CS206378B1 - Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis - Google Patents
Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis Download PDFInfo
- Publication number
- CS206378B1 CS206378B1 CS800179A CS800179A CS206378B1 CS 206378 B1 CS206378 B1 CS 206378B1 CS 800179 A CS800179 A CS 800179A CS 800179 A CS800179 A CS 800179A CS 206378 B1 CS206378 B1 CS 206378B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- solution
- equilibration
- cellulose
- negative
- lactate dehydrogenase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 23
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 2-nitroimidazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=NC=CN1 YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L remazol brilliant blue r Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C(N)=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1NC1=CC=CC(S(=O)(=O)CCOS([O-])(=O)=O)=C1 KUIXZSYWBHSYCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
·.
ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA( 1© )
POPIS VYNALEZU 206 378 (wn
K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU (61) ' Ί) Výstavná priorita(22) Přihlášené 21 11 79(21) PV 8001-79 (51) Int.Cl? C 08 B 15/00, A 61 K 37/54
ÚŘAD PRO VYNÁLEZY
A OBJEVY (40) Zveřejněné 29 08 80(45) Vydané 15 10 83 (75)
Autor vynálezu MISLOVICOVÓ DANICA ing., QBMEINBR PBTSR ing. CSc., KUNIAK tUDOVÍT ing. CSc.,BRATISLAVA a ZElíSK JURAJ ing, CSc,, LBDNICA (54) SpČsob izoláeie a purifikácie laktátdehydrogenázy 1
Vynález sa týká ipdsobu izoláeie a purifikácie laktátdehydrogenázy pomoeou řarebnýchRamazolových a triazínovýeh derivátov perlovej celulózy.
Triazínové farbivá, a to hlavně Cibacron Blue ř3G-í, kovalentne viazané na vodoneroz-pustné polysacharidy, našli v posledněj době široké možnosti uplatnenie ako generálne afinan-ty v afinitnej chromátografii enzýmov, a to najma zo skupiny dehydrogenáz a kináz. £Ř. S.Beíesner, F. B. Rudolph, J. Chromatogr. 161, 127 /1978/J. Najv&čšie uplatnenie tu našli po-lysaeharidy na báze sieťovanej· agarózy vo formě komerčných preparátov Blue Sepharose® CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala; 275»- Sw. Cra. per 25 g) , Af f i-Gel ® Blue (Bio- ·· <* TM TffiT'·'
Rad Laboratories, Munchen; 220,- Dlí.per 100 ml) či Matrex Gel Blue A a Matrex Gel SedA (Amiccn B. V., Oosterhout). Aj iné polysacharidy, napr. sieťované dextrány, vykazujú dob-ré vlastnosti pre tento druh použitia. Nie je tomu tak u celulózy, ktorá sa doteraz javilaako úplné nevhodná (H.-J. Bohme et al., J. Chromatogr. 69, 209 (1972); S. Angal, P. D. G.Dean, Biochem. J. 167, 301 (1977)· Negativnou vlastnosťou tohoto polysacharidu derivatizo-vaného farbivom Cibacron Blue F3G-A boli velmi nízké resorbcie chromátografováných enzýmov·
Ako ame už predtým ukázali, triazínové a Remazolové deriváty perlovej celulózy si za-chovávajú znamenité vlastnosti perlovej celulózy. Navias pri správnéj volbě afinanta jemožné překonat všetky nevýhody doteraz brániace použitiu celulózy na tieto účely.
Podstata vynálezu spočívá v tom, že sa na perlovú celulózu a obsahom 50 až 100 pmólov 206 378 -* '·** ' ' 2.· kovalentne viasaného Reaazolového alebo triazínového farbive na 1 g sochej perlovej celuló-zy nechá v prvom stupni pdsobit zriedený roztok hovBdzieho sérového albuminu, prebytočnýalbumin aa odstráni premytím ι 1 I NaCl a po equilibrovahí tlmivým roztokem o pH 6,5 eí 8sa v druhem stupni na takto upravená perlová celulózu nechá pčeobit homogenizovený biolo-gický materiál obsahujáci laktátdehydrogenázu, pričom všeťky sprievodné nežiadúce nízko-a vysokomolekulové látky sa odstránia následnou eláciou rovnakýa equilibračným roztokoma potom equilibračným roztokom obsahujúeim 0,5 ti 1 K nikotíneeid-adenín-dinukleotid vždydovtedy, kým nie je reakcia eluátu na bielkoviny negativna, načo v tretom stupni sa ad-sorbovaný, přečištěný enzým laktátdehydrogenáza vytěsní eláciou e equilibračným roztokomobsahujáci® 0,5 až 1,5 mM redukovaný nikotínamid-adenín-dinukleotid dovtedy, kým nie j®skúška eluátu na katalytická aktivitu laktátdehydrogenázy negativna a nakoniec sa perlovácelulóza připraví na opakované použiti® premytím s 1 M NaCl do negatívnej reakeie premýva-cieho roztoku na bielkoviny.
