CS210898B1 - Způsob přípravy třídově specifických precipitaěních antisér proti imunoglobulinům tříd IgA a IgM skotu a prasat - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům tříd Igfi a IgA skotu a prasat, použitelných ve veterinární medicíně a imunodiagnostice. Účelem vynálezu je stanovení účinného a poměrně jednoduchého způsobu přípravy antisér, která jsou nutná ve výzkumu i při rozvoji nových imunodiagnostických metod. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že se produkční.zvířata nejprve imunizuji intradermálná antigenem, homogenizátem precipitačnich linií imunoglobulinů zvolené třídy v kompletním Freundovš adjuvans a po vytvoření imunitní paměti se dvakrát intramuskulámě imunizují stejným antigenem o 5x vyěěí koncentraci v inkompletním adjuvans. Potom se 3x parenterálně imunizují dávkou 5 až 10 mg imunoglobulinu v solubilní formě. Produkční zvířata se vykrví 5. až 7. den po poslední dávce antigenu. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat. Vynálezu může být využito také pro komerční účely v podnicích zabývajících se výrobou biopreparátů a imunodiagnostik.

Description

Způsob přípravy třídově specifických antisér proti imunoglobulinům tříd Igfi a IgA skotu a prasat, použitelných ve veterinární medicíně a imunodiagnostice.

Účelem vynálezu je stanovení účinného a poměrně jednoduchého způsobu přípravy antisér, která jsou nutná ve výzkumu i při rozvoji nových imunodiagnostických metod. Uvedeného účelu se dosáhne tím, že se produkční.zvířata nejprve imunizuji intradermálná antigenem, homogenizátem precipitačnich linií imunoglobulinů zvolené třídy v kompletním Freundovš adjuvans a po vytvoření imunitní paměti se dvakrát intramuskulámě imunizují stejným antigenem o 5x vyěěí koncentraci v inkompletním adjuvans. Potom se 3x parenterálně imunizují dávkou 5 až 10 mg imunoglobulinu v solubilní formě. Produkční zvířata se vykrví 5. až 7. den po poslední dávce antigenu. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.

Vynálezu může být využito také pro komerční účely v podnicích zabývajících se výrobou biopreparátů a imunodiagnostik.

2Í0898

Předmětem vynálezu je způsob přípravy vysoce avidních precipitačních antisér proti imunoglobulinům tříd lgA a IgM skotu a prasat.

Při přípravě monospecifických antisér proti jednotlivým třídám imunoglobulinů je nutné zvířata imunizovat ideálně čistými proteiny, k jejichž izolaci je používána gelová filtrace, iontoměničová chromatografie, isoelektrické fokusace, ultracentrifugace, preparativní elektroforéze, imunoelektroforéza a řada jiných metod. Ani použiti těchto postupů však většinou nezaručuje absolutní čistotu izolovaných imunoglobulinů.

Stopy příměsí vyvolávají tvorbu protilátek s nežádoucí specifitou a vyrobená antiséra vytvářejí precipitační linie nejen s požadovaným, ale i s jinými třídami imunoglobulinů a dalšími vysoce antigenními proteiny, jako jsou např. lipoprotein, alfa-2-makroglobulin nebo transferrin. U řady zvířat používaných k produkci antisér, zejména u králíků, je třeba počítat i s tím, že vytvořené protilátky reagují nejen s třídově specifickými antigenními determinantami těžkých řetězců, ale i s determinantami lehkých řetězců, které jsou pro všechny třídy imunoglobulinů společné. Příprava třídově specifických a dostatečně avidních antisér je proto značně náročná po odborné i materiální stránce.

Potřeba třídově specifických antisér ve veterinární medicíně stále vzrůstá s rozvojem nejrůznějších metod, které jsou používány nejen v imunologickém, bakteriologickém, virologickém, parazitologickém popř. i jiném výzkumu, ale i při praktické diagnostice nejrúznějších patofyziologických stgv.ú. Tím citelněji se projevuje nedostatek jednoduchého způsobu získávání třídově specifických antisér pro zmíněné účely.

Obtíže spojené se získáváním třídově specifických a avidních antisér proti imunoglobulinovým třídám skotu a prasat, zahrnující přípravu ideálně čistých tříd imunoglobulinů jako antigenú k imunizaci zvířat a vlastní imunizaci zvířat, odstraňuje způsob imunizace zvířat podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se zvolená zvířata podrobí imunizaci antigen-protilátkovým komplexem, např. precipitačními liniemi, vytvořenými reakcí imunoglobulinú tříd IgM a IgA s odpovídající specifickou protilátkou v agarovém gelu.

