CS203767B1 - Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy - Google Patents
Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CS203767B1 CS203767B1 CS262479A CS262479A CS203767B1 CS 203767 B1 CS203767 B1 CS 203767B1 CS 262479 A CS262479 A CS 262479A CS 262479 A CS262479 A CS 262479A CS 203767 B1 CS203767 B1 CS 203767B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- washed
- separation
- carrier
- anhydrous
- glucose
- Prior art date
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 23
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 23
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical group FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229910015900 BF3 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003377 acid catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000008266 deoxy sugars Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000532 dioxanyl group Chemical group 0.000 claims 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 11
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 8
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 7
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 7
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 125000003423 D-mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 2
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 150000002771 monosaccharide derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000220451 Canavalia Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 229930182473 O-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008444 O-glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229930182475 S-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000219871 Ulex Species 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003569 thioglycosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
Vynález se týká nosiče na bázi regenerované celulosy pro separaci biologicky aktivních látek, způsobu jeho přípravy a použití k izolaci biologicky aktivních látek obsahujících vazebné místo pro sacharidové molekuly.
Afinitní chromatografie se v poslední době stává nejdůležitější preparativní metodou užívanou pro izolaci proteinů, například enzymů, protilátek a lektinů. Táto metoda využívá vysoké specifičnosti vazby těchto proteinů na určité nízkomolekulární látky (lígandy) zmobilizované na vhbdném pevném nosiči. Velkou skupinu takových proteinů vážících specifické ligandy tvoří ty, které specificky váží sacharidy. K izolaci takovýchto proteinů se používá různých typů pevných nosičů obsahujících glykosidicky vázané sacharidy. Je známo několik typů takových afinitních nosičů obsahujících vázané sacharidové struktury. První skupinu tvoří přírodní polysacharidy v gelové formě (zesíťované dextranové gely, agarosové gely), druhou skupinu přírodní glykoproteiny bud zesíťované, nebo navázané na gelový nosič. Do třetí skupiny patří syntetické síťované kopolymery při jejichž přípravě se používá jako· jeden monomer polymerizovatelný glykosid daného sacharidu. Čtvrtou a největší skupinu tvoří deriváty různých syn2 tetických nebo přírodních nosičů na které se kovalentně dodatečně naváží sacharidy.
Nosiče z první skupiny lze použít jěn v několika speciálních případech, nosiče z druhé skupiny bud také postrádají obecnost použití, nebo jsou značně drahé a nelze je používat ve velkém měřítku. Mezi nosiče třetí skupiny patří O-glykosylpolýakrylamidové gely do kterých lze zabudovat jakýkoli cukr a tím docílit značné specifičnosti a obecnosti použití. (V· Hořejší, J. Kocourek: Biochim. Biophys. Acta 297, 346 (1973), čs. autorské osvědčení 163 443). Nevýhodou těchto gelů je nutnost předběžné přípravy sacharidových monomerů (glykosidy polymerizovatelných aglykonů), nepravidelný tvar a velikost gelových částic, který zhoršuje jejich průtokové vlastnosti a v neposlední řadě nemožnost přípravy dostatečně porézních nosičů umožňujících izolaci makromolekul s velmi vysokou molekulovou hmotností. Většina nosičů ze čtvrté skupiny se připravuje synteticky složitými reakcemi a s použitím nákladných reagencií.
Sem patří zejména nosiče na bázi agarosových gelů s navázanými deriváty monosacharidů. K jejich přípravě se zpravidla používá různých derivátů monosacharidů obsahujících aminoskupinu připojenou k nim na víceatomárním řetězci (špaceru) např.
203787 ·
O-glykosidů, N-acylglykosyiaminů, N-acylaminocukrů a thioglykošidů, jejichž synthesa obecně zahrnuje několik reakčních stupňů. Získaný derivát cukru se kovalentně váže na nosič, který se musí · předtím aktivovat např. bromkyanem.
Jiný způsob přípravy cukry modifikovaných polysacharidů spočívá v reakci např. škrobu s monosacharidem a epichlorhydrinem,v přítomnosti silné báze. Vznikající produkt však nemá zcela optimální fyzikální vlastnosti zaručující vysokou účinnost zejména při sloupcové aplikaci. Dosud nej výhodnějšími afinitními nosiči z této skupiny jsou zřejmě glykosylované deriváty hydroxyalkylmethakrylátových kopolymerů (zn. Spheron). Jednoduchou reakcí lze připravit deriváty Spheronu obsahující potřebný cukr. Tyto· sorbenty mají i velmi dobré mechanické a průtokové vlastnosti. Nevýhodná je poměrně vysoká cena Spheronu a možpost nespecifických a ireversibilních adsoppcí na hydrofobní základní strukturu Spheronu, které zhoršují výtěžek a čistotu získaného preparátu proteinu. Tyto nedostatky se odstraní'při zachování všech ostatních výhod (snadnost přípravy, dobré mechanické a průtokové vlastnosti, chemická stabilita, vysoká kapacita) přípravou glykosylovaných derivátů poresních polysacharidových gelů, zvláště poresní regenerované celulosy ve sférické formě.
