CS210520B1

CS210520B1 - Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3443 s racemázovou aktivitou O,L-alfa- -amino-epsilon-kaprolaktamu pro výrobu L-lysinu

Info

Publication number: CS210520B1
Application number: CS279180A
Authority: CS
Inventors: Kamila Plhackova; Vladimir Vojtisek; Karel Culik; Miloslav Kocur; Jiri Plachy
Original assignee: Kamila Plhackova; Vladimir Vojtisek; Karel Culik; Miloslav Kocur; Jiri Plachy
Priority date: 1980-04-21
Filing date: 1980-04-21
Publication date: 1982-01-29

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 443 a jeho využití pro enzy movou výrobu L-lysinu racemizaoí D-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu.

Proces přípravy L-lysinu z D,L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu (dále jen D,L-AKL) byl vyvinut na základě izolace a využití kvasinek z rodů Candida, Cryptococcus a Trichosporon, hydrolyzujících L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktam (dále jen L-AKL) na L-lysin, a baktérií z rodů Achromobacter, Alcaligenes a Elavobacterium, racemizujících D-alfa-amino-epsilon-kaprolaktam (dále jen D-AKL) na jeho L-izomer, který je enzymově hydrolyzovatelný za vzniku L-lysinu, což je dokumentováno v japonských patentových spisech č. 7 415 795, 7 425 190, 7 462 589, 7 328 679, britských patentových spisech č. 1 334 970 a 1 352 860, v SRN. patentovém spise č. 2 157 171 a franc. patentovém spise č. 2 114 862.

Kmeny použité pro proces racemizace byly taxonomicky identifikovány jako Achromobacter cycloclastes FERM-P 772, FERM-P 780 a IAM 1 013, Achromobacter obae sp. FERM-P 776, Flavobacterium arborescens FERM-P 177 a Alcaligenes faecalis FERM-P 778; citované rody a kmeny jsou předmětem patentové ochrany v uvedených patentových spisech.

Předmětný vynález’ se týká nového kmene, který byl izolován z přírody (z ornice) a systematicky (taxonomicky) nepatři mezi uvedené rody mikroorganismů, které jsou předmětem patentové ochrany v uvedených patentových spisech; navíc tento nový izolát, identifikovaný jako Pseudomonas sp. a podrobený mutagenezi, vykazuje podstatně výhodnější vlastnosti při využití pro enzymovou přípravu L-lysinu z D,L-AKL, spočívající zejména ve zvýšené produkci buněčné hmoty a vyšší rychlosti a úplnosti konverze.

Kmen byl získán na základě rozsáhlého screeningu z přírody izolovaných mikrobiálních

2,0520 kmenů schopných růstu na D,L-AKL jako jediném zdroji uhlíku a dusíku o podroben selekci v médiu obsahující L-lysin, který sloužil jako hlavní zdroj uhlíku a dusíku. Získaný kmen byl dále podroben mutagenezi a izolát s nejrychlejším růstem v médiu obsahujícím L-lysin, vykazoval nejvyšší aktivitu D,L-AKL-racemázy a intenzívní růst se zvýšenou produkcí buněčné hmoty v médiích obsahujících D,L-AKL jako ihduktor syntézy racemázy.'

V následujícím schématu jsou uvedeny charakteristiky mutantního kmene Pseudomonas sp. CCM 3 443.