Produkční zvířata, s výhodou králíci, se nejdříve intradermálně imunizují emulzí připravenou smíšením 1 dílu homogenizátu precipitačních linií ve fyziologickém roztoku (2 až 4 přecipitační linie/ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans. Po vytvoření imunitní paměti se králíci 2x v odstupu 10 dnů imunizují emulzí připravenou smíšením 1 dílu homogenizátu precipitačních linií (10 až 20 linií/ral) a 2 dílů inkompletního adjuvans.

Po dalších 10 dnech se králíci ve 3 následujících dnech imunizují parenterálně roztokem požadovaného imunoglobulinů v dávce 5 až 10 mg/imunizaci/králíka. Vykrvení následuje 5 až 7 den po poslední imunizaci. Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.

Způsob imunizace zvířat podle vynálezu je vhodný zejména k přípravě třídově specifických antisér proti jednotlivým třídám imunoglobulinů, které dosud známým způsobem nelze jednoduše připravit.

Hovězí a prasečí imunoglobuliny třídy IgM se izolují z krevních sér isoelektrickou preeipitaci v roztoku 0,05 M kyseliny borité a opakovanou gelovou filtrací na koloně Sephadexu G 200. Prasečí imunoglobuliny třídy IgA se izolují ze séra, hovězí imunoglobuliny třídy IgA z kolostra, slin aj.

Získané imunoglobuliny tříd IgM a IgA není ,možno použít k imunizaci zvířat přímo, protože stopy příměsí vyvolávají u imunizovaných zvířat tvorbu protilátek nežádoucí specifity. Proto při výrobě antisér proti těmto třídám imunoglobulinů jsou jako antigeny používány antigen-protilátkové komplexy, s výhodou precipitační linie, vytvořené reakcí imunoglobul-inů tříd l$t a IgA s odpovídající specifickou protilátkou v agarovém gelu (Nansen, P. 3j.i Acta path. microbiol. scand. Soot. B 1971, 79, 3 4-59). Teprve v poslední fázi imunizace ae smí použít roztoky těchto imunoglobulinů, kdy již nedochází k tvorbě nespecifických protilátek, avšak výrazně se zvySuje precipitační aktivita antisér. Tím odpadá nutnost použití mimořádně pracných a odborně, ěasově i materiálově náročných izolačních postupů při přípravě čistých imunoglobulinů jednotlivých tříd. Základní předpoklad výroby antisér, tj. přípravu vhodných antigenů, je tak možno vytvořit i v laboratořích, které nejsou vybaveny špičkovou technikou.

Příklad provedení přípravy antisér

Při přípravě antisér se používají purifikované prasečí a hovězí imunoglobuliny tříd IgA a IgM. Jejich další zpracováni a způsob imunizace se provádí jednotným způsobem podle, následujícího příkladu přípravy králičího třídově specifického antiséra proti prasečímu IgA imunoglobulinů.

Do startů o průměru 1 až 2 mm, vyrytých v 1,5 %-Noble agaru pro imunoelektroforézu, se nanese roztok prasečího IgA imunoglobulinů v koncentraci 10 až 20 mg/ml o čostotš 70 až 90 %. Po elektroforetickém rozdělení se do žlábků nanese králičí třídově specifická antisérum proti prasečímu IgA. Po 48 hodinách inkubace ve vlhké komoře při 20 °C se pomocí žiletky vyříznou části precipitačnich linií vytvořené v rozsahu start-katoda, důkladně 2 dny vyperou v pufrovaném fyziologickém roztoku a zhomogenizují. Homogenizáty precipitačnich linií (antigen-protilátkový komplex), dále antigennl suspenze, se používají různě koncentrované: pro 1. imunizaci 2 až 4 precipitační linie/ml, pro 2. až 3. imunizaci 10 až 20 precipitační ch linií/ml.

Při 1. imunizaci se králík intradermélně imunizuje emulzí připravenou smíšením 1 dílu antigenní suspenze (2 až 4 homogenizované precipitační linie v 1 ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans (á 0,2 ml emulze i. d. na 6 míst na hřbetě). Za 1 měsíc následují v desetidenním intervalu 2. až 3. intramuskulárni injekce emulze připravené smíšením 1 dílu antigenní suspenze (10 až 20 homogenizovaných precipitačnich linií v 1 ml) a 2 dílů inkompletního adjuvans (á 0,5 ml emulze i. m. na 6 míst). 10.až' 12. den po 3. imunizaci následují ve 3 dnech 4. až 6. parenterální enjekce roztoku prasečího IgA (1 imunizační dávka cca 5 mg prasečího IgA ve 3 ml fyziologického roztoku). Tyto poslední injekce dále podstatně zvyšují precipitační aktivitu králičího antiséra.

