CS210898B1

CS210898B1 - A method for the preparation of class-specific precipita antisera against immunoglobulins of the IgA and IgM cattle and pig classes

Info

Publication number: CS210898B1
Application number: CS770279A
Authority: CS
Inventors: Ladislav Rodak
Original assignee: Ladislav Rodak
Priority date: 1979-11-12
Filing date: 1979-11-12
Publication date: 1982-01-29

Abstract

Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům tříd Igfi a IgA skotu a prasat, použitelných ve veterinární medicíně a imunodiagnostice. Účelem vynálezu je stanovení účinného a poměrně jednoduchého způsobu přípravy antisér, která jsou nutná ve výzkumu i při rozvoji nových imunodiagnostických metod. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že se produkční.zvířata nejprve imunizuji intradermálná antigenem, homogenizátem precipitačnich linií imunoglobulinů zvolené třídy v kompletním Freundovš adjuvans a po vytvoření imunitní paměti se dvakrát intramuskulámě imunizují stejným antigenem o 5x vyěěí koncentraci v inkompletním adjuvans. Potom se 3x parenterálně imunizují dávkou 5 až 10 mg imunoglobulinu v solubilní formě. Produkční zvířata se vykrví 5. až 7. den po poslední dávce antigenu. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat. Vynálezu může být využito také pro komerční účely v podnicích zabývajících se výrobou biopreparátů a imunodiagnostik.Method for preparing class-specific antisera against immunoglobulins of the Igfi and IgA classes of cattle and pigs, usable in veterinary medicine and immunodiagnostics. The purpose of the invention is to determine an effective and relatively simple method for preparing antisera, which are necessary in research and in the development of new immunodiagnostic methods. The stated purpose is achieved by first immunizing production animals intradermally with antigen, homogenate of precipitation lines of immunoglobulins of the selected class in complete Freund's adjuvant and after the formation of immune memory, they are immunized intramuscularly twice with the same antigen at a 5x higher concentration in incomplete adjuvant. Then they are immunized parenterally 3x with a dose of 5 to 10 mg of immunoglobulin in soluble form. Production animals are bled on the 5th to 7th day after the last dose of antigen. The obtained antisera is saturated using an immunosorbent with bound immunoglobulin of a different class or light chains of immunoglobulin molecules of the same species of animals. The invention can also be used for commercial purposes in companies engaged in the production of biopreparations and immunodiagnostics.

Description

Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům tříd Igfi a IgA skotu a prasat, použitelných ve veterinární medicíně a imunodiagnostice.Method for the preparation of class specific antisera against immunoglobulins of the Igfi and IgA classes of cattle and pigs, useful in veterinary medicine and immunodiagnostics.

Účelem vynálezu je stanovení účinného a poměrně jednoduchého způsobu přípravy antisér, která jsou nutná ve výzkumu i při rozvoji nových imunodiagnostických metod. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že se produkční.zvířata nejprve imunizuji intradermálná antigenem, homogenizátem precipitačnich linií imunoglobulinů zvolené třídy v kompletním Freundovš adjuvans a po vytvoření imunitní paměti se dvakrát intramuskulámě imunizují stejným antigenem o 5x vyěěí koncentraci v inkompletním adjuvans. Potom se 3x parenterálně imunizují dávkou 5 až 10 mg imunoglobulinu v solubilní formě. Produkční zvířata se vykrví 5. až 7. den po poslední dávce antigenu. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.It is an object of the present invention to provide an efficient and relatively simple method of preparing antisera, which is necessary in the research and development of new immunodiagnostic methods. This is accomplished by first immunizing the production animals with an intradermal antigen, a homogenate of the immunoglobulin precipitate lines of the selected class in complete Freund's adjuvant, and once the immune memory has been generated, immunize twice intramuscularly with the same antigen 5 times in incomplete adjuvant. They are then immunized 3 times parenterally with a dose of 5 to 10 mg of immunoglobulin in soluble form. Producing animals are bled 5 to 7 days after the last antigen dose. The obtained antiserum is saturated with an immunosorbent coupled with immunoglobulin of different class or light chains of immunoglobulin molecules of the same species.