A. Morfologie:

1. Velikost (yum), tvar buněk:

2. Pohyblivost:

3. Gram - barvení:

B. Pozorování kultur:

1. Kolonie na masopeptonovém agaru:

a) tvar:

b) kvalita:

c) barva:

2. Šikmá kultura na masopeptonovém agaru:

a) růst:

b) kvalita:

c) barva:

3. Masopepton-agar vpich:

4. Želatina - vpicn:

5. Tekutý bujón:

O. Tekutý bujón s 3,1# KNO j:

7. Brambory:

C. Růstové podmínky:

tyčinky, 0,6-0,9krát, 1,0-1,6 jednotlivé, často v párech, event. ve shlucích pohyblivé, polární bičíky negativní celistvé, kulatě vypouklé, hladké mukózní, s lesklým povrchem bez pigmentu, neprůhledné, šedobílé střední plný, hladký, značně mukózní bělavě šedá, neprůhledná, lesknoucí povrchový růst povrchový růst bez ztekucení povrchový růst v blance, bez zákalu a sedimentu silná turbidita, později, sediment vlnky růst bez tmavnutí dobrý růst při jO °C, žádný růst při 37 °C, dobrý růst při pH 6,5-7,2 obligátně aerobní vyjma v přítomnosti nitrátů

D. Fyziologické charakteristiky:

,. Tvorba indolu:

2. Tvorba H₂S;

3. Acetylmetylkarbinol:

4. Redukce nitrátů:

5. Denitrifikace:

6. Kataláza:

7. Ureáza:

8. Oxidáza:

9. Argininhydroláza:

10. Želatina:

negativní negativní neprodukován pozitivní silně pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní negativní neztekucována

11.	Škrob:	nehydrolyzován
12.	Ox-Ferm-test:	žádné změny a žádný růst za anaerobních podmínek
13.	Utilízace C-zdrojů:	glycerol a acetát utilizován etanol, propiohát, citrát neutilizovéň
14.	Fermentace cukrů:	glukóza, sacharóza, laktóza, rafinoza, mannit bez kyselin a plynů
15.	Citlivost na antibiotika:	penicilín a streptomycin resistentní, tetracyklin senzitivní
’ '’·	Utilízace D a L-aminoknrrrl^ktamu:	utilizován jako jediný zdroj uhlíku a dusíku
Zd:	i ¹:	izolován z ornice

Fonsaný kmen produkuje Párem*?.·;, Ό,L-AKL, prokázanou úbytkem optické otáčivosti roztoku L-Aki., n ve směsi s producentem L-AKL hydrolázy umožňuje 100% konverze D,L-AKL na L-lysin.

Vynález je tedy vyznačen mutantním kmenem mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 443, využitelným pro enzymovou výrobu L-lysinu a syntetizujícím specifickou racemázu D,L-alfa-amino-eosilon-kaprolaktamu.

Aktivita D,L-AKL-racemázy byla zjištována změnou optické otáčivosti 5% (hmota/objem) vodného roztoku L-AKL-HCL upraveného zředěným roztokem KOH na hodnotu pH 8,0 po třicetiminutové inkubaci buněčné suspenze Pseudomonas sp. při 37 °C. Aktivita L-AKL hydrolázy byla zjištována z přírůstků koncentrací L-lysinu po desetiminutové inkubací buněčné suspenze Cryptococcus sp. VÚAB 440 v 2,5% (hmota/objem) vodném roztoku L-AKL-HCL, jehož pH bylo upraveno zředěným roztokem KOH na hodnotu pH 7,5 při 37 °C. Účinnost enzymové konverze různě koncentrovaných vodných roztoků D,L-AKL, které obsahovaly nativní buňky nebo acetonem ošetřené buňky obou zmíněných producentů byla měřena chromatografií na tenké vrstvě s densitometrickým vyhodnocením přírůstků koncentrací L-lysinu a úbytku D,L-AKL a manometricky pomoci surověno enzymového preparátu L-lysin-dekarboxylázy připraveného z Mycobacter i um s p.

Enzymové a ualěi výhodná vlastnosti předmětného kmene a postup výroby L-lysinu pomocí tohoto kmene ve směsi producentem hydrolázy je dále dokumentován v příkladech provedení, aniž se jimi omezuje.