Předmětem vynálezu je eelulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek vyznačený tím, že na povrchu obsahuje alfa-glykosidicky kovalentně vázané sacharidy nebo· jejich deriváty vybrané ze skupiny monosacharidů, oligosačharidů, deoxycukrů a aminocukrů, má sférický tvar s velikostí částic 0,02 až 2,00 mm a v prostředí vody vykazuje poresitu P = 90% (celkový objem pórů).
Celulosové nosiče. pro separaci biologicky aktivních látek se podle vynálezu připravuje tak,. že, se sférická celulosa promyje bezvodým organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, promíchává se s roztokem bezvodého· cukru o koncentraci 0,5-až 5 % hmotnostních v témže rozpouštědle za přítomnosti kyselého katalysátoru při teplotě 15 až 70 °G po dobu 1 až 20 hodin, načež se promyje vodou o teplotě +4 až +10· °C a fosfátovým pufrem pH 7.
Podstata způsobu výroby nových derivátů podle vynálezu spočívá v tom, že se sférická celulosa míchá s příslušným bezvodým cukrem v bezvodém, (nebo téměř bezvodém) prostředí za přítomnosti kyselého katalysátoru. Po skončení reakce se vzniklé glykosylované deriváty polysacharidových gelů promyjí vodným roztokem pufru a jsou připraveny k afinitní chromatografíi.
Při provádění způsobu podle vynálezu se jako bezvódé rozpouštědlo používá dioxan, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, jako kyselý katalysátor fluorid boritý, chlorovodík nebo jejich směs. Biologicky aktivní látky obsahují vazebné místo pro sacharidy se adsorbují na glykosylovaný derivát buď na sloupci nebo· vsádkově, načež se balastní látky oddělí vymytím roztokem pufru a aktivní látky se uvolní roztokem příslušného lígandu nebo vhodným pufrem. Takto se v jediném isolačním kroku zisků čistý preparát bez neaktivních příměsí, jehož biologický účinek je desetkrát až tisíckrát vyšší než je aktivita aplikované surové směsi bílkovin nebo surového extraktu.
Vynález je blíže objasněn v příkladech konkrétního provedení:
Přikladl
Do 30 ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 5% v/v přípustný) obsahujícího 6% w/v suchého chlorovodíku se přidá 1,5 gramů suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy .(průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu. Suspense se třepe v uzavřené nádobě 8 hodin při 35 °C, potom se na fritě rychlé promyje studenou vodou a nakonec 0,lM fosfátovým pufrem pH 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje 15,5 % hmot. navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z pokusu v němž bylo použito 14C značené D-glukosy).
Příklad2
Do 30i ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 3% v/v přípustný) obsahujícího 6% w/v suchého chlorovodíku se přidá 1,5 gramů suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy (průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu. Suspense se třepe v uzavřené nádobě 24 hodA při 60 °C, potom se na fritě rychle promyje studenou vodou a nakonec 0,ÍM fosfátovým pufrem pH 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje. 29% hmot. navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z pokusu v němž bylo použito 14C značené D-glukosy).
Příklad 3
Do 30 ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 3% v/v přípustný) obsahujícího θ% w/v suchého chlorovodíku se přidá 0,15 g suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy (průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu,, Suspense se třepe v uzavřené nádobě 8 hodin při 35 °C, potom se na fritě rychle promyje studenou vodou a nakonec 0,lM fosfátovým pufrem pH, 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje 7,2 % hmot· navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z.pokusu v němž bylo použito 14C značené D-glukosy).
Přikládá
Záměnou D-glukosy v reakční směsi za jiné cukry se získávají při zachování ostatních podmínek jako· v příkladu 1 analogické produkty obsahující jiné cukerné jednotky. Navázané hmotnostní množství při použití D-mannosy je 17%, Ď-galaktosy 14,3%, L-arabinosy 12,3%, L-f úkosy 14%, L-rhamnosy 15,5%, maltosy 9,5%, N-acetyl-D-glukosaminu 16,5%, N-acetyl-D-galaktosaminu 13,51%.
P ř í k 1 a d 5
Glukosylovaný derivát sférické celulosy se připraví analogicky jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že místo dioxanu se použije dimethylsulfoxidu. Vzniklý glukosylovaný derivát obsahuje 1,1 % vázané D-glukosy.