Vynálezu může být využito také pro komerční účely v podnicích zabývajících se výrobou biopreparátů a imunodiagnostik.The invention can also be used for commercial purposes in companies engaged in the production of biopreparations and immunodiagnostics.

2Í08982Í0898

Předmětem vynálezu je způsob přípravy vysoce avidních precipitačních antisér proti imunoglobulinům tříd lgA a IgM skotu a prasat.The present invention provides a process for the preparation of highly avid precipitation antisera against immunoglobulins of the IgA and IgM classes of cattle and pigs.

Při přípravě monospecifických antisér proti jednotlivým třídám imunoglobulinů je nutné zvířata imunizovat ideálně čistými proteiny, k jejichž izolaci je používána gelová filtrace, iontoměničová chromatografie, isoelektrické fokusace, ultracentrifugace, preparativní elektroforéze, imunoelektroforéza a řada jiných metod. Ani použiti těchto postupů však většinou nezaručuje absolutní čistotu izolovaných imunoglobulinů.In preparing monospecific antisera against individual classes of immunoglobulins, animals must be immunized with ideally pure proteins, which are isolated by gel filtration, ion exchange chromatography, isoelectric focusing, ultracentrifugation, preparative electrophoresis, immunoelectrophoresis, and a variety of other methods. However, even the use of these methods does not generally guarantee the absolute purity of the isolated immunoglobulins.

Stopy příměsí vyvolávají tvorbu protilátek s nežádoucí specifitou a vyrobená antiséra vytvářejí precipitační linie nejen s požadovaným, ale i s jinými třídami imunoglobulinů a dalšími vysoce antigenními proteiny, jako jsou např. lipoprotein, alfa-2-makroglobulin nebo transferrin. U řady zvířat používaných k produkci antisér, zejména u králíků, je třeba počítat i s tím, že vytvořené protilátky reagují nejen s třídově specifickými antigenními determinantami těžkých řetězců, ale i s determinantami lehkých řetězců, které jsou pro všechny třídy imunoglobulinů společné. Příprava třídově specifických a dostatečně avidních antisér je proto značně náročná po odborné i materiální stránce.Admixture traces produce antibodies with undesirable specificity and the produced antisera form precipitation lines not only with the desired but also with other classes of immunoglobulins and other highly antigenic proteins such as lipoprotein, alpha-2-macroglobulin or transferrin. In many animals used to produce antisera, especially in rabbits, it has to be expected that the antibodies produced not only react with class-specific antigenic determinants of the heavy chains, but also with the determinants of the light chains that are common to all classes of immunoglobulins. The preparation of class-specific and sufficiently avid antisera is therefore very demanding from a technical and material point of view.

Potřeba třídově specifických antisér ve veterinární medicíně stále vzrůstá s rozvojem nejrůznějších metod, které jsou používány nejen v imunologickém, bakteriologickém, virologickém, parazitologickém popř. i jiném výzkumu, ale i při praktické diagnostice nejrúznějších patofyziologických stgv.ú. Tím citelněji se projevuje nedostatek jednoduchého způsobu získávání třídově specifických antisér pro zmíněné účely.The need for class-specific antisera in veterinary medicine continues to grow with the development of a variety of methods that are used not only in immunological, bacteriological, virological, parasitological, or parasitological methods. in other research, but also in the practical diagnosis of various pathophysiological stgv.ú. The more noticeable is the lack of a simple method of obtaining class-specific antisera for the aforementioned purposes.

