CS208076B1 - Method of fermentation production - Google Patents

Description

ČeskoslovenskáSOCIALISTICKÁREPUBLIKA(1S) POPIS VYNALEZU K AUTORSKÉMU OSVĚDČENÍ 208076 (11) (Bl) (51) Int. Cl.3 C 12 P 13/08 (22) Přihlášeno 18 12 79(21) (PV 8963-79) ÚŘAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY (40) Zveřejněno 28 11 80 (45) Vydáno 01 12 82 (75)

Autor vynálezu PILÁT PETR ing. CSc., ČULÍK KAREL RNDr. a

PALEČKOVÁ FRANTIŠKA RNDr., PRAHA (54) Způsob fermentační výroby L-Iysinu

Vynález se týká způsobu fermentační přípravyL-Iysinu kultivací produkčních organismů, zejmé-na rodů Corynebacterium nebo Brevibacterium,v tekutých živných půdách, obsahujících zdrojeasimilovatelného uhlíku a dusíku a minerální živnésoli, za submersních podmínek. Nejčastějšímzdrojem asimilovatelného uhlíku jsou sacharózanebo sacharidické zdroje (melasa, hydrolyzátypolysacharidů atd.), obvyklými zdroji dusíku jsouzejména amonné soli, kukuřičný výluh, hydrolyzá-ty mouky apod.

Kontinuální kultivace mikroorganismů jako me-todologický přístup řešení produkce mikrobiálníbuněčné hmoty nebo produktů metabolismu mářadu značných výhod ve srovnání s jednorázovýmtypem submersního postupu. Pomocí kontinuální-ho fermentačního postupu je možno dosáhnoutznačně příznivějších parametrů produkčního pro-cesu (např. produktivita systému), které majípřímý ekonomický efekt. Snaha o použití kontinu-álního procesu při biosyntéze L-lysinu proniklataké do patentové literatury.

Autoři sovětských patentů č. 255 161 (1973)a 258 845 (1973) popsali vícestupňové kontinuálnísystémy (3-stupňový a blíže nespecifikovaný více-stupňový). Prvý stupeň je využíván jako inokulač-ní, vlastní produkční proces probíhá v několikadalších propojených fermentorech (do prvého 208076 ž nich je předpokládán další přídavek substrátu).Patenty neobsahují příklady použití. Vícestupňové kontinuální biosyntézy L-lysinuna bázi sacharidických zdrojů uhlíku, kyselinymáselné a octové se týká také československýpatent č. 170 437 (1977). Sovětští autoři (Viesturea spol.) popsali 4-stupňový kontinuální systémfermentorů uspořádaných do série, kde prvý fer-mentor je uvažován jako kontinuální inokulačnístupeň. Pomocí řízeného přídavku zdrojů uhlíkua dusíku a tím současně zdrojů potřebných amino-kyselin a stimulátorů biosyntézy L-lysinu (melasa,kukuřičný výluh) do 2. a 3. stupně systémuregulujíautoři proces tvorby buněčné hmoty a produktutak, aby kultura byla v průběhu celé kultivaceudržena v aktivním stavu a v důsledku toho sezvýšily výtěžky L-lysinu. Zředbvací rychlostD v jednotlivých stupních se pohybuje v rozmezí0,12-0,14 h-1. Podle použitých substrátů bylov celém systému dosaženo produktivity 0,87 (me-lasa) a 1,15 g L-lysinu/1 h (kukuřičný extrakta sacharóza).

Zmíněné značně složité kontinuální systémyvyhovují lépe potřebám a charakteru produkčníhoprocesu, ale z hlediska úspěšné výrobní realizacepatentovaného postupu je jejich využitelnost ne-perspektivní. Ze zkušenosti je známo, že jedenz hlavních problémů, spojených s aplikací kontinu- 208 078 álních postupů je dlouhodobé udržení sterilitytěchto průtočných systémů. Nebezpečí kontamina-ce produkčního procesu se vzrůstající složitostífermentačního systému i celé aparatury se prudcezvyšuje. V tomto případě se jedná o rychléznehodnocení obsahu celé řady fermentačníchtanků ve srovnání s jednorázovým procesem,včetně značné časové ztráty. Zvýšení pořizovacíchi provozních nákladů je také významné. Předmětem vynálezu je kontinuální fermentačnísystém, který představuje maximální zjednodušenípři zachování příznivých produkčních parametrůa umožňuje řízení procesu dalšími přítoky substrá-tů, zvláště v jeho závěrečné fázi a ovlivnění složeníkonečného produktu zvláště z hlediska potřeb jehoizolace. Jedná se o fermentační systém, znázorněnýna vyobrazení a představuje 2-stupňovou kontinu-ální fermentaci s kontinuálním režimem v prvémrůstovém stupni a semikontinuálním režimem vestřídavě pracujících dvou a více produkčních fer-mentorech. Symboly Fj a F2 představují přítokfermentačního média do 1. resp. 2. stupně systému(1/h). F3 představuje další přítok zdroje uhlíku ,nebo jeho směsi se zdrojem dusíku a dalších látekdo 2. stupně, výtok půdy obsahující akumulovanýL-lysin je označen symbolem F4 (1/h). Prvý fer-mentor (růstový) je veden v kontinuálním režimuza podmínek blížících se optimu růstové produkti-vity (zředovací rychlost Dt = 0,10—0,30 h/_1resp. doba zdržení mikroorganismů= 3,33—10 h, podle použitého mikroorganismu)při současném zachování optimálních předpokladůpro dynamickou biosyntézu produktu v následují-cím produkčním stupni.

Na úrovni produkčního fermentoru je používánsemikontinuální režim, to znamená, že paralelnířada těchto fermentorů (minimálně dva) procházístřídavě fází kontinuálního doplnění obsahu a jed-norázového dokončení procesu následovanéhoodběrem části obsahu fermentační nádoby(30-60 % v závislosti na zvoleném režimu). Podleodebíraného podílu obsahu produkčního fermen-toru a počtu těchto stupňů se mění časové zastou-pení jednotlivých fází semikontinuálního režimu(1 : 1, 1 : 2, 3...). Na úrovni produkčního stupněje používán další přítok zdroje uhlíku nebo jehosměsi se zdrojem dusíku, potřebných aminokyselina stimulátorů biosyntézy L-lysinu. Podle hladinyzákladních substrátů v přítoku z 1. stupně, celkovédoby zdržení buněk kultury ve 2. stupni systémua podílu fáze jednorázového dokončení procesu semění i režim zmíněného přítoku substrátů tak, žepřekrývá 0-96 % semikontinuálního cyklu tohotofermentoru. Zmíněné přídavky umožňují zvýšenícelkového výtěžku L-lysinu, regulaci procesuv produkční fázi i její prodloužení. Vzhledemk tomu, že proces je dokončován jednorázovýmzpůsobem vedení fermentace, zastavení přítokusubstrátů v jeho závěrečné fázi umožňuje ovlivnitkvalitu výsledného produktu podle potřeb izolačníčásti celkové technologie fermentační přípravy L-lysinu. Používaná doba zdržení mikroorganismův produkčním fermentoru činí 30—50 hodin. Při testovacích srovnávacích měřeních s 2-stup-ňovým systémem sériově uspořádaných fermento-rů v kontinuálním režimu bylo prokázáno, žeznázorněná aparatura umožňuje za stejných pod-mínek (na úrovni růstového i produkčního stupně)zvýšení celkových produkčních parametrů (pro-duktivita) o 10—15 %. Další výhody byly jižpopsány v předešlém textu. ! Srovnání naměřených výsledků (viz příklad 1)s ^produktivitou jednorázového procesu za odpoví-dajících standardních podmínek pro použitý pro-dukční kmen (produkce 60 g L-lysinu/1 za 72 h) jevelmi výhodné. Produktivita resp. produkční rych-lost kontinuálního systému na úrovni produkčníhostupně je o 60% vyšší, na úrovni celého systémupřibližně o 40 %. Dlouhodobé teoretické srovnání(za 420 hodin) produkce L-lysinu v kontinuálníma odpovídajícím systému jednorázových fermenta-cí je ještě výhodnější. Produkce aminokyselinyv kontinuálním procesu je o 70—80 % vyšší. Pozahrnutí nákladů spojených s provozem menšíhorůstového fermentoru by míra tohoto zvýšenípoklesla přibližně na 50 %. Příklady provedení Příklad 1

Jako produkční kmen byla použita supresorovámutanta Brevibacterium sp., zajišťující potřebnougenetickou a tedy i produkční stabilitu procesu.

Po namnožení v termostatu na masopeptonovémagaru (28 °C, 36-48 hod.) byla kultura (1-2kličky) převedena do inokulačních 500 ml baněk(*0 ml media obsahujícího 25 g/1 sacharózya 30 g/1 kukuřičného výluhu, pH 7,0). Po uplynutí30 hodin bylo inokulum převedeno do inokulační-ho 20-litrovéhofermentoru (2 % obj.), obsahující-ho stejnou půdu (míchám 350 ot./min., vzdušnění101/min., doba kultivace 14 hodin).

Jako vlastní fermentační systém byly použity20-litrové fermentory (základní pracovní objem101) s následující fermentační půdou (též přítok do 1. stupně): sacharóza 150 g/1 kyselý hydrolyzát arašídovémouky (odpovídá 30 g/1 mouky) 200 ml/1kukuřičný výluh 10 g/1 KH2PO4 2 g/1

MgSO4.7 H2O 0,3 g/1 technický biotin (1%) 0,005 g/1 thiamin 0,0002 g/1 polypropylenglykol (PPG) 0,2 ml/1 pH půdy bylo udržováno v hodnotě 6,8-7,0.

Systém jednotlivých průtoků a použitých pra-covních objemů byl upraven tak, aby splňovalpožadavky na dosažení příslušných zřeďovacíchrychlostí resp. dob zdržení mikroorganismů v sys-tému. Růstový stupeň: přítok půdy do systému byl

Claims (1)

1. zahájen v 6.-12. hodině po inokulaci (10% obj. , inokula) za následujících průběžných kultivačníchpodmínek: teplota 28 °C, míchání 470 ot./min., vzdušnění 101/min., zředovací lychlost= 0,14 h_1 resp. doba zdržení ©t = 7,15 h. Za zmíněných podmínek bylo dosaženo následu-jícího rovnovážného stavu. koncentrace L-lysinu: 3,0 g/1 koncentrace sacharózy: 120 g/1 koncentrace buněk kultury: 6 g/1 Produkční stupeň: použit byl fermentační systémodpovídající 2 produkčním fermentorům ve střída-vém semikontinuálním režimu za následujícíchkultivačních podmínek: teplota 28 °C, míchání470 ot./min„ vzdušnění 3 1/min., doba zdržení©2 = 32 h, semikontinuální režim spočíval ve stří-dání 8-hodinových intervalů, charakterizovaných:1/ odběrem 50% pracovního objemu fermentoru .7 PŘEDMĚT Způsob fermentační výroby L-lysinu kontinuálníkultivací produkčních mikroorganismů, zejménarodů Brevibacterium nebo Corynebacterium, v te-kuté živné půdě, obsahující zdroje asimilovatelné-ho uhlíku a dusíku a minerální živné soli, zasubmerzních podmínek, přičemž jako zdroje asi-milovatelného uhlíku se používá například sacha-rózy, melasy nebo hydrolyzátů polysacharidů, ky-seliny octové a jejích solí nebo ethanolu a jakozdroje asimilovatelného dusíku amonných solí,hydrolyzátů arašídové mouky nebo kukuřičnéhovýluhu, jednotlivě nebo v kombinaci, vyznačujícíse tím, že se produkční mikroorganismus kultivujedvoustupňové, s kontinuálním režimem v prvním,tj. růstovém stupni, se zředovací rychlostí D, 208 078 s následným kontinuálním doplněním a 2/ jednorá-zovým dokončením procesu. V prvých 6 hodinách8-hodinového intervalu jednorázového vedeníprocesu (37,5% délky cyklu) byla dále dávkovánasměs sacharózy a kyselého hydrolyzátů arašídovémouky, takže celková dávka činila 180 g/1 sacharó-zy a 250 ml/1 kyselého hydrolyzátů. Za popsaných podmínek bylo dosaženo na koncicyklu následujících rovnovážných hodnot: koncentrace L-lysinu: 46,0 g/1 koncentrace sacharózy: 0 g/1 koncentrace buněk kultury: 20 g/1 Systém byl tedy schopen poskytovat ná výtoku 46 g/1 L-lysinu za 32 hod. (1,44 g/l.h) Produkčnírychlost v produkčním stupni činila^ 1,34 g/l.h.a celková produktivita systému 1,18 g L-lysinu/l.hod. Výtěžek aminokyseliny vztažený na spotře-bovanou sachařózu činil 25,6 %. & VYNÁLEZU = 0,10 až0,30 h_1,resp. dobou zdržení 0 = 3,33 až10,00 hodin, a semikontinuálním režimem v násle-dujících, alespoň dvou produkčních stupních, s do-bou zdržení 02 = 30 až 50 hodin, při němž se střídáfáze kontinuálního doplňování obsahu produkč-ních stupňů z růstového stupně s jednorázovýmdokončením procesu, následovaného odběrem 30až 60 % obsahu tohoto stupně, a podle velikostiodebíraného podílu obsahu produkčního stupněa počtu těchto stupňů se mění časové zastoupeníjednotlivých fází, přičemž do každého produkční-ho stupně se dávkuje další přídavek zdroje uhlíkunebo jeho směsi se zdrojem dusíku, aminokyselina stimulátorů biosyntézy L-lysinu. 1 výkres