Příkladi

Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. byl získán z přírody izolací z filtrátu ornice suspendované ve fyziologickém roztoku, jímž byla očkována živná půda obsahující 0,5 % L-AKL,

0,2 % KH₂PC₄, 0,003 % PeS(J₄ . 7 H₂0, 0,02 % MnCl₂ . 2 H₂O, 0,05 % MgSC₄ . 7 H₂0, 0,05 % kvasničného extraktu. Narostlá suspenze byla po neředění vyseta na pevnou živnou půdu stejného složení, kde kvasničný extrakt byl nahrazen 0,5 % L-AKL a směsí vitamínů. Homogenní kultura kmene byla vyseta na živnou půdu stejného složení, avšak namísto 0,5 % L-AKL obsahovala tato půda stejnou koncentraci D-AKL. Z této živné půdy byla monokoloniová kultura podrobena mutagennímu zásahu (10 ml vodné suspenze buněk v ředění 10^ až 10® na Petriho misce o průměru 8 cm podrobeno záření UV germicidní lampy 42 W ve vzdálenosti 20 cm, 20 sekund; suspenze po mutagenezi byla vyseta na pevnou živnou půdu stejného složení, která však namísto D- nebo L-AKL obsahovala 0,5 % L-lysinu. Z uvedené živné půdy byla vyočkována největší kolonie, z které byla připravena homogenní kultura, pasóžovaná na masopeptonových živných agarech, a dále potom konzervována lyofilizací.

β

Vyočkovaná konzerva popsaným způsobem získaného kmene Pseudomonas sp. byla kultivována v 10 litrech tekuté živné půdy obsahující 1 % sacharózy, 0,5 % D,L-AKL, 0,05 % kvasničného extraktu, 0,05 % kukuřičného extraktu, 0,79 % K₂HP0₄, 0,36 % KH₂P0₄, 0,002 % lfnCl₂ . 5 H₂O, 0,05 % MgSO₄ . 7 H₂O a filtrát 1% suspenze arašídové mouky; pH média bylo 7,2, kultivace probíhala ve dvacetilitrovám fermentačním tanku z nerezová oceli submersní kultivací za míchání 350 ot./min a vzdušnění 0,4 obj. vzduchu/min 20 hodin při teplotě 29 °C. Za popsaných podmínek bylo získáno 350 g vlhká buněčná pasty uvedeného produkčního kmene.

K důkazu stereospecifické racemizace AKL byl použit vždy jeden z optických antipodů, a to zprvu L-AKL . HC1 následujícím způsobem: 5 g vlhké hmoty popsaným způsobem získaných a vyrostlých nativních buněk Pseudomonas sp. bylo suspendováno v 50 ml vody, 5 g L-AKL .

. HC1 bylo rozpuštěno v cca 25 ml vody, pH v suspenzi buněk a roztoku L-AKL . HC1 bylo upraveno zředěným roztokem KOH za míchání na hodnotu 8,0 a poté obě části vytemperovány na teplotu 37 °C. Po vytemperování suspenze a roztoku L-AKL byly obě složky slity a ihned doplněny vodou na celkový objem 100 ml. Směs byla nepřetržitě míchána při teplotě 37 °C 5 hodin. Po táto době byly buňky odstředěny a měřena optická otáčivost supernatantu na spektropolarimetru. Optická otáčivost výchozího roztoku klesla na hodnotu odpovídající 100% racemizaci L-AKL na D,L-AKL. Tento proces byl opakován i s druhým optickým antipodem, tj. D-AKL . HC1, za stejných podmínek a se stejným výsledkem.

Příklad 2

Pro důkaz kompletní konverze D,L-AKL na L-lysin byla připravena směs producentů obou enzymů, AKL-racemázy a AKL-hydrolázy.

