CS206378B1 - Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy - Google Patents
Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy Download PDFInfo
- Publication number
- CS206378B1 CS206378B1 CS800179A CS800179A CS206378B1 CS 206378 B1 CS206378 B1 CS 206378B1 CS 800179 A CS800179 A CS 800179A CS 800179 A CS800179 A CS 800179A CS 206378 B1 CS206378 B1 CS 206378B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- solution
- equilibration
- cellulose
- negative
- lactate dehydrogenase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 23
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 2-nitroimidazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=NC=CN1 YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L remazol brilliant blue r Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(N)=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1NC1=CC=CC(S(=O)(=O)CCOS([O-])(=O)=O)=C1 KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(54) Sp6sob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy
Vynález sa týká jpdsobu izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy pomocou řarebných Remazolových a triazínovýeh derivátov perlovej celulózy.
Triazínové farbivá, a to hlavně Cibacron Blue F3G-A, kovalentne viazané na vodonerozpustné polysaeharidy, našli v posledněj době široké možnosti uplatnenie ako generálne afinanty v afinitnej chromatografii enzýmov, a to najma zo skupiny dehydrogenáz a kináz. £Ř. S. Beiesner, F. B. Rudolph, J. Chromatogr. 161, 12? /1978/J. NajvSčšie uplatnenie tu našli polysaeharidy na báze sieťovanej· agarózy vo formě komerčných preparátov Blue Sepharose®
CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala; 275,- Sw. Grs. per 25 g), Af f i-Gel ® Blue (Bio·· <* TM TffiT'·'
Rad Laboratories, Munchen; 220,- Dlí.per 100 ml) či Matrex Gel Blue A a Matrex Gel Sed A (Amiccn B. V., Oosterhout). Aj iné polysaeharidy, napr. sieťované dextrány, vykazujú dobré vlastnosti pre tento druh použitia. Nie je tomu tak u celulózy, ktorá sa doteraz jevila ako úplné nevhodná (H.-J. Bohme et al., J. Chromatogr. 69, 209 (1972); S. Angal, Ρ» D. G. Dean, Biochem. J. 167, 301 (1977)· Negativnou vlastnosťou tohoto polysacharidu derivatizevaného farbivom Cibacron Blue F3G-A boli velmi nízké resorbcie chromátografováných enzýmov.
Ako ame už predtým ukázali, triazínové a Reaazolové deriváty perlovej celulózy si zachovávajú znamenité vlastnosti perlovej celulózy. Naviac pri správnéj volbě afinanta je možné překonat všetky nevýhody doteraz brániace použitiu celulózy na tieto účely.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa na perlovú celulózu a obsahom 50 až 100 pmólov
206 378
-* ' 2· kovalentne viasaného Reaazolového alebo triazínového farbiva na 1 g sochej perlovej celulózy nechá v prvom stupni pfisobiť zriedený roztok hovBdzieho sérového albuminu, prebytočný albumin sa odstráni prenytím ι 1 I NaCl a po equilibrovahi tlmivým roztokem o pH 6,5 eí 8 aa v druhom stupni na takto upravená perlová celulózu nechá pDaobit homogenizovaný biologický materiál obsahujáci laktátdehydrogenázu, pričom vžeťky sprievodné nežiadáce nízkoa vysokomolekulové látky sa odstránia následnou eláciou a rovnakým equilibračnýa roztokom a potom equilibračnýa roztokom obsahujdeim 0,5 ti 1 K nikotíneeid-adenín-dinukleotid vždy dovtedy, kým nie je reakcia eluátu na bielkoviny negativna, načo v tretom stupni sa adsorbovaný, prečiatený enzým laktátdehydrogenáza vytěsní eláciou s equilibračnýa roztokom obsahujáci® 0,5 až 1,5 mM redukovaný nikotínamid-adenín-dinukleotid dovtedy, kým nie j® skážka eluátu na katalytická aktivitu laktátdehydrogenázy negativna a nakoniec aa perlová celulóza připraví na opakované použiti® premytím s 1 M NaCl do negatívnej reakcie premývacieho roztoku na bielkoviny.
Perlová celulóza, ako aj jej Remažolové či triazínové deriváty obaahujáce elM NaCl nevyaytelný albumin nejavia žiadne nespecifické aorpcie voči laktátdehydrogenáze (IBM).
Pre sfinitná chroaatografiu LDH z biologického materiálu .nie je vhodný Cibaeren SLue F3G-A. Heci toto farbivo má ekutočne vysoká afinitu ku LDH, jeho derivát perlovéj celulózy stále prejavuje nízku áčinnosť resorbcie.