Perlová celulóza, ako aj jej Remažolové či triazínové deriváty obsahujáce elM NaClnevyaytelný albumin nejavia žiadne nespecifické eorpcie voči laktátdehydrogenáze (1DM).
Pre sfinitná chroaatografiu LDH z biologického materiálu .nie je vhodný Cibaeren Biu®F3G-A. Heci toto farbivo má ekutočne vysoká afinitu ku LDH, jeho derivát perlovej celuló-zy stále prejavuje nízku účinnost* resorbcie. Pře popíaaný jednostupnový vysokoúčinný ižolačný postup je možné použit hrubé homo-genáty z rčznych biologických aateriálov počnúc kvasničnými extraktem! až po Specializova-né orgány cicavcov, napr. sval, pečen, srdce a pod» Nevhodným je vyšší obsah sérovýchbielkovín.
Jefineduchším a lačnějším je pestup, pri ktoroa sa premýva derivatizovená perlová eelu-lóza 99 zachytanou LDH equilibračným tlaivýa roztokom obaahujúeim 1 mM redukovaný niketí-namid-adenín-dinukleotid (NADH). Sluát obsahuje viac než 90 % dávkovanéj LDH s minimálně15-násobným stupnom purifikácie. Naproti tomu keS sa eluuje tlaivýa roztokom sbsahujúeim z1 mM NADH po predchádzajúeej elúeii s 1 mM nikotínaaid-adenín-dinukleetidea (NAD), eluát /obsahuje menšit množstvo enzýau, avšak viac než 25-násobne purifikováného. . · . i . Nakoniec ták, ako Cibacron Blue P3G-A deriváty sieťovaaýeh agaróz a dextránov aj Re-mazolové a triazínové deriváty perlovej celulózy je možné pre popísaaý postup izoláeiea purifikácie LDH použit viacnásobne. Výhodou navrhovaného postupu je, že umožňuje izolovat a purifikovat - LDH poměrně jednoduchým technologickým postupem, -LDH na podstatné lačnějších materiálech ako doteraz, - LDH s vyššou resorbeiou a při vyšších vazbových kapacitách farebnej perlovej celulózynež bole tomu doteraz u známých triazínovýeh derivátev polysaeharidov, - eúčasne viacere enzýmov. Příklad 1 - . 10 ml Remazol Briliant Blue RN derivátu perlovej celulózy obaahujúceho 65 pmólov
Claims (2)
- farbiva na 1 g suchej celulózy sa premyl.o s 25 ml 0,1 % roztoku hovádzieho sérového albu-minu, 100 ml 10 mM Tris-HOl pufru pH 7,5 e přídavkem 1 mM Chelatonu 3 a 2 mM 2-merkapto-etanolu (roztok 1), Sálej 100 ml 1 M NaCl a nakoniec 200 ml roztoku 1. Na takto připrave-ný štipec sa nanieslo 25 ml homogenátu z krysých pečení obsahujúceho 310 mg bielkovín Λ a 473 jednotiek LDH a premylo 130 ml roztoku 1. Naviazaná LDH sa jvytesnila 110 ml rozteku1 s přídavkem 1 mM NADH (roztok 2). NADH-frakeia obsahovala 16-násobne prečistenú LDH v množstve 430 jednotiek, čo před-stavuje 98 % na štipec nanesenej LDH. Příklad
- 2 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, Že sa použil Ostazín červen St5B derivátperlovej celulózy obsahujúci 80 pmólov farbiva na 1 g autíhej celulózy. NADH-frakcia obsahovala 14,5-náaobne prečistenú LDH v množstve 468 jednotiek, čopředstavuje 99 % na stípec nanesenej LDH. Příklad'3 Postup podl’a příkladu 1 s tým rozdielom, že sa použil Prócion Biu® MX-B derivát per-lovej celulózy obsahujúci 67 pmólov farbiva na 1 g suchéj celulózy. liADH-frakcia obsahovala 10,5-násobne prečistenú LDH v množstve 416 jednotiek, čo čini-lo 88 % na stípec nanesenej LDH. Příklad 4 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, Že po nanesení homogenátu (320 mg bielkovín,452 jednotiek) sa stípec premýval 250 ml roztoku 1, 100 ml roztoku 1 s prídavkom 1 mM NADa nakoniec 140 ml roztoku 2. NADH-frakcia obsahovala 23,5-náeobne prečistenú LDH v množstve 266 jednotiek (8 mgbielkovín), čo zodpovědělo‘60 % na stípec nanesenej LDH. Příklad 5 ' ' Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že sa použilo 15 ml čiastočne přečištěnéhopreparátu LDH z králičieho svalu obsahujúceho 11 mg bielkovín a 440 jednotiek LDH. ' NADH-frakcia obsahovala 100 % na stípec nanesenej LDH. Vynález má uplatnenie všade, kde je potřebné izolovať alebo přečistit laktátdehydroge-názu z rčzneho biologického materiálu od Salších bielkovín, resp. enzýmov, a to v priemy-selnej praxi alebo vo výskume. PREDMST VYNÁLEZU. Spdsob izolácie a purifikácie laktátdehydrogenázy vyznačujúci sa tým, že sa na perlo-vá celulózu a obsahem 50 až 100 pmólov kovalentne viazaného Remazolového alebo triazíno-vého farbiva na 1 g suchej perlovej celulózy nechá v prvom stupni pdsobiť zriedený roztokhovfidzieho sérového albuminu, přebytečný albumin sa odstráni premytim s 1 II NaCl a po 4 equilibrovaní