Obtíže spojené se získáváním třídově specifických a avidních antisér proti imunoglobulinovým třídám skotu a prasat, zahrnující přípravu ideálně čistých tříd imunoglobulinů jako antigenú k imunizaci zvířat a vlastní imunizaci zvířat, odstraňuje způsob imunizace zvířat podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zvolená zvířata podrobí imunizaci antigen-protilátkovým komplexem, např. precipitačními liniemi, vytvořenými reakcí imunoglobulinú tříd IgM a IgA s odpovídající specifickou protilátkou v agarovém gelu.The difficulty of obtaining class-specific and avid antisera against bovine and porcine immunoglobulin classes, including the preparation of ideally pure classes of immunoglobulins as antigens for animal immunization and self-immunization of animals, eliminates the method of immunization of animals according to the invention. immunization with an antigen-antibody complex, eg, by precipitation lines, generated by reacting immunoglobulins of the IgM and IgA classes with the corresponding specific antibody in an agar gel.

Produkční zvířata, s výhodou králíci, se nejdříve intradermálně imunizují emulzí připravenou smíšením 1 dílu homogenizátu precipitačních linií ve fyziologickém roztoku (2 až 4 přecipitační linie/ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans. Po vytvoření imunitní paměti se králíci 2x v odstupu 10 dnů imunizují emulzí připravenou smíšením 1 dílu homogenizátu precipitačních linií (10 až 20 linií/ral) a 2 dílů inkompletního adjuvans.Production animals, preferably rabbits, are first immunized intradermally with an emulsion prepared by mixing 1 part homogenate of the precipitate lines in saline (2-4 precipitation lines / ml) and 2 parts of complete Freund's adjuvant. After immune memory formation, rabbits were immunized 2 times 10 days apart with an emulsion prepared by mixing 1 part of the precipitate line homogenate (10 to 20 lines / ral) and 2 parts of the incomplete adjuvant.

Po dalších 10 dnech se králíci ve 3 následujících dnech imunizují parenterálně roztokem požadovaného imunoglobulinů v dávce 5 až 10 mg/imunizaci/králíka. Vykrvení následuje 5 až 7 den po poslední imunizaci. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.After a further 10 days, rabbits are immunized parenterally on 5 consecutive days with a solution of the desired immunoglobulin at a dose of 5 to 10 mg / immunization / rabbit. Bleeding follows 5 to 7 days after the last immunization. The obtained antiserum is saturated with an immunosorbent coupled with immunoglobulin of different class or light chains of immunoglobulin molecules of the same species.

Způsob imunizace zvířat podle vynálezu je vhodný zejména k přípravě třídově specifických antisér proti jednotlivým třídám imunoglobulinů, které dosud známým způsobem nelze jednoduše připravit.The method of immunization of animals according to the invention is particularly suitable for the preparation of class-specific antisera against individual classes of immunoglobulins which cannot be easily prepared in a manner known per se.

Hovězí a prasečí imunoglobuliny třídy IgM se izolují z krevních sér isoelektrickou preeipitaci v roztoku 0,05 M kyseliny borité a opakovanou gelovou filtrací na koloně Sephadexu G 200. Prasečí imunoglobuliny třídy IgA se izolují ze séra, hovězí imunoglobuliny třídy IgA z kolostra, slin aj.IgM class bovine and porcine immunoglobulins are isolated from blood sera by isoelectric precipitation in 0.05M boric acid solution and repeated gel filtration on a Sephadex G 200 column. Porcine IgA class immunoglobulins are isolated from serum, bovine IgA class colostrum, saliva, and the like.

