CS201337B1 - Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k - Google Patents
Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k Download PDFInfo
- Publication number
- CS201337B1 CS201337B1 CS604278A CS604278A CS201337B1 CS 201337 B1 CS201337 B1 CS 201337B1 CS 604278 A CS604278 A CS 604278A CS 604278 A CS604278 A CS 604278A CS 201337 B1 CS201337 B1 CS 201337B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- radioactive
- adenosine
- adenine
- guanine
- ribonucleoside
- Prior art date
Links
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 67
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 67
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 title claims description 64
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 title claims description 50
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 49
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 title claims description 48
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 36
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 33
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=NC=N[C]21 IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 57
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 30
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 29
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 29
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 19
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 claims description 17
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 claims description 17
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 13
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 7
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 23
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 108010076278 Adenosine kinase Proteins 0.000 description 17
- 102100032534 Adenosine kinase Human genes 0.000 description 17
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 14
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 5-(3-bromophenyl)-7-(6-morpholin-4-ylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-amine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=12C(N)=NC=NC2=NC(C=2C=NC(=CC=2)N2CCOCC2)=CC=1C1=CC=CC(Br)=C1 OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 9
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 108010091901 purine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 7
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 7
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 7
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N azanium;hydroxide;hydrate Chemical compound N.O.O ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000491 Corchorus aestuans Species 0.000 description 2
- 235000011777 Corchorus aestuans Nutrition 0.000 description 2
- 235000010862 Corchorus capsularis Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- 101100202428 Neopyropia yezoensis atps gene Proteins 0.000 description 2
- 108010044790 Nucleoside-Phosphate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000005811 Nucleoside-phosphate kinase Human genes 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CCCCO MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JDWFOTLBRARKLZ-UHFFFAOYSA-N azanium;ethanol;hydroxide;hydrate Chemical compound [NH4+].O.[OH-].CCO JDWFOTLBRARKLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- JWDLEVZYUTZUBA-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;phosphono dihydrogen phosphate Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(O)=O.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 JWDLEVZYUTZUBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003936 Diphosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000330 Diphosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L IMP(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710180958 Putative aminoacrylate hydrolase RutD Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- KJCBCYNGQDISNK-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CC(O)=O.CCCCO KJCBCYNGQDISNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 108010036383 guanosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N oic acid Natural products C1CC2C3CC=C4CC(OC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)CC(O)C4(C)C3CCC2(C)C1C(C)C(O)CC(C)=C(C)C(=O)OC1OC(COC(C)=O)C(O)C(O)C1OC(C(C1O)O)OC(COC(C)=O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Předmětem vynálezu je způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-monofosfátů, ribonukleosid-5-difosfátů a ribonukleosid-5-trifosfátů adeninu a guaninu, značenýoh v molekule specificky nebo nespecificky radioizotopem X4C nebo ’Η, založený na fosforibosylaoi radioaktivního adeninu a guaninu, resp. fosforylaci radioaktivního adenosinu za katalýzy polyenzymovým preparátem izolovaným z kvasinek Saooharomyoes cerevisiae v přítomnosti fosforibosylovýoh, resp. fosfátových skupin a hořečnatýoh iontů.The present invention provides a method for the enzymatic synthesis of radioactive ribonucleoside-5-monophosphates, ribonucleoside-5-diphosphates and ribonucleoside-5-triphosphates of adenine and guanine, labeled in the molecule specifically or nonspecifically with radioisotope X4 C or Η, based on phosphoribosylao and . phosphorylation of radioactive adenosine under catalysis with a polyenzyme preparation isolated from the yeast of Saooharomyoes cerevisiae in the presence of phosphoribosyl, respectively. phosphate groups and magnesium ions.
Způsob enzymové syntézy radioaktivníoh ribonukleosid-5-fosfátů podle vynálezu využívá katalytických vlastností enzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae, získaných specifickým postupem izolace enzymového preparátu z bezbuněčných extraktů kvasinek, jak uvádíme dále. Enzymový preparát je souborem šesti enzymů, a to adenosinkinasy, adeninfosforibosyltransferasy, hypoxanthinfosforibosyltransferasy, ribosofosfátpyrofosfokinasy, nukleosidmonofosfátkinasy a núkleosiddifosfátkinasy, které buď jednotlivě nebo ve vzájemné kombinaci katalyzují syntézu shora uvedených radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů. Řízeným způsobem lze takto aplikací zmíněného enzymového preparátu připravit v jediné reakci radioaktivní ribonukleosid-5-fosfáty adeninu a guaninu z jejich radioaktivních bází nebo nukleosidů o požadovaném stupni fosforylace, včetněThe enzyme synthesis method of the radioactive ribonucleoside 5-phosphates of the invention utilizes the catalytic properties of the yeast enzyme preparation of Saccharomyces cerevisiae obtained by a specific procedure for isolating the enzyme preparation from the cell-free yeast extracts as described below. The enzyme preparation is a collection of six enzymes, namely, adenosine kinases, adenine phosphoribosyltransferases, hypoxanthine phosphoribosyltransferases, ribosophosphate pyrophosphokinases, nucleoside monophosphate kinases, and nucleoside monophosphate kinases, either individually or in combination with each of the above-mentioned ribosulfate catalyses to catalyze the synthesis of the ribosomes. In a controlled manner, by applying said enzyme preparation, radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine can be prepared in a single reaction from their radioactive bases or nucleosides with the desired degree of phosphorylation, including
201 337 přímé enzymové syntézy radioaktivního adenosin-5-trifosfátu z radioaktivního adeninu. Pro tyto specifické vlastnosti, které uvedený enzymový preparát charakterizují, uvádíme ho dále jako polyenzymový preparát z kvasinek Saccharomyces oerevisiae. Široká substrátová speoifioita polyenzymového preparátu kromě toho dovoluje aplikovat různé donory fosfátových a fosforibosylových skupin, což, dále rozšiřuje počet možných reakčních kombinaoí pro enzymovou syntézu radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu.201 337 direct enzyme synthesis of radioactive adenosine-5-triphosphate from radioactive adenine. For these specific properties that characterize the enzyme preparation, it is referred to below as a yeast polyenzyme preparation of Saccharomyces oerevisiae. In addition, the wide substrate speoifioity of the polyenzyme preparation allows the application of various donors of phosphate and phosphoribosyl groups, which further increases the number of possible reaction combinations for the enzymatic synthesis of the radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine.
Při enzymové syntéze radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů podle vynálezu se neprojevuje vliv degradativníoh enzymů; v průběhu reakcí nedochází k poklesu molové radioaktivity produkovaných ribonukleosid-5-fosfátů a stupeň konverze obou purinovýoh bází, resp» adenosinu na ribonukleosid-5-fosfáty zpravidla převyšuje 90 %,The enzymatic synthesis of the radioactive ribonucleoside 5-phosphates according to the invention does not show the effect of degradative enzymes; there is no decrease in the molar radioactivity of the ribonucleoside-5-phosphates produced during the reactions, and the degree of conversion of both purine bases or adenosine to ribonucleoside-5-phosphates generally exceeds 90%,
Aplikace radioaktivních 5-ribonukleotidů, včetně ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených radioizotopem nebo ^H, má pro řešení problémů základního výzkumu mnoha vědních oborů zásadní význam a je dnes již rozsáhlá. Zejména adenosin-5-trifosfát jako nej důležitější součást metaboliokého poolu živé buňky a přímý prekursor pro biosyntézu ribonukleových kyselin, je ve formě značené vhodným radioizotopem látkou vysooe atraktivní.The application of radioactive 5-ribonucleotides, including the radioisotope-labeled or 1 H-labeled ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine, is essential for solving basic research problems in many fields of science and is now extensive. In particular, adenosine-5-triphosphate, as the most important component of the living cell metaboliocal pool and a direct precursor for ribonucleic acid biosynthesis, is highly attractive in a radiolabelled form.
Stávající způsoby přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu vycházejí z metodických možností organické syntézy a biosyntézy. Nejméně vhodné jsou postupy organické syntézy, a to pro nutnost specifického chránění funkčních skupin výchozích látek, velký počet reakčních stupňů a požadavek vysoké stereospeoificity. Prakticky nepoužitelné jsou tyto postupy pro přípravu radioaktivních preparátů o vysoké molové radioaktivitě.Existing methods for preparing radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine are based on the methodological possibilities of organic synthesis and biosynthesis. Organic synthesis procedures are least suitable because of the need for specific protection of the functional groups of the starting materials, the large number of reaction steps and the requirement for high stereospeoificity. These processes are practically unusable for the preparation of radioactive preparations of high molar radioactivity.
Mnohem větší možnosti pro přípravu radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu poskytuje naopak celá metodická oblast biochemických syntéz. Příkladem může být izolace radioaktivních rihnukleosid-5-monofosfátů adeninu a guaninu, nespecificky značených v molekule radioizotopem ^C, z nukleových kyselin jednobuněčných zelených nebo modrozelených řas pěstovaných autotrofně v atmosféře radioaktivního kysličníku uhličitého. Uvedený příklad je typem charakteristickým pro nespecifický způsob biosyntézy radioaktivních 5-ribonukleotidů; radioaktivní ribonukleosid-5Ámonofosfáty adeninu a guaninu se zde získají jako součást komplexu dalších základních radioaktivních nukleosid-5-monofosfátů ribonukleové i deoxyribonukleové řady. Specifické způsoby biosyntézy 5-ribonukleotidů se vyznačují naopak tím, že vedou zpravidla k tvorbě jediného reakčního produktu; metodicky spadají do oblasti enzymových syntéz a provádějí se téměř výlučně pomooí enzymů tak zvaných zachraňujících mechanizmů (salvage mechanismus), jimiž jsou některé biologické systémy vybaveny.On the contrary, the whole methodological area of biochemical synthesis provides much greater possibilities for the preparation of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine. An example would be the isolation of radioactive rihnucleoside-5-monophosphates of adenine and guanine, not specifically labeled in the molecule with a radioisotope @ 4 C, from nucleic acids of unicellular green or blue-green algae grown autotrophically in a radioactive carbon dioxide atmosphere. This example is a type characteristic of a non-specific method of biosynthesis of radioactive 5-ribonucleotides; The radioactive ribonucleoside-5A monophosphates of adenine and guanine are obtained here as part of a complex of other basic radioactive nucleoside-5-monophosphates of the ribonucleic and deoxyribonucleic series. Specific methods of biosynthesis of 5-ribonucleotides, on the other hand, are characterized in that they generally result in the formation of a single reaction product; they are methodically involved in the field of enzyme synthesis and are performed almost exclusively by the enzymes of the so-called salvage mechanisms with which some biological systems are equipped.
Pokud jde o možnosti specifické enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, připadá především v úvahu využití katalytických vlastností adeninfosforibosyltransferasy pE.C. 2.4.2.7., AMP: pyrofosfátfosforibosyltrans201 33 ferasa^jresp. hypoxanthinfosforibosyltransferasy £e.C. 2.4.2.8., IMP: pyrofosfátfosforibosyltransferasaj, případně adenosinkinasy £e.C. 2.7.1.20. ATP: adenosin-5-fosfotrans ferasaj. Uvedené enzymy katalyzují enzymovou syntézu ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu podle následujících reakcí:As regards the possibilities of specific enzymatic synthesis of the radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine, the use of the catalytic properties of the adenine phosphoribosyltransferase pE.C. 2.4.2.7., AMP: pyrophosphate phosphoribosyltrans201 33 ferase ^ jresp. hypoxanthine phosphoribosyltransferases £ e.C. 2.4.2.8., IMP: pyrophosphate phosphoribosyltransferase or adenosine kinases £ e.C. 2.7.1.20. ATP: adenosine-5-phosphotransferase. Said enzymes catalyze the enzymatic synthesis of ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine according to the following reactions:
E.C. 2.4.2.7. ,E.C. 2.4.2.7. ,
a) adenin + 5-fosfo-/^-D-ribosa-l-difosfát =^=====^ adenosin-5-monofosfát + + pyrofosfát,a) adenine + 5-phospho- [beta] -D-ribose-1-diphosphate = adenosine-5-monophosphate + pyrophosphate;
E.C. 2.4.2.8. *E.C. 2.4.2.8. *
b) guanin + 5-fosfo-/»-D-ribosa-l-difosfát s^=====5s guanosin-5-monofosfát + + pyrofosfát, t E.C. 2.7.1.20.b) The guanine + 5-phospho - / »- D-ribose-l-diphosphate s ^ ===== 5s guanosine-5-monophosphate + pyrophosphate, t, EC 2.7.1.20.
o) adenosin + adenosin-5-trifosfát ag— --·—--- >= adenosin-5-monofosfát + + adenosin-5-difosfát.o) adenosine + adenosine 5-triphosphate and adenosine 5-monophosphate + adenosine 5-diphosphate.
Za prvou informaci o existenci purinové fosforibosyltransferasy lze považovat zjištění, že v přítomnosti enzymových frakcí z holubích jater, adenosin-5-trifosfátu a riboso-5-fosfátu se z hypoxanthinu syntetizuje inosin-5-monofosfát, aniž se tvoří inosin jako reakční meziprodukt (Williams, W. J. a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem.The first information on the existence of purine phosphoribosyltransferase is that in the presence of enzyme fractions from pigeon liver, adenosine 5-triphosphate and riboso-5 phosphate, inosine 5-monophosphate is synthesized from hypoxanthine without forming inosine as a reaction intermediate (Williams) , WJ and Buchanan, JM, J. Biol Chem.
203. 583 /1953/).203, 583 (1953).
V dalších letech byly enzymové preparáty obsahující purinové fosforibosyltransferasy izolovány z řady normálních i maligních živočišných tkání a dále z bakterií a kvasinek (Korriberg, A., Lieberman, I. a Simms, E., <J. Biol. Chem. 215. 417 /1955/} Korn,In subsequent years, enzyme preparations containing purine phosphoribosyltransferases were isolated from a number of normal and malignant animal tissues, as well as from bacteria and yeast (Korriberg, A., Lieberman, I. and Simms, E., <J. Biol. Chem. 215. 417) 1955} Korn,
E. D., Remy, C. N., Wasilejko, Η. N, a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem. 217. 875 /1955/} Flaks, J. G., Erwin, M. J. a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem. 228. 201 /1957/} lukens,E. D., Remy, C. N., Wasilejko,,. N, and Buchanan, J. M., J. Biol. Chem. 217. 875 (1955)} Flaks, J.G., Erwin, M.J., and Buchanan, J.M., J. Biol. Chem. 228. 201 (1957)},
I. N. a Herrington, K. A., Biochim, Biophys. Acta 24. 432 /1957/} Kalle, G, P. a Gots,I. N. and Herrington, K.A., Biochim, Biophys. Acta 24, 432 (1957)} Kalle, G, P. and Gots,
J. S., Biochim. Biophys. Acta 53. 166 /1961/} Kalle, G. P. a Gots, J. S., Science 142. 680 /1963/} Hoři, H. a Henderson, J. F., J. Boil. Chem. 241. 1406 /1966/} Henderson,J. S., Biochim. Biophys. Acta 53, 166 (1961)} Kalle, G. P. and Gots, J. S., Science 142. 680 (1963)} Hori, H. and Henderson, J. F., J. Boil. Chem. 241. 1406 (1966)} Henderson,
J. F., Brox, 1. W., Kelley, W. N., Rosenbloom, F. M. a Seegmiller, J. E., J. Biol.J.F., Brox, W.W., Kelley, W.N., Rosenbloom, F.M. and Seegmiller, J.E., J. Biol.
Chem. 243. 2514 /1968/} Miller, R. L. a Bieber, A. 1., Biochemistry 2, 1420 /1968/} Berlin, R. D., Arch. Biochim. Biophys. 134. 120 /1969/} Hochstadt-Ozer, J., Fed. Proceed. 29. 342 /1970/} Srivastava, S. K. a Beutler, E., Arch. Biochim. Biophys. 142. 426 /1971/). Purinové fosforibosyltransferasy, přítomné v enzymových preparátech, byly blíže charakterizovány prozkoumáním fyzikálních a chemických vlastností, studiem kinetických vlastností a objasněním role v metabolismu nukleovýoh kyselin} souběžně byly ověřovány i rozmanité způsoby purifikace enzymů z tkáňových homogenátů.Chem. 243. 2514 (1968)} Miller, R. L. and Bieber, A. 1, Biochemistry 2, 1420 (1968)} Berlin, R. D., Arch. Biochim. Biophys. 134. 120 (1969)} Hochstadt-Ozer, J., Fed. Proceed. 29, 342 (1970)} Srivastava, S.K. and Beutler, E., Arch. Biochim. Biophys. 142, 426 (1971). Purine phosphoribosyltransferases present in enzyme preparations have been further characterized by investigating physical and chemical properties, studying kinetic properties, and elucidating the role in nucleic acid metabolism.} In parallel, a variety of methods for purifying enzymes from tissue homogenates have been verified.
Za nejzávažnější zjištění, která vzešla z těchto studií, lze považovat dále uvedené skutečnosti:The following are the most serious findings of these studies:
1) Aktivním meziproduktem v enzymových reakcích, katalyzovaných purinovými fosforibosyltransferasami je 5-fosfo-^-D-ribosa-l-difosfát, který funguje jako donor fosforibosylových skupin v reakci:1) The active intermediate in enzyme reactions catalyzed by purine phosphoribosyltransferases is 5-phospho-4-D-ribose-1-diphosphate, which acts as a donor of phosphoribosyl groups in the reaction:
Purin + 5-fosfo-<fr -D-ribosa-l-difosfát -7 ==^/purin/nukleosid-5-monofo3fát + + pyrofosfát.Purine + 5-phospho-fr-D-ribose-1-diphosphate-7 (purine) nucleoside-5-monophosphate + pyrophosphate.
201 337201 337
2) Existují dva základní typy purinových fosforibosyltransferas, a to adeninfosíoribosyl transferasa £e.C. 2.4.2.7.J, která je aktivní vůči adeninu a některým jeho derivátům, ale nikoli vůči guaninu a hypoxanthinu, a dále hypoxanthinfosforibosyltransferasa [e.C. 2.4.2,8.^, aktivní naopak vůči hypoxanthinu, guaninu, případně i xanthinu, avšak zcela neaktivní vůči adeninu a jeho derivátům. Určitá nejasnost, zda totiž obecně existuje v biologických systémech jediná fosforibosyltransferasa, aktivní vůči guaninu a hypoxanthinu, či zda jde o dva specifické enzymy, není však dosud uspokojivě zodpovězena.2) There are two basic types of purine phosphoribosyltransferases, namely adenine phosphoribosyl transferase £ e.C. 2.4.2.7.J which is active against adenine and some of its derivatives but not against guanine and hypoxanthine, and hypoxanthine phosphoribosyltransferase [e.C. 2.4.2.8., Active against hypoxanthine, guanine and possibly xanthine, but completely inactive against adenine and its derivatives. Indeed, some uncertainty as to whether there is generally a single phosphoribosyltransferase active in guanine and hypoxanthine active in biological systems or whether these are two specific enzymes is not yet satisfactorily answered.
3) Purinové fosforibosyltransferasy patří k nestabilním thermolabilním enzymům. Míra jejich stability je závislá, mimo jiné, na stupni jejioh purifikace, resp. na způsobu jejich izolace z tkáňových homogenátů. Udává se například ztráta 25 až 35 % enzymové aktivity adeninfosforibosyltransferasy izolované z kvasinek, a to během týdnů skladování enzymového preparátu při -15 °C, ale také ztráta 33 % enzymové aktivity v enzymovém preparátu izolovaném z Ehrlichova asoitiokého tumoru, a to během 3 dní skladování při -20 °C.3) Purine phosphoribosyltransferases belong to unstable thermolabile enzymes. Their degree of stability is dependent, inter alia, on the degree of their purification, respectively. their isolation from tissue homogenates. For example, a loss of 25-35% of the enzyme activity of yeast-isolated adenine phosphoribosyltransferase is reported during weeks of storage of the enzyme preparation at -15 ° C, but also a loss of 33% of enzyme activity in the enzyme preparation isolated from Ehrlich's asiitiative tumor. at -20 ° C.
4) Katalytická účinnost obou enzymů je obecně podmíněna přítomností dvojmocných kationtů, zpravidla Mg2+-iontů, ale rovněž Mn2+- nebo Ca2+-iontů.4) The catalytic activity of both enzymes is generally conditioned by the presence of divalent cations, usually Mg 2+ ions, but also Mn 2+ or Ca 2+ ions.
Purifikaoí do vysokého stupně (1000 až 1200 násobnou) byly adeninfosforibosyltransferasa i hypoxanthinfosforibosyltransferasa připraveny z kvasinek Sohizosaccharomyces pombe ve formě homogenních enzymů o definované molekulové hmotnosti (Nagy,To a high degree of purification (1000 to 1200 fold), both adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine phosphoribosyltransferase were prepared from Sohizosaccharomyces pombe yeast in the form of homogeneous enzymes of defined molecular weight (Nagy,
M. a Ribot, A. M., Eur. J. Biochem. 77. 77 /1977/). Takto vysoce puriíikované enzymy jsou ovšem extrémně termolabilní a rychle ztrácejí enzymovou aktivitu. Tomu se dá zčásti zabránit jejich přechováváním při -20 °C v prostředí 5-fosfo-/z-D-riboso-l-difosfátu a chloridu hořečnateho o vysoké koncentraci; za těchto podmínek si enzymy zachovávají stabilitu přibližně 4 týdny. Termolabilitu adeninfosforibosyltransferasy lze blokovat již v průběhu izolaoe enzymu z kvasinek, a to nasycením tkáňových homogenátů kyselinou adenylovou, tedy vlastním produktem reakce katalyzované zmíněným enzymem.M. and Ribot, A. M., Eur. J. Biochem. 77, 77 (1977)]. However, such highly purified enzymes are extremely thermolabile and rapidly lose enzyme activity. This can be partially prevented by storing them at -20 ° C in a medium of 5-phospho- / z-D-riboso-1-diphosphate and magnesium chloride at a high concentration; under these conditions, the enzymes retain stability for approximately 4 weeks. The thermolability of adenine phosphoribosyltransferase can be blocked already during the isolation of the enzyme from the yeast by saturating the tissue homogenates with adenyl acid, the product of the reaction catalyzed by the enzyme.
Posforylaoe purinových i pyrimidinových nukleosidů na nukleosid-S^fosfáty v přítomnosti adenosin-5-trifosfátu probíhá podle reakcetThe phosphorylation of both purine and pyrimidine nucleosides to nucleoside-S-phosphates in the presence of adenosine 5-triphosphate proceeds according to
Nukleosid + adenosin-S^trifosfát '^7-· =— nukleosid-S^monofosfát + + adenosin-5-difosřát a považuje se za alternativní proces k doplnění nukleotidového poolu v živé buňce.The nucleoside + adenosine-S-triphosphate-7-nucleoside-S-monophosphate + + adenosine-5-diphosphate is considered an alternative process to replenish the nucleotide pool in a living cell.
Posforylaoe adenosinu pomocí adenosin-S^trifosfátu v přítomnosti extraktů z kvasinek je dokonce historicky prvou zmínkou o studiu enzymové syntézy nukleotidu (Ostern, P. a Terszakoweč, J., Hoppe - Seylers Z. Physiol. Chem. 250. 155 /1937/)· Později byl enzym, zodpovědný za tuto reakci, identifikován v částečně purifikovaných extraktech z kvasinek, resp. ledvin a jater králíka (Caputto, R., J. Biol. Chem. 189.The adenosine-poshosphorylation of adenosine with S-triphosphate in the presence of yeast extracts is even historically the first reference to the study of enzyme nucleotide synthesis (Ostern, P. and Terszakowec, J., Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 250. 155 (1937)) Later, the enzyme responsible for this reaction was identified in partially purified yeast extracts, respectively. rabbit and kidney liver (Caputto, R., J. Biol. Chem. 189.
801 /1951/; Kornberg, A. a Pricer, W. E. Jr., J. Biol. Chem, 193. 481 /1951/) a defi201 337 nován jako adenosinkinasa £e.C. 2.7.1.20., ATP: Adenosin-5-fosfotransferasaJ. Dalšímu studiu biologické role enzymu a jeho vlastností bránila vysoká nestabilita, která se navíc zvětšovala úměrně s rostoucím stupněm purifikace. Přesto byly nalezeny způsoby izolace enzymu z normálních i maligních živočišných tkání /Schnebli, Η. P., Hill, D. 1. a Bennett, L. L. Jr, J. Biol. Chem. 242/1997 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H. a Hansen, K.,801 (1951); Kornberg, A. and Pricer, W.E. Jr., J. Biol. Chem., 193. 481 (1951)) and defi201337 was termed adenosine kinase £ e.C. 2.7.1.20., ATP: Adenosine-5-phosphotransferase J. Further study of the biological role of the enzyme and its properties was hindered by high instability, which in addition increased in proportion to the increasing degree of purification. However, methods for isolating the enzyme from normal and malignant animal tissues have been found (Schnebli, Η). P., Hill, D. 1. and Bennett, L. L. Jr., J. Biol. Chem. 242/1997 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H., and Hansen, K.,
J. Biol. Chem. 242. 350 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H. a Hansen, K., J. Biol. Chem.J. Biol. Chem. 242. 350 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H., and Hansen, K., J. Biol. Chem.
242. 350 (1967)} Lindberg, B., Biochim. Biophys. Acta 185. 245 (1969)} Divekar, A. Y. a Hakala, Μ. T., Mol. Pharmacol. 2, 663 (1971)} Henderson, P. J., Mikoshiba, A., Chu,242. 350 (1967)} Lindberg, B., Biochim. Biophys. Acta 185. 245 (1969)} Divekar, A.Y. and Hakala, Μ. T., Mol. Pharmacol. 2, 663 (1971)} Henderson, P.J., Mikoshiba, A., Chu,
S. Y. a Caldwell, I. C., J. Biol. Chem. 242, 1972 (1972)/, které dovolily blíže charakterizovat substrátovou specificitu a některé další vlastnosti adenosinkinasy a studovat její kinetické a molekulární vlastnosti. Z pivovarských kvasinek bylo dokonce izolováno několik izoenzymů, vykazujících adenosinkinasovou aktivitu /Leibach, Τ. Κ», Speiss,S. Y. and Caldwell, I. C., J. Biol. Chem. 242, 1972 (1972)], which allowed the substrate specificity and some other properties of adenosine kinase to be further characterized and to study its kinetic and molecular properties. Several isoenzymes exhibiting adenosine kinase activity (Leibach, dokonce) were even isolated from brewer's yeast. »Speiss,
G. I., Neudecker, T. J., Peschke, G., Puchwein, G. a Hartman, G. R., Hoppe-Seyler*s Z. Physiol. Chem. 352. 328 (1971)/· Enzymy byly izolovány ve formě molekulárně homogenních polypeptickýoh řetězců o molekulové hmotnosti kolem 40 000. Enzymy jsou vysoce labilní a jejich enzymovou aktivitu lze jak při skladování, tak v průběhu purifikačního procesu bezpečně uchovat pouze v přítomnosti adenosinu o vysoké koncentraci (zpravidla 5 milimolárního roztoku adenosinu). Jako stabilizátor enzymové aktivity je adenosin specifický a nemůže být nahrazen žádným jiným přirozeně se vyskytujícím nukleosidem. V určitém rozsahu může protektivní