Pre popíaaný jednostupnový vysokoúčinný izolačný postup je možné použit hrubé homogenáty z rdznych biologických materiálov počnúc kvasničnýai extraktem! až po Specializované orgány cicavcov, napr. sval, pečen, srdce a pod. Nevhodným je vySSÍ obsah sérových bielkovín.
Jefineduchším © lacnejSía je pestup, pri ktorom ea premýva derivatizovená perlová celulóza ao zachytanou LDH equilibračnýa tlmivým roztokom obaahujáeim 1 mM redukovaný aiketínamid-adenín-dinukleotid (NADH). Sluát obsahuje viac než 90 % dávkovanéj LDH s minimálně 15-náaobným stupnom purifikácie. Naproti tomu keS aa eluuje tlmivým roztekom ebaahujáeim z 1 mM NADH po predchádzajáeej eláeii a 1 mM nikotínamid-adenín-dinukleetidem (NAD), eluát / obsahuje aenšie množstvo ensýau, avšak viac než 25-násobne purifikováného.
. · . i . Nakoniec ták, ako Cibacron Blue P3G-A deriváty sieťovanýeh agarez a dextránov aj Reaazolové a triazínové deriváty perlovej celulózy je možné pre popíaaný postup izoláoie a purifikácie LDH použit viaenásobne.
Výhodou navrhovaného postupu je, že umožňuje izolovat a purifikovat
- LDH poměrně jednoduchým technologickým paetupo®,
-LDH na podstatné lačnějších materiálech ako doteraz,
- LDH s vySšču resorbeiou a při vyšších vazbových kapacitách farebnej perlovej celulózy než bole tomu doteraz u známých triazínovýeh derivátev polysaeharidov,
- aáčasne viacero enzýmov.
Příklad 1 - .
ml Remazol Briliant Blue RN derivátu perlovej celulózy obaahujáceho 65 pmólov farbiva η® 1 g suchej celulózy sa premyl.o s 25 ml 0,1 % roztoku hovádzieho sérového albuminu, 100 ml 10 mil Tris-HSl pufru pH 7,5 e přídavkem 1 mM Chelatonu 3 a 2 mlí 2-merkaptoetanolu (roztok 1), Sálej 100 ml 1 M NaCl a nakoniec 200 ml roztoku 1. Na takto připravený štipec sa nanieslo 25 ml homogenátu z krysých pečení obsahujúceho 310 mg bielkovín
Λ a 473 jednotiek LDH a premylo 130 ml roztoku 1. Naviazaná LDH eajvytesnila 110 ml roztoku 1 s přídavkem 1 mM NADH (roztok 2).
NADH-frakeia obsahovala 16-násobne prečistenú LDH v množstve 430 jednotiek, čo představuje 98 % na štipec nanesenej LDH.
Příklad 2
Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, Že sa použil Ostazín červen St5B derivát perlovej celulózy obsahujúci 80 pmólov farbiva na 1 g autíhej celulózy.
NADH-frakcia obsahovala 14,5-náaobne prečistenú LDH v množatve 468 jednotiek, čo představuje 99 % na stípec nanesenej LDH.
Příklad'3
Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že sa použil Prócion Biu® MX-B derivát perlovej celulózy obsahujúci 67 pmólov farbiva na 1 g suchéj celulózy.
liADH-frakcia obsahovala 10,5-násobne prečistenú LDH v množstva 416 jednotiek, čo činilo 88 % na stípec nanesenej LDH.
Příklad 4
Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, Že po nanesení homogenátu (320 mg bielkovín, 452 jednotiek) sa stípec premýval 250 ml roztoku 1, 100 ml roztoku 1 s prídavkom 1 mM NAD a nakoniec 140 ml roztoku 2.
NADH-frakcia obsahovala 23,5-násobne prečistenú LDH v množstve 266 jednotiek (8 mg bielkovín), čo zodpovědělo‘60 % na stípec nanesenej LDH.
Příklad 5 ' '
Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že sa použilo 15 ml čiastočne přečištěného preparátu LDH z králičieho svalu obsahujúceho 11 mg bielkovín a 440 jednotiek LDH. '
NADH-frakcia obsahovala 100 % na stípec nanesenej LDH.
Vynález má uplatnenie všade, kde je potřebné izolovať alebo přečistil? laktátdehydrogenázu z rfizneho biologického materiálu od Salších bielkovín, resp. enzýmov, a to v priemyselnej praxi alebo vo výskume.