Získané imunoglobuliny tříd IgM a IgA není ,možno použít k imunizaci zvířat přímo, protože stopy příměsí vyvolávají u imunizovaných zvířat tvorbu protilátek nežádoucí specifity. Proto při výrobě antisér proti těmto třídám imunoglobulinů jsou jako antigeny používány antigen-protilátkové komplexy, s výhodou precipitační linie, vytvořené reakcí imunoglobul-inů tříd l$t a IgA s odpovídající specifickou protilátkou v agarovém gelu (Nansen, P. 3j.i Acta path. microbiol. scand. Soot. B 1971, 79, 3 4-59). Teprve v poslední fázi imunizace ae smí použít roztoky těchto imunoglobulinů, kdy již nedochází k tvorbě nespecifických protilátek, avšak výrazně se zvySuje precipitační aktivita antisér. Tím odpadá nutnost použití mimořádně pracných a odborně, ěasově i materiálově náročných izolačních postupů při přípravě čistých imunoglobulinů jednotlivých tříd. Základní předpoklad výroby antisér, tj. přípravu vhodných antigenů, je tak možno vytvořit i v laboratořích, které nejsou vybaveny špičkovou technikou.The obtained immunoglobulins of the IgM and IgA classes cannot be used directly to immunize animals, since the traces of admixtures induce unwanted specificities in the immunized animals. Therefore, in the production of antisera against these classes of immunoglobulins, antigen-antibody complexes, preferably precipitating lines, formed by reacting immunoglobulins of the $ 1 and IgA classes with the corresponding specific antibody in an agar gel are used as antigens (Nansen, P. 3i Acta path. microbiol scand Soot B 1971, 79, 3-59). Only in the last phase of immunization ae solutions of these immunoglobulins may be used, where the non-specific antibodies are no longer generated, but the precipitation activity of the antisera is significantly increased. This eliminates the need for extraordinarily laborious and time-consuming and material-intensive isolation procedures for the preparation of pure immunoglobulins of each class. The basic prerequisite for the production of antisera, ie the preparation of suitable antigens, can also be created in laboratories that are not equipped with state-of-the-art technology.

Příklad provedení přípravy antisérExample of antisera preparation

Při přípravě antisér se používají purifikované prasečí a hovězí imunoglobuliny tříd IgA a IgM. Jejich další zpracováni a způsob imunizace se provádí jednotným způsobem podle, následujícího příkladu přípravy králičího třídově specifického antiséra proti prasečímu IgA imunoglobulinů.Purified pig and bovine IgA and IgM immunoglobulins are used in the preparation of antisera. Their further processing and immunization method are carried out in a uniform manner according to the following example of the preparation of rabbit class specific antisera against porcine IgA immunoglobulins.

Do startů o průměru 1 až 2 mm, vyrytých v 1,5 %-Noble agaru pro imunoelektroforézu, se nanese roztok prasečího IgA imunoglobulinů v koncentraci 10 až 20 mg/ml o čostotš 70 až 90 %. Po elektroforetickém rozdělení se do žlábků nanese králičí třídově specifická antisérum proti prasečímu IgA. Po 48 hodinách inkubace ve vlhké komoře při 20 °C se pomocí žiletky vyříznou části precipitačnich linií vytvořené v rozsahu start-katoda, důkladně 2 dny vyperou v pufrovaném fyziologickém roztoku a zhomogenizují. Homogenizáty precipitačnich linií (antigen-protilátkový komplex), dále antigennl suspenze, se používají různě koncentrované: pro 1. imunizaci 2 až 4 precipitační linie/ml, pro 2. až 3. imunizaci 10 až 20 precipitační ch linií/ml.Into startlets of 1 to 2 mm diameter, engraved in 1.5% -Noble agar for immunoelectrophoresis, a solution of porcine IgA immunoglobulins at a concentration of 10 to 20 mg / ml is applied, more or less 70 to 90%. After electrophoretic separation, rabbit class specific antiserum against porcine IgA is applied to the grooves. After 48 hours of incubation in a humidified chamber at 20 ° C, parts of the precipitate lines formed in the start-cathode range are excised using a razor blade, thoroughly washed in buffered saline for 2 days and homogenized. Precipitation line homogenates (antigen-antibody complex), hereinafter antigen suspensions, are used in various concentrations: for 1 immunization, 2 to 4 precipitation lines / ml, for 2 to 3 immunizations, 10 to 20 precipitation lines / ml.