tlaivýa roztokem o pH 6,5 aí 8 íi » druhom stupni na takto upravená perlovácelulózu nechá pOsobiť homogenizovaný biologický materiál obsahujáci laktátdehydrogenázu,pričom váetky sprievodné nežiadáce nízko- a vysokomolekulové látky sa odetránia následnoueláciou s rovnakým equilibračným roztokom a potom equilibračným roztokom obsahujácim 0,5až 1 mE jiikotínamid-adenín-dinukleotid vždy dovtedy, kým nie je reakcia eluátu na bielko-viny negativna, načo v treťom stupni sa adsorbovaný, přečištěný'enzým laktátdehydrogenázavytěsní eláciou s equilibračným roztokom obsahujácim 0,5 až 1,5 mM redukovaný nikotínamid- . -adenín-dinukleotid dovtedy, kým nie je skáška eluátu na katalytická aktivitu laktátde-( hydrogenázy negativna a nakoniee sa perlová celulóza připraví na opakované použitie premy- t ‘ _ tím s 1 M KaCl do negatívnej reakcie premývacieho roztoku na bielkoviny. j
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (en) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (en) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS206378B1 true CS206378B1 (en) | 1981-06-30 |
Family
ID=5430048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS800179A CS206378B1 (en) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS206378B1 (cs) |
-
1979
- 1979-11-21 CS CS800179A patent/CS206378B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Horio et al. | Preparation of crystalline Pseudomonas cytochrome c-551 and its general properties | |
| Findlay | The receptor proteins for concanavalin A and Lens culinaris phytohemagglutinin in the membrane of the human erythrocyte | |
| Murad et al. | A simple, sensitive protein-binding assay for guanosine 3′: 5′-monophosphate | |
| Dean et al. | Protein purification using immobilised triazine dyes | |
| Schwartz et al. | Biosynthesis of chondroitin sulfate. Purification of UDP-D-xylose: core protein β-D-xylosyltransferase by affinity chromatography | |
| Mulder | The effect of phenobarbital on the submicrosomal distribution of uridine diphosphate glucuronyltransferase from rat liver | |
| MacDonald et al. | [40] Isolation of cytokinins by immunoaffinity chromatography and analysis by high-performance liquid chromatography radioimmunoassay | |
| EP0374778A2 (de) | Verfahren zur Proteinimmobilisierung an einer Festphase, so hergestellte Protein tragende Festphase sowie deren Verwendung | |
| Laurell et al. | Haptoglobins | |
| Yamamoto et al. | Selective inhibition of two soluble adenosine cyclic 3', 5'-phosphate phosphodiesterases partially purified from calf liver | |
| Kuwabara et al. | Protein and carbohydrate moieties of a preparation of β-lactamase II | |
| Jefferson et al. | Studies on ornithine decarboxylase activity in the isolated perfused rat liver | |
| CS206378B1 (en) | Method of isolation and purification of the lactatedehydrogenasis | |
| Kahn et al. | Heat lability of glucose-6-phosphate dehydrogenase in some senescent human cultured cells. Evidence for its postsynthetic nature | |
| Reagan et al. | Development of polyclonal antibodies against angiotensin type 2 receptors. | |
| US4634763A (en) | Amylase inhibitor and preparation and use thereof | |
| Takahashi et al. | Purification and characteristics of RNase inhibitor from pig cerebral cortex | |
| Roux | Chemical evidence for conformational differences between the red-and far-red-absorbing forms of oat phytochrome | |
| Doley et al. | The potential of Ultrogel®, an agarose-polyacrylamide copolymer, as a matrix for affinity chromatography | |
| Miribel et al. | The use of dye-ligand affinity chromatography for the purification of non-enzymatic human plasma proteins | |
| Sponholtz et al. | Preparation of cytochrome c2 from Rhodospirillum rubrum | |
| Kroviarski et al. | New strategies for the screening of a large number of immobilized dyes for the purification of enzymes: Application to the purification of enzymes from human haemolysate | |
| Magnani et al. | Hexokinase type I multiplicity in human erythrocytes | |
| Mintz et al. | Glycoprotein purification on a high-capacity wheat germ lectin affinity column | |
| Ford et al. | Characterization of NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase in the y-7 and pc-1 y-7 mutants of Chlamydomonas reinhardtii |