P ř í k 1 a d 6
Do 30 ml suchého dioxanu obsahujícího 3% hmot. BF3 se přidají 3 ml sférické celulosy v suchém dioxanu a 1,5 g suché D-glukosy. Suspense se třepe 6 hodin v uzavřené nádobě při 35 °C, potom se na frltě promyje vodou a pufrem pH 7,0. Získají se 3 ml glukosylovaného derivátu obsahujícího 10,5 % navázané D-glukosy.
P ř í k 1 a d 7
Glykosylovaný derivát sférické celulosy se připraví analogicky jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že jako kyselý katalyzátor se použije dioixanového roztoku obsahujícího 3% hmot. BF3 a 3% hmot. HC1. Vzniklý glukosylovaný derivát obsahuje 20,5% vázané D-glukosy.
Příklad 8
Erythroaglutinačně aktivní frakce bílkovin získání srážením extraktu ze semen trojkýlu mečovitého (Canavalia ensiformls) síranem amonným do 80% nasycení se po odcentrifugování rozpustí v desetinásobném množství vody a nanese na sloupec D-glukosyl- nebo D-manosyl derivátu sférické celulosy. Po naneséní aktivní frakce se sloupec promyje 0,5 M roztokem chloridu sodného a specificky adsorbovaný konkanavalin A se vymyje 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,5 M NaCl· Eluci konkanavalinu A je možno alternativně docílit kyselým pufrem (pH 3] nebo borátovým pufrem. Frakce obsahující bílkovinu se epojí( dialyzují a lyofilisují. Takto· získaný preparát je eiektroforeticky čistý konkanavalin A, jehož hemaglutinační aktivita je 64 krát vyšší než aktivita aplikované hrubé frakce. Kapacita D-glukósyl derivátu celulosy, který obsahuje 15,3% navázané D-glukosy (viz příklad lj je 36 mg konkanavalinu A/ml, takže k izolaci veškerého lektinu obsaženého v extraktu ze 100 g semen postačí kolona gefu o objemu 100 ml. (Pracuje-li se při 4°C, je kapacita 70 mg/ml)
Kapacita D-glukosyl derivátu, který obsahuje 3,5% navázané D-glukosy je 9 mg konkanavalinu A/ml.
Kapacita' D-mannosyl derivátu, který obsahuje 7% D-mannosy je 44 mg con A/ml.
Alternativně je možno aglutinačně aktivní hrubou frakci bílkovin získanou srážením síranem amonným rozpustit, dialyzovat a lyofilizovat a na sloupec aplikovat rozpuštěnou lyoflllsovanou aktivní frakci.
Příklad 9
Aglutinačně aktivní frakce bílkovin získaná srážením extraktu ze semen hrachu (Pisum sativum) síranem amonným do 55,% nasycení se po odcentrifugování rozpustí v desetinásobném objemu vody a»nanese na sloupec D-glukosyl nebo D-mánnosyl derivátu sférické celulosy. Potom sé sloupec promyje 0,5 M roztokem NaCl a vázaný lektin se vymyje 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,5 M NaCl. Frakce obsahující bílkovinu se spojí, dialyzují a lyofilisují. Takto získaný preparát je eiektroforeticky čistý lektin ze semen hrachu, jehož aglutinační aktivita je 128krát vyšší než aktivita původní aplikované aktivní frakce. Kapacita D-glukosyl derivátu celulosy (15,5% vázané D-glukosy je 25 mg lektinu/ml.
20717
Příklad Semena Akt. frakce Použitý derivát Obsah cukru Eluce Kapacita Zvýšení (% (řJHá]2 so<} '(·'%·)·· (mg/iuJj aktivity
Hlodáš .evropský - 40 L-Fuc 0.1M 25 512 (Ulex euro- L-Fuc paeus)
CM ca· s«3 τΗ φ· oQ co l£r
CM vrt ca o
5? \-t 5
SgSj afl o O
Q
CM
CM eaz ca
CO
CM & ® .S 3 · o . Q«cm
3g%
O <
Sz r-l o o3 a
| o. | CJ | o | ||
| ). 1 | < | < | < | |
| (ΰ | 3 | 2: | z. | Z |
| O | O | 3 | i-*l 3 | 0 r·* |
| ώ: | ώ | 0 t | a 1 | 0' 1 |
Cl· o
CO.
o. in 03’ . ΙΛ
O ca«Μ V o .00 W Γ? « rt .. O &04.J
3 Π
Z £)3.
wco4
£ x. * 3 gS/ŠS 6«? 2 'a «·
tn , 20 3 7
P ř í k 1 a ů 1 6
LyGřilisované, upráškované jikry okouna (Perca fluviatilis) se extrahují mícháním s lOx objemem 0,9% NaCl 16 hodin, extrakt se potom centrifuguje. K supernatantu ,(100 ml) se přidá 10 ml D-glukosylderivátu sférické celulosy alternativně též D-mannosyl nebo L-fukoisyl (obsah navázaného cukru 15,5% a suspense se třepe 8 hodin při 10 °C.