Protože vykrvení následuje 5· až 7. den po poslední injekci, zvyšuje se zejména hladina specifických protilátek (sekundární typ imunitní odpovědi), zatímco primární imunitní odpověd na přítomné jiné antigeny je zanedbatelné. Proto je možno k těmto imunizacím použit jen částečně purifikovaný IgA imunoglabulin Získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentu s navázaným prasečím IgG, popř. IgM imunoglobulinem nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul. Získané antisérum je třídově specifické, reagující pouze se specifickým, tj. těžkým řetězcem IgA molekuly.

Podle stejného postupu a při dodržení stejných zásad-se provádí příprava třídově specifických antisér proti hovězím IgA nebo hovězím a prasečím l&L imunoglobulinům. Postupy vždy zahrnují přípravu precipitačnich linií požadovaného antigenů s protilátkou a homogenizaci precipitačnich linií. Pro 1. imunizaci se používá emulze 1 dílu homogenizátu precipitačnich linií(2 až 4 linie v 1 ml) a 2 dílů kompletního Freundova adjuvans. Pro 2. až 3· imunizaci se používá emulze 1 dílu homogenizátu precipitačnich linií (10 až 20 linii v 1 ml) a 2 dílů inkompletního adjuvans.

Při postupu je třeba dodržet požadavek, aby koncentrace antigenů ( antigen-protilátkového komplexu precipitačnich linií) v roztocích použitých při přípravě emulzí pro 2. až 3· imunizaci byla vždy několikanásobně vyšší než při 1. imunizaci (koncentrace odpovídající 10 až 20, přípradně 2 až 4 precipitačnich linií v 1 ml). Následují 4. až 6) injekce roztoků antigenů (5 až 10 mg IgA nebo IgM imunoglobulínu v 1 imunizační dávce) a vykrvení králíků 5. až 7. den po poslední injekci. Získané antiséra se nakonec vysytí pomocí imunosorbentů s návaznými imunoglobuliny jiných tříd nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul.

K vysycení antisér proti IgA používáme IgG a IgM imunoglobuliny atd.

Předmět vynálezu řeší dílčím způsobem přípravu třídově specifických antisér proti imunoglobulinovým třídám IgM a IgA Skotu a prasat. Problém byl řešen komplexně a přípravu antisér proti třídám IgG skotu a prasat řeší čs. AO č. 210897.

Požadované vlastnosti třídově specifických antisér proti prasečím a hovězím třídám imunoglobulinů získaných podle vynálezu se dokazují imunoprecipitačnfmi testy v agaru: dvo jitou radiální imunodifúzi (Ouchterlony) a imunoelektroforézou. Třídově specifická antiséra vytvářejí s prasečími a hovězími krevními séry nebo kolostry, popř. purifikovanými imunoglobuliny, pouze jedinou precipitační linii podle své specifieity.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob přípravy třídově specifických, vysoce avidních precipitačních antisér proti imunoglobulinovým třídám IgM a IgA skotu a prasat, spočívající v tom, že na počátku imunizačního postupu se jako antigen použijí antigen-protilétkové komplexy, s výhodou homogenizáty precipitačních linií, připravené reakci imunoglobulinů tříd I$l a IgA s odpovídající specifickou protilátkou v agarovém gelu, vyznačující se tím, že se produkční zvířata, s vý hodou králíci, nejdříve intradermélně imunizují emulzi antigen-protilátkového komplexu o koncentraci 2 až 4 precipitační linie/ml v kompletním Freundově adjuvans, po vytvoření imunitní paměti se dvakrát intramuskulárně imunizuji emulzí antigen-protilátkového komplexu o koncentraci 10 až 20 precipitačních linií/ml v inkompletním adjuvans, potom se třikrát parenterálně imunizují vždy dávkou 5 až 10 mg imunoglobulínu požadované třídy v solubilní formě, potom se produkční zvířata vykrví 5. až 7. den po poslední dávce antigenu a získané antisérum se vysytí pomocí imunosorbentů s navázaným imunoglobulinem odlišné třídy nebo lehkými řetězci imunoglobulinových molekul stejného druhu zvířat.