kultivací jsou uvedeny dále v přiložené tabulce a představují průměr z několika kontinuálních fermentaci, z nichž každá trvala průměrně 20 dnů.

Příklad 1.

Živná půda skládající se z 1,0 hmot. % škrobu, 2,0 hmot. % kukuřičného extraktu, 0,3 hmot. % (NH^gSO*, 0,03 hmot. % KHgPO^ a aikroelementů (0,015 g FeClg. 0,007 g MnClg.éHgO na litr), pH se před sterilizací upraví NaOH na hodnoty 6,8 až 7,5. Médium so po sterilizaci zchladí na teploty 27 - 32 °C a inokuluje ao 1 až 3 % tekuté kultury vyselektovaného vysokoprodukčního kmene Bacillus amyloliquefaciens CCM 3502, narostlé předem na syntetické

214 056 půdě. Kultivuje se v míchané· fermentoru za aerobních podmínek 18 až 20 hodin. Za tuto dobu se vytvoří v kultuře 50 až 60 j oc-amylázy/ml. Po zavedení průtoku o D = 0,2 (h^_1) ae během 20 až 24 hodin zvýší množství enzymu rf-amylšzy na 90 - lOOj/ml, Složení média kontinuálně vstupujícího do fermentoru je stejné jaké pro periodickou kultivaci, pH během kontinuální kultivace není třeba regulovat, setrvává na slabě alkalických hodnotách. Z vyfermentovaného média obsahujícího <<-amylšzu, které kontinuálně odchází z fermentoru, lze separací biomasy izolovat enzym <K-amylAzu známým izolaéním postupem.

Přiklad 2.

Syntetická živná půda, skládající se z 1,0 hmot.% škrobu, 0,56 hmot.% NH^NOg, 0,28 hmot.% Na₃oitrátu.2 HgO, 0,13 hmot.% KHgPO*, 0,05 hmot.% MgS0_4>7 HgO, 0,01 hmot.% KC1, 0,01 hmot.% CaClg.2 HgO, doplněných 0,2 % hydrolyzátu kaseinu a mikroelementy jako v příkladu 1. Před sterilizací so pH upraví na hodnoty 6,8 až 7,5. Médium so po sterilizaci zchladí na teploty 27 - 32 °C a inokuluje se 1 až 3 % tekuté kultury kmene Bacillus subtilis A 32. Za 18 až 20 hodin periodické kultivace se vytvoří v kultuře 27-30 j/ml. Po zavedeni průtoku D = 0,25 h^ se během 20 až 24 hodin zvýší množství enzymu na 40 až 50 j/ml. Další postup je stejný jako v přikladu 1. »

Příklad 3.

Živná půda skládajíc! ss z 50 obj.% syrovátky, 1,0 hmot.% škrobu, 1,0 hmot.% kukuřičného extraktu, 0,3 haot.% KHgPO^, mikroelementů jako v příkladu 1, so před sterilizaci upraví NaOH na pH 6,8 až 7,5. Další postup včetně inokulace vysokoprodukčním kmenem Bacillus subtilis A 32 js stejný jako v příkladu 2. Za 18 až 20 hodin se vytvoří v kultuře 40 - 50 j oť-amylázy/ml. Po zavedeni průtoku D = 0,2 h**^ se během 20 až 24 hodin zvýší množství enzymu (X-amyl&zy na 70 až 80 j/ml. Další postup je stejný jako v příkladu 1.

Tabulka představuje hodnoty získané kultivací vyselektovaného vysokoprodukčního kmene Bacillus amyloliquefaciens na médiu uvedeném v příkladu 1.

Tabulka

Typ kultivace	zředovaoí ryohlost	sušina	oú-amyláza	redukující cukry	pH
	D (h-1)	g/1	+j/ml	g/1
periodická	0	7.3	53,5	2.5	8,55
kontinuální	0,05	7,75	27,5	0,6	7,90
	0.1	9,5	45,0	1.4	7,'80
— w«.	0,2	8.4	97,0	2,2	7,50
w M ·	0,3	8,0	88,0	2,4	7,25
	0.4	7.5	21,0	4.0	7,10

+j = jednotky k určeni oC-amylázy byly tyto: 1 jednotka enzymu je rovna 1 mg maltózy, která se vytvoří během tříminutové reakce z roztoku 1% škrobu za standardních podmínek. P. Bernfeld: Amylases ot and/5. Methods in Enzymology; edited by S. P. Colewick and N.O. Kaplan, Aoademio Press New York 1955, Vol. 1,, 149-158.

Tabulka srovnává výsledky dosažené v periodické kultivaci s výsledky získanými kontinuální kultivací za různýoh zředovaoích rychlostí. Médium, které bylo použita v těchto fer214 056 mentaclch, je uvedeno v příkladu 1. Nízké hodnoty zředovací rychlosti nejsou vhodné, právě tak jako hodnoty nad 0,32. Za optimálních hodnot zředovací rychlosti jsou hodnoty produkce »<-anylázy na objemovou jednotku vyěěi nežli na konci periodické kultivace.

Z těchto výsledků vyplývá, že a pomocí vhodného kmene a za daných kultivačních podmínek lze úspěšně realizovat kontinuální proces produkce «έ-amylázy, kdy zůstává zachována vysoká koncentrace enzymu, obvykle převyšující hladinu dosahovanou v periodické kultivaci, přičemž objem média ve fermentoru se kontinuálním průtokem vymění za cca 3,5 až 5 hodin, tzn., že produktivita zařízení se zvyšuje minimálně 4 x, nebol ve srovnání s jednorázovou kultivací, kde vlastni fermentace trvá 18 až 24 hodin, se ušetří i čas nutný k vypouštěni fermentoru, jeho vyčištění, napouštění nového média, jeho sterilizace a zaočkování.

Claims (2)

1..Způsob kontinuální výroby eť-amylázy fermentací mikroorganismů, vyznačený tím, že produkční aktivita kontinuálně fermentováného mikroorganismu, který produkuje 0Č-amylázu, se udržuje regulací zředovael rychlosti v rozmézí mezi 0,18 až 0,32 h”\ hladina redukujících cukrů v médiu, přepočtená na maltózu, v průběhu kontinuálního procesu se udržuje maximálně na 3 g/1 a pH sé řídí auteregulací v rozmezí 7,2 až 7,8.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že jako mikroorganismus se použije kmen Bacillus . amyloliquefaciens CCM 3502.