Při 1. imunizaci se králík intradermélně imunizuje emulzí připravenou smíšením 1 dílu antigenní suspenze (2 až 4 homogenizované precipitační linie v 1 ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans (á 0,2 ml emulze i. d. na 6 míst na hřbetě). Za 1 měsíc následují v desetidenním intervalu 2. až 3. intramuskulárni injekce emulze připravené smíšením 1 dílu antigenní suspenze (10 až 20 homogenizovaných precipitačnich linií v 1 ml) a 2 dílů inkompletního adjuvans (á 0,5 ml emulze i. m. na 6 míst). 10.až' 12. den po 3. imunizaci následují ve 3 dnech 4. až 6. parenterální enjekce roztoku prasečího IgA (1 imunizační dávka cca 5 mg prasečího IgA ve 3 ml fyziologického roztoku). Tyto poslední injekce dále podstatně zvyšují precipitační aktivitu králičího antiséra.In the 1st immunization, the rabbit is immunized intradermelically with an emulsion prepared by mixing 1 part antigen suspension (2-4 homogenized precipitate lines per ml) and 2 parts complete Freund's adjuvant (α 0.2 ml emulsion i. D. At 6 sites on the back). After 1 month, 2 to 3 intramuscular injections of the emulsion prepared by mixing 1 part antigen suspension (10 to 20 homogenized precipitation lines in 1 ml) and 2 parts incomplete adjuvant (0,5 0.5 ml emulsion i.m. at 6 sites) are followed at 10-day intervals. On days 10 to 12, after the 3 rd immunization, parenteral enjections of the porcine IgA solution (3 immunization dose of about 5 mg porcine IgA in 3 ml saline) are followed on 3 to 4 days after parenteral immunization. These latter injections further substantially increase the precipitation activity of the rabbit antiserum.

Protože vykrvení následuje 5· až 7. den po poslední injekci, zvyšuje se zejména hladina specifických protilátek (sekundární typ imunitní odpovědi), zatímco primární imunitní odpověd na přítomné jiné antigeny je zanedbatelné. Proto je možno k těmto imunizacím použit jen částečně purifikovaný IgA imunoglabulin Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným prasečím IgG, popř. IgM imunoglobulinem nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul. Získané antisérum je třídově specifické, reagující pouze se specifickým, tj. těžkým řetězcem IgA molekuly.Since bleeding follows 5 to 7 days after the last injection, in particular, the level of specific antibodies (secondary type of immune response) increases, while the primary immune response to other antigens present is negligible. Therefore, only partially purified IgA immunoglabulin can be used for these immunizations. The antiserum obtained is saturated with porcine IgG-linked immunosorbent, resp. IgM immunoglobulin or immunoglobulin light chains. The obtained antiserum is class specific, reacting only with a specific, i.e. heavy chain, IgA molecule.

Podle stejného postupu a při dodržení stejných zásad-se provádí příprava třídově specifických antisér proti hovězím IgA nebo hovězím a prasečím l&L imunoglobulinům. Postupy vždy zahrnují přípravu precipitačnich linií požadovaného antigenů s protilátkou a homogenizaci precipitačnich linií. Pro 1. imunizaci se používá emulze 1 dílu homogenizátu precipitačnich linií(2 až 4 linie v 1 ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans. Pro 2. až 3· imunizaci se používá emulze 1 dílu homogenizátu precipitačnich linií (10 až 20 linii v 1 ml) a 2 dílů inkompletního adjuvans.Class-specific antisera against bovine IgA or bovine and porcine L & L immunoglobulins are prepared according to the same procedure and following the same principles. The procedures always involve preparing the precipitating lines of the desired antigen with the antibody and homogenizing the precipitating lines. For the first immunization, an emulsion of 1 part homogenate of the precipitation lines (2-4 lines per ml) and 2 parts of complete Freund's adjuvant is used. For 2 to 3 immunizations, an emulsion of 1 part homogenate of the precipitation lines (10 to 20 lines per ml) and 2 parts of the incomplete adjuvant is used.