Buňky Pseudomonas sp. s racemázóvou aktivitou byly připraveny stejným způsobem, jak uvedeno v příkladu 1. Buňky Cryptocoscus sp. VÚAB 440 s L-AKL hydrolázovou aktivitou byly připraveny následujícím způsobem: Kmen Cryptococcus sp. byl kultivován v 10 1 tekuté živné půdy obsahující 0,5 % sacharózy, 2,0 % D,L-AKL, 0,5 % kvasničného extraktu, 0,95 % K₂HP0₄, 0,2 % KH₂PO₄, 0,02 % MnCl_z . 5 H₂0, 0,05 % UgSO₄ . 7 H₂0; pH média bylo 7,5, kultivace probíhala ve dvacetilitrovám fermentačním tanku z nerezové oceli submerznl kultivací za míchání 350 ot./min a vzdušnění 0,3 obj. vzduchu/min při teplotě 29 °C. Za popsaných podmínek bylo získáno 500 g vlhké buněčné pasty producenta L-AKL-hydrolázy.

Úplná konverze D,L-AKL na L-lysin byla provedena následujícím způsobem. Reakční směs obsahovala 250 g vlhké hmoty (50 mg/ml) Pseudomonas sp. a 125 g vlhké hmoty buněk (25 mg/ml) Cryptococcus sp. VÚAB 440 a 500 g D,L-AKL-HC1 (608 mmol) v celkovém, vodou doplněném objemu 5 litrů a pH reakční směsi upravené zředěným KOH na hodnotu 8,0. Reakční směs byla míchána při teplotě 40 °C nepřetržitě 10 hodin. Po této době bylo v reakční směsi zjištěno 124 mg L-lysinu-HCl/ml, tj. 608 mmol L-lysinu, což odpovídá výtěžku 620 g L-lysinu monochloridu, tj. 100% konverzi D,L-aminokaprolaktamu na L-lysin.

Příklad 3 g nativních buněk (vlhké buněčná pasty) Pseudomonas sp., získaných, jak je uvedeno v příkladu 1, bylo ošetřeno za chladu acetonem a bylo získáno 3,87 g suché hmoty tohoto producenta.

g vlhké pasty Cryptococcus sp. VÚAB 440, získaných, jak je uvedeno v příkladu 2, bylo ošetřeno za chladu acetonem a bylo získáno 3,11 g suché hmoty tohoto producenta.

S acetonem ošetřenými buňkami producentů obou enzymů byla provedena kompletní konverze D,L-AKL na L-lysin takto: I

Reakční směs obsahovala 1,5 g (15 mg/ml acetonové sušiny) Pseudomonas sp., 0,4 g (4 mg/ml acetonové sušiny) Cryptococcus sp. VÚAB 440, ,0 g D,L-AKL-HC1 (608 mmol) a vodu v celkovém objemu 100 mlj pH reakční směsi bylo upraveno zředěným roztokem KOH na hodnotu 8,0. Reakční směs byla nepřetržitě míchána po dobu 9 hodin pří teplotě 40 °C. Po této době byl z reakční směsi získán roztok obsahující 124 mg L-lysinu . HCl/ml (608 mmol), což odpovídá 100% konverzi D,L-aminokaprolaktamu na L-lysin.

Příklad 4

Nativní buňky Pseudomonas sp., které vyrostly za podmínek, jak uvedeno v příkladu 1 a nativní buňky Cryptococcus sp. VÚAB 440, které vyrostly, jak je uvedeno v příkladu 2, byly suspendovány v demineralizované vodě v poměru 75 mg/ml vlhké hmoty producenta racemázy a 25 mg/ml vlhké hmoty producenta hydrolázy do 20% roztoku D,L-AKL . HC1 (20 g/100 ml, tj. 1 216 mmol); pH reakční směsi bylo upraveno zředěným roztokem KOH na hodnotu 8,0 a směs byla nepřetržitě míchána po dobu 28 hodin při 40 °C. Z reakční směsi byl získán roztok obsahující 220 mg L-lysinu . HCl/ml (1 205 mmol), což odpovídá 99,2 % konverzi 20% roztoku D,L-aminokaprolaktamu na L-lysin.

Claims

Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3 443 s racemázovou aktivitou D,L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu pro výrobu L-lysinu.