Gel se odfiltruje, promyje na sloupci 0,9% NaCl a specificky adsorbovaný lektin se uvolní 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,9% NaCl· Získaný protein se dialyzuje a lyofilisuje. Získá se 210 mg elektroforeticky čistého, lektinu, jehož specifická aktivita je 64krát vyšší než aktivita jiker. Kapacita D-glukosyl derivátu celulofey je v tomto vsádkovém uspořádání 21 mg/ml. . .
Claims (4)
1. Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek vyznačený tím, že na povrchu obsahuje alfa-glýkosidicky kovalentně vázané sacharidy nebo jejich deriváty vybrané ze skupiny monosacharidů, oligosacharidů, deoxycukrů a aminocukrů, má sférický tvar s velikostí částic 0,02 až 2,00 mm a v prostředí vody vykazuje porezitu až 90 procent.
2. Způsob výroby celulosového nosiče pro separaci biologicky aktivních látek podle bodu 1 vyznačený tím, že se sférická celulosa promyje bezvodým organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, promíchává se
VYNALEZU s roztokem bezvodého cukru o koncentraci 0,5 až 5 % hmotnostních v témže rozpouštědle za přítomnosti kyselého katalysáto. ru při teplotě 15 až 70 °C po dobu 1 až 20 hodin, načež se .promyje vodou o teplotě +4 až -f-10°C a fosfátovým pufrem pH 7.
3. Způsob výroby podle bodu 2, vyznačený tím, že jako bezvodé rozpouštědlo se použije dioxan, dimethylsulfoxid, dimethylformamid.
4. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že jako kyselý katalysátor se používá fluorid boritý, chlorovodík nebo jejich směs.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS262479A CS203767B1 (cs) | 1979-04-17 | 1979-04-17 | Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS262479A CS203767B1 (cs) | 1979-04-17 | 1979-04-17 | Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS203767B1 true CS203767B1 (cs) | 1981-03-31 |
Family
ID=5363896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS262479A CS203767B1 (cs) | 1979-04-17 | 1979-04-17 | Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS203767B1 (cs) |
-
1979
- 1979-04-17 CS CS262479A patent/CS203767B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barker et al. | Agarose derivatives of uridine diphosphate and N-acetylglucosamine for the purification of a galactosyltransferase | |
| US4269605A (en) | Method and kit for separation of glycoproteins | |
| El Rassi | Recent progress in reversed-phase and hydrophobic interaction chromatography of carbohydrate species | |
| Bedair et al. | Affinity chromatography with monolithic capillary columns: II. Polymethacrylate monoliths with immobilized lectins for the separation of glycoconjugates by nano-liquid affinity chromatography | |
| US3959251A (en) | Stabilized agar product and method for its stabilization | |
| Monzo et al. | Lectin-immobilization strategies for affinity purification and separation of glycoconjugates | |
| Lloyd | The preparation of two insoluble forms of the phytohemagglutinin, concanavalin A, and their interactions with polysaccharides and glycoproteins | |
| Pazur | Affinity chromatography of macromolecular substances on adsorbents bearing carbohydrate ligands | |
| Matsumoto et al. | Derivatization of epoxy-activated agarose with various carbohydrates for the preparation of stable and high-capacity affinity adsorbents: their use for affinity chromatography of carbohydrate-binding proteins | |
| DE2319495A1 (de) | Verfahren zum selektiven und reversiblen binden von biomolekuelen an adsorbenzien | |
| EP0265495A1 (en) | Bonded phase chromatographic supports | |
| GB2024829A (en) | Method and Product for Separation of Glycoproteins | |
| Rao et al. | Lectin-binding domains on laminin | |
| US4406792A (en) | Separation agent | |
| Ben-bassat et al. | Review high performance liquid chromatography of mono-and oligosaccharides | |
| CS203767B1 (cs) | Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek a způsob jeho přípravy | |
| Philip et al. | Rabbit muscle phosphorylase derivatives with oligosaccharides covalently bound to the glycogen storage site | |
| Blake et al. | [7] Resolution of carbohydrates by lectin affinity chromatography | |
| DE2858715C2 (cs) | ||
| Boi et al. | Adsorption of lectins on affinity membranes | |
| Gamzazade et al. | Study of lipoprotein sorption by some sulfoderivatives of chitosan | |
| Kwon et al. | High performance liquid chromatography of mono-and oligosaccharides derivatized with p-aminobenzoic ethyl ester on a c18-bonded silica column | |
| Hořejší et al. | Quantitative inhibition of lectin binding to immobilized carbohydrates | |
| Satish et al. | Sugars as affinity ligands | |
| Richard | ⑥ Sugars as Affinity Ligands |