CS203691B1

CS203691B1 - Process for preparing suspension of attenuate viruse

Info

Publication number: CS203691B1
Application number: CS60679A
Authority: CS
Inventors: Alexej Izbicky; Jindrich Casny
Original assignee: Alexej Izbicky; Jindrich Casny
Priority date: 1979-01-26
Filing date: 1979-01-26
Publication date: 1981-03-31

Description

Vynález se. týká způsobu přípravy suspenze atenuovaného viru v buněčných, například tkáňových kulturách.The invention is. relates to a method of preparing an attenuated virus suspension in cell, for example, tissue cultures.

Podle dosud známého způsobu se produkční buňky vypěstují pří teplotě +36 az +37 °C do většího nebo menšího nárůstu, zpravidla v období 1 až 2 týdnů. Narostlé kultury se naočkují zvolenou. dávkou příslušného virového kmene. Udržovací médium v prvém období po infikování obvykle obsahuje inaktívované telecí sérum, podobně jako médium růstové. Inkubace infikovaných kultur se provádí zásadnč při teplotách nižších než +36 °C až +37 °C, snížená teplota v období reprodukce viru je nutná pro zachování atenuace, tj. oslabení toho kterého kmene. V určitém stupni rozvoje infekčního procesu v kultuře se z buněk do média počíná uvolňovat virus. V této době se kultury opláchnou bezproteinovýra médiem, které pak též slouží jako médium, do kterého se virus vyplavuje. Takto získaná virová suspenze je výchozím materiálem k přípravě očkovací látky, pokud pro nedostatečný obsah aktivního viru nebo i z jiných důvodů nemusí být vyřazena.According to the known method, the production cells are grown at a temperature of +36 to +37 ° C to a greater or lesser increase, usually within a period of 1 to 2 weeks. The grown cultures are inoculated with the chosen one. dose of the respective viral strain. Maintenance medium in the first period after infection usually contains inactivated calf serum, similar to growth medium. Incubation of the infected cultures is essentially carried out at temperatures below +36 ° C to +37 ° C, a reduced temperature during the period of virus reproduction is necessary to maintain attenuation, i.e. weakening of each strain. At some stage in the development of the infectious process in culture, the virus is released from the cells into the medium. At this time, the cultures are rinsed with protein-free medium, which then also serves as the medium into which the virus is washed out. The virus suspension thus obtained is the starting material for the preparation of the vaccine, unless it is to be discarded due to insufficient active virus content or for other reasons.

Při užití dosud známých způsobů přípravy suspenze atenuovaných kmenů je uspokojivé koncentrace aktivního viru dosahováno jen obtížně, zvláště u kmenů více atenuovaných, méně adaptovaných na daný buněčný substrát, nebo při dále snížené reprodukční teplotě. Nízký obsah aktivního viru v získané virové tekutině úměrně limituje množství finálního produktu, jednotlivé zisky nebo eventuálně celé výrobní šarže virové tekutiny o nízkém titru je nutno vyřazovat.Using known methods for the preparation of a suspension of attenuated strains, satisfactory concentrations of active virus are difficult to achieve, especially in strains more attenuated, less adapted to a given cell substrate, or at a further reduced reproductive temperature. The low content of active virus in the obtained viral fluid proportionally limits the amount of final product, individual profits or possibly whole batches of low titer viral fluid should be discarded.

Tím vším se značně zvyšují náklady na přípravu jedné očkovací dávky vakciny.All this greatly increases the cost of preparing a single vaccine dose of vaccine.

Málo uspokojivá reprodukce atenuovaných virových kmenů je pravděpodobně odrazem změny teplotního režimu kultury po infikování, teplotního soku, kdy tkáňová kultura narostlá při +36 °C až +37 °C musí komplex svého buněčného metabolismu adaptovat na teplotu nižší, nutnou k reprodukci atenuovaného viru.Poorly satisfactory reproduction of attenuated viral strains is likely to reflect a change in the temperature regime of the culture after infection, a thermal shock, where the tissue culture grown at +36 ° C to +37 ° C has to adapt its cellular metabolism to the lower temperature required to reproduce the attenuated virus.

Účelem vynálezu je odstranit uvedené nedostatky.The purpose of the invention is to overcome these drawbacks.

Vynález si klade za úkol vytvořit takový způsob přípravy suspenze atenuovaného viru v.bu203691 něčných, například tkáňových kulturách, u kterého by se dosáhlo zvýšení výtěžku‘aktivního viru pro přípravu živé očkovací látky a u kterého by se téměř zcela zabránilo nutnosti vyřazovat virovou suspenzi pro nedostatečný obsah aktivního viru.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide such a method of preparing an attenuated virus suspension in certain cultures, such as tissue cultures, which will increase the yield of an active virus for the preparation of a live vaccine. active virus.

Vytčený úkol se řeší způsobem podle vynálezu, jehož podetata spočívá v tom,, že po celou dobu nárůstu buněk kultury se na kulturu působí stejnou ínkubační teplotou, jako je teplota nutná pro poranožování získávaného atenuovaného viru.This object is achieved by the method according to the invention, the principle of which is to maintain the culture at the same incubation temperature as the temperature required to inject the attenuated virus obtained throughout the growth of the culture cells.

Podle výhodného provedení je teplota, kterou se působí při nárůstu buněk kultury v rozsahu 30,0 až 35,5 °C.According to a preferred embodiment, the temperature that is applied to the growth of the culture cells is in the range of 30.0 to 35.5 ° C.

Výhodné rovněž je, pokud se infikování a pomnožování získávaného atenuovaného viru provádí současně s nárůstem buněk kultury. Je samozřejně možné jej provést í po nárůstu buněk kultury.It is also advantageous if the infection and propagation of the obtained attenuated virus are carried out simultaneously with the growth of the culture cells. It is, of course, possible to do this after the growth of the culture cells.

Hlavní výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že přináší podstatné Snížení nákladů na přípravu jedné očkovací dávky vakciny. Z jedné a téže šarže buněk lze získat suspenzi s mnohonásobně vyšším množstvím viru. Podstatně vyšší obsah aktivního viru v získávané suspenzi umožňuje zvýšení počtu očkovacích dávek připravených z j.edné šarže buněčných kultur, tj. zvýšení objemu produkce bez rozšiřování kapacit pro přípravu virové suspenze. Využití ’ se příznivě projeví také úsporou nákladů na kontrolní testy, lepším využitím prostoru hlubokomrazicích zařízení, možností zjednodušení pracovního postupu, zkrácením výrobního cyklu a snížením rizika manipulační kontaminace kultur.The main advantages of the method according to the invention are that it brings a substantial reduction in the cost of preparing a single vaccine dose of vaccine. From one and the same batch of cells, a suspension with a much higher amount of virus can be obtained. The substantially higher content of active virus in the obtained suspension allows an increase in the number of vaccine doses prepared from one batch of cell cultures, i.e. an increase in the volume of production without extending the capacity for preparing the viral suspension. Utilization will also have a positive effect on the cost of inspection tests, better use of deep-freezer space, simplified workflow, reduced production cycle and reduced risk of contamination of cultures.

Obecně lze tedy uvést, že buňky produkční kultury se v průběhu nárůstu inkubují při stejné teplotě, jako je teplota, užívaná k reprodukci daného atenuovaného kmene viru, tj. v zásadě vždy při teplotě nižší než +36 až +37 °C . Virové inokulum lze na kultivované buňky aplikovat běžným způsobem na více nebo lépe na méně narostlé kultury, sé zvláštní výhodou již na suspenzi pří zakládání kultury. Ve vhodném období, například před nástupem infekčních změn v kultuře, respektive v době dosažení konfluentního nárůstu buněčného ínokula, se kultury opláchnou a dále udržují v bezproteinovém médiu, do něhož sě uvolňuje virus. Některým ze známých způsobů /Mareš et al. , J. Hyg..Epidemiol. Microbiol. Immunol., 10, 94-101, 1966; Dřevo a časný, A0 142 021/ se pak provádějí zisky virově tekutiny, která po kontrolních zkouškách slouží k přípravě konečného produktu.In general, production culture cells are incubated during growth at the same temperature as the temperature used to reproduce the attenuated virus strain, i.e., in principle, at a temperature of less than +36 to +37 ° C. The viral inoculum can be applied to the cultured cells in a conventional manner to more or preferably less grown cultures, with particular advantage already on the suspension for culture establishment. At appropriate times, for example, prior to the onset of infectious changes in culture or at the time of confluent cell growth, the cultures are rinsed and maintained in a protein-free medium into which they release the virus. Some of the known methods / Mares et al. , J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol., 10, 94-101 (1966); Wood and early (A0 142 021) are then used to obtain viral fluid, which, after control tests, is used to prepare the final product.

V dalším jsou uvedeny dva příklady způsobu přípravy suspenze atenuovaných kmenů podle vynálezu.The following are two examples of a process for preparing a suspension of the attenuated strains of the invention.

Přikladl.He did.

. Příprava suspenze atenuovaného kmene AA viru parotitidy ÚSOL v 5. pasáži na primárních kulturách buněk psích ledvin.. Preparation of a suspension of the attenuated strain of AA parotitis virus ÚSOL at passage 5 on primary canine kidney cell cultures.

Zdrojem buněk pro kultury k pomnožování viru je zdravé štěně do stáří Šesti měsíců z kontrolovaného chovu psů druhu beagle. Sterilně odebrané ledviny se zbaví pouzdra, pánviček a kalichů a ze zbylé ledvinné kory se běžným způsobem pomocí trypsinizace připraví suspenze buněk v laktolbuminhydrolyzátovém médiu VEL” /komerční produkt SEVAC III/ s 10 % inaktivovaného telecího séra a .94 mg % NaHCO,., tj . 1,25 ml 7,5% roztoku na 100 tni média, která se v médiu * 7 stejného složení naředí na koncentraci 10 buněk ve 150 ml média.The source of the cells for the virus propagation cultures is a healthy puppy up to six months of age from a beagle breeding dog. Sterile kidneys are removed from the capsule, pan and calyx and the remaining renal cortex is prepared by trypsinization in a conventional manner by cell suspension in VEL lactolbumin hydrolyzate medium / commercial product SEVAC III / with 10% inactivated calf serum and .94 mg% NaHCO 3, i.e. . 1.25 ml of 7.5% solution per 100 µl of medium, which is diluted to 10 cells in 150 ml of medium in the same composition.

Tato suspenze se po 150 ml rozplní do požadovaného množství lahvi podle Rouxe obsahu 1 200 ml pro kontrolní kultury, Do zbývájící suspenze, určené k vlastní produkci virové tekutiny, se přidá inokulum atenuovaného kmene ΛΑ viru parotitidy ÚSOL v dávce nutné pro dosažení . -3 —2 multiplicity inokula 10 až 10 num TKID^q na jednu buňku. Po dostatečném promícháni se směs distribuuje do kultivačních lahví podle Rouxe v dávce po 150 ml. Kontrolní i infikované kultivační lahve se pak po zazátkování uloží v horizontální poloze a inkubují se při teplotě + 34 °G do nárůstu konfluentní kultury, tj, zpravidla 6^-dní . Pak se kultury i vnitřní povrch kultivační nádoby opláchnou bezproteínovým médiem, Parkerovým médiem 199 s 117 mg % NaHCO^, které pak slouží jako udržovací.This suspension is dispensed into 150 ml of the required culture in control cultures after 150 ml. Into the remaining suspension, for the actual production of the viral fluid, is added the inoculum of the attenuated parotitis virus strain SΑ ÚSOL at the dose required to achieve this. -3-2 inoculum multiplicities of 10 to 10 num TKID ^ q per cell. After sufficient mixing, the mixture is distributed into Roux culture bottles in 150 ml portions. Control and infected culture flasks are then placed in a horizontal position after stoppering and incubated at + 34 ° C until growth of confluent culture, i.e. generally 6 days. Then the cultures and the inner surface of the culture vessel are rinsed with protein-free medium, Parker medium 199 with 117 mg% NaHCO 3, which then serves as maintenance.

Při nástupu morfologických změn v kulturách vyvolaných počínajícím infekčním procesem se počítá provádění zisků virové suspenze známým způsobem, např, podle čs. autorského osvědčení č. 142 021.On the onset of morphological changes in cultures induced by the incipient infectious process, the recovery of the viral suspension is calculated in a known manner, e.g. Certificate No. 142 021.

Získaná virová tekutina se dále'zpracovává postupem obvyklým při přípravě vakciny.The viral fluid obtained is further processed according to the usual procedure for the preparation of a vaccine.

V konkrétním případě bylo způsobem podle vynálezu v průběhu 21 dní po infikování provedeno celkem gest zisků o průměrném títťu 5,8 log TKID^ /ml, min. ₌ 5,2, max. = 6,3, zatímco při dosud běžném způsobu, provedeném souběžně, ani jeden ze Šestí zisků, průměrný títr 4,1 log TKlD^₀/ml, neposkytl virovou suspenzi o titru 5,0 log ΤΚΙβ^θ/ιηΙ. Celkový zisk aktivního viru k 21. dni po infikování byl·způsob,em podle vynálezu 65krát vyšší než při postupu dosud známém. ...In a particular case, a total of gain gestures with a mean net of 5.8 log TKID / ml, min. ₌ 5.2, max = 6.3, while in a conventional method performed concurrently, none of the six gains, an average titer of 4.1 log TKlD ^ ₀ / ml, yielded a virus suspension of 5.0 log ΤΚΙβ ^ θ / ιηΙ. The total yield of active virus at day 21 post-infection was a method according to the invention 65 times higher than the method previously known. ...

Příklad 2Example 2

Příprava suspenze atenuovaného kmene BB viru parotitidy ÚSOL v 5. pasáží na primárních kulturách buněk psích ledvin.Preparation of an attenuated strain of BB parotitis virus ÚSOL in passage 5 on primary canine kidney cell cultures.

Postup shodný s příkladem 1, k infikování však užito stěnovaného kmene BB viru parotitidy ÚSOL v multiplicitě ínokula 10 ⁰ nura ΤΚΙϋ^θ na jednu buňku a inkubační teploty +32 °C.Procedure identical to Example 1 but used to infect stěnovaného BB strain of mumps virus at a multiplicity of inoculant SOL 10 ⁰ Nur ΤΚΙϋ θ ^ per cell and incubation temperature of 32 ° C.

V konkrétním případe byly v průběhu s1edovanýchg14 dni po infikování titry získávané virové tekutiny-vyšší než 5 log ΤΚΙΟ^θ/ml, průměrná hodnota 6,8 log, zatímco u dosud známého, postupu jen cca 1/3 zisků virové tekutiny dosáhla hodnoty 5 log ΤΚΧϋ^θ/ιηΙ, průměrná -hodnota 4,7 log. Novým způsobem bylo dosaženo cca 50násobne vyššího celkového zisku aktivního víru.In a particular case, during the monitored days 14 days after infection, the viral fluid titers were greater than 5 log θ / θ / ml, an average value of 6.8 logs, whereas in the hitherto known procedure only about 1/3 of the viral fluid gains reached 5 logs. ΤΚΧϋ ^ θ / ιηΙ, average -value 4.7 log. In a new way, the total profits of the active vortex were approximately 50 times higher.

Vynález se pochopitelně neomezuje na uvedené příkladyale lze jej uplatnit při přípravě různých virových očkovacích látek obsahujících aktivní atenuovaný kmen viru.Obviously, the invention is not limited to these examples, but can be applied to the preparation of various viral vaccines containing an active attenuated virus strain.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method of preparing an attenuated virus suspension in cell, for example, tissue cultures, by infecting and multiplying the obtained attenuated virus at the same time as the growth of the culture cells, or up to half the growth of the culture cells. At 0 to 35.5 ° C at the same incubation temperature as the null temperature for propagation of the attenuated virus obtained.