Při postupu je třeba dodržet požadavek, aby koncentrace antigenů ( antigen-protilátkového komplexu precipitačnich linií) v roztocích použitých při přípravě emulzí pro 2. až 3· imunizaci byla vždy několikanásobně vyšší než při 1. imunizaci (koncentrace odpovídající 10 až 20, přípradně 2 až 4 precipitačnich linií v 1 ml). Následují 4. až 6) injekce roztoků antigenů (5 až 10 mg IgA nebo IgM imunoglobulínu v 1 imunizační dávce) a vykrvení králíků 5. až 7. den po poslední injekci. Získané antiséra se nakonec vysytí pomocí imunosorbentů s návaznými imunoglobuliny jiných tříd nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul.It is necessary to observe the requirement that the concentration of antigens (antigen-antibody complex of precipitation lines) in solutions used in the preparation of emulsions for 2 to 3 immunizations should always be several times higher than in the 1 st immunization (concentrations corresponding to 10 to 20 or 2 to 3). 4 precipitation lines per ml). This is followed by injections of antigen solutions (5-10 mg of IgA or IgM immunoglobulin per 1 immunization dose) followed by bleeding of rabbits 5 to 7 days after the last injection. The obtained antisera are finally saturated with immunosorbents with associated immunoglobulins of other classes or light chains of immunoglobulin molecules.

K vysycení antisér proti IgA používáme IgG a IgM imunoglobuliny atd.For saturation of antisera against IgA we use IgG and IgM immunoglobulins etc.

Předmět vynálezu řeší dílčím způsobem přípravu třídově specifických antisér proti imunoglobulinovým třídám IgM a IgA Skotu a prasat. Problém byl řešen komplexně a přípravu antisér proti třídám IgG skotu a prasat řeší čs. AO č. 210897.The subject of the invention solves in a partial way the preparation of class-specific antisera against the immunoglobulin classes of IgM and IgA of cattle and pigs. The problem was solved comprehensively and the preparation of antisera against classes of IgG cattle and pigs is solved by MS. AO No. 210897.

Požadované vlastnosti třídově specifických antisér proti prasečím a hovězím třídám imunoglobulinů získaných podle vynálezu se dokazují imunoprecipitačnfmi testy v agaru: dvo jitou radiální imunodifúzi (Ouchterlony) a imunoelektroforézou. Třídově specifická antiséra vytvářejí s prasečími a hovězími krevními séry nebo kolostry, popř. purifikovanými imunoglobuliny, pouze jedinou precipitační linii podle své specifieity.The desired properties of the class specific antisera against the porcine and bovine classes of immunoglobulins obtained according to the invention are demonstrated by immunoprecipitation assays in agar: double radial immunodiffusion (Ouchterlons) and immunoelectrophoresis. Class specific antisera form with pig and bovine blood sera or colostrums, respectively. purified immunoglobulins, only a single precipitation line according to its specificity.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Method for preparing class-specific, highly avid precipitation antisera against immunoglobulin classes of bovine and porcine IgM and IgA, comprising using antigen-antibody complexes, preferably precipitating line homogenates, prepared by reaction of class I $ 1a immunoglobulins as the antigen at the start of the immunization procedure. IgA with the corresponding specific antibody in an agar gel, characterized in that producing animals, preferably rabbits, are first immunized intradermelically with an emulsion of an antigen-antibody complex at a concentration of 2-4 precipitating lines / ml in complete Freund's adjuvant, after the immune memory has been generated. immunized twice intramuscularly with an emulsion of antigen-antibody complex at a concentration of 10 to 20 precipitation lines / ml in an incomplete adjuvant, then parenterally immunized three times with 5 to 10 mg of the desired class of immunoglobulin in a soluble form, then with The production animals are bled 5 to 7 days after the last dose of antigen and the resulting antiserum is saturated with immunosorbents with immunoglobulin-bound different classes or light chains of immunoglobulin molecules of the same species.