Claims (2)
- PREDMET VYNÁLEZU.Spdsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy vyznačujúci sa tým, že sa na perlovú celulózu 8 obsahem 50 až 100 pmólov kovalentne viazaného Remazolového alebo triazínového farbiva na 1 g suchej perlovej celulózy nechá v prvom stupni pdsobiť zriedený roztok hovfidzieho sérového albuminu, přebytečný albumin sa odstráni premytím s 1 II NaCl a po equilibrovaní tlmivým roztokem o pH 6,5 až 8 sa v druhom stupni na takto upravená perlová celulózu nechá pOsobiť homogenizovaný biologický materiál obsahujáci laktátdehydrogenázu, pričom váetky aprievodné nežiadáce nízko- a vyeokomolekulové látky sa odstránia následnou eláciou s rovnakým equilibračným roztokom a potom equilibračným roztokom obsahujácim 0,5 až 1 mE jiikotínamid-adenín-dinukleotid vždy dovtedy, kým nie je reakcia eluátu na bielkovíny negativna, nača v treťom stupni sa adsorbovaný, přečištěný'enzým laktátdehydrogenáza vytěsní eláciou s equilibračným roztokom obsahujácim 0,5 až 1,5 mM redukovaný nikotínamid. -adenín-dinukleotid dovtedy, kým nie je skáška eluátu na katalytická aktivitu laktátde( hydrogenázy negativna a nakoniee sa perlová celulóza připraví na opakované použitia premyt ‘ _ tím s 1 M NaCl do negatívnej reakcie premývacieho roztoku na bielkoviny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (sk) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (sk) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS206378B1 true CS206378B1 (sk) | 1981-06-30 |
Family
ID=5430048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (sk) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS206378B1 (sk) |
-
1979
- 1979-11-21 CS CS800179A patent/CS206378B1/sk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Horio et al. | Preparation of crystalline Pseudomonas cytochrome c-551 and its general properties | |
| Findlay | The receptor proteins for concanavalin A and Lens culinaris phytohemagglutinin in the membrane of the human erythrocyte | |
| Dean et al. | Protein purification using immobilised triazine dyes | |
| Schwartz et al. | Biosynthesis of chondroitin sulfate. Purification of UDP-D-xylose: core protein β-D-xylosyltransferase by affinity chromatography | |
| US5310885A (en) | Process for immobilizing a protein containing substance on a solid phase | |
| Laurell et al. | Haptoglobins | |
| Beissner et al. | Immobilized anthraquinone dyes for affinity chromatography | |
| Scott-Burden et al. | Preparation of ribosome-free membranes from rat liver microsomes by means of lithium chloride | |
| Kuwabara et al. | Protein and carbohydrate moieties of a preparation of β-lactamase II | |
| CS206378B1 (sk) | Spôsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy | |
| Reagan et al. | Development of polyclonal antibodies against angiotensin type 2 receptors. | |
| Yeltman et al. | Purification and characterization of aldolase from human erythrocytes | |
| Guest et al. | Methyl derivatives of folic acid as intermediates in the methylation of homocysteine by Escherichia coli | |
| CA1187074A (en) | Antithrombin-heparin complex and method for its production | |
| Roux | Chemical evidence for conformational differences between the red-and far-red-absorbing forms of oat phytochrome | |
| Takahashi et al. | Purification and characteristics of RNase inhibitor from pig cerebral cortex | |
| Gruber et al. | Ethanol-induced conformational changes in rat brain microsomal membranes | |
| Doley et al. | The potential of Ultrogel®, an agarose-polyacrylamide copolymer, as a matrix for affinity chromatography | |
| Miribel et al. | The use of dye-ligand affinity chromatography for the purification of non-enzymatic human plasma proteins | |
| Sponholtz et al. | Preparation of cytochrome c2 from Rhodospirillum rubrum | |
| Tojo et al. | Purification of intracellular phospholipase A2 from rat spleen supernatant by reverse-phase high-performance liquid chromatography | |
| Bishay et al. | Purification and characterization of alkaline ribonuclease inhibitor from normal and nephrotic rat kidney compared to inhibitor from rat liver | |
| Kroviarski et al. | New strategies for the screening of a large number of immobilized dyes for the purification of enzymes: Application to the purification of enzymes from human haemolysate | |
| EP0079793A2 (en) | Amylase inhibitor and preparation thereof | |
| Mintz et al. | Glycoprotein purification on a high-capacity wheat germ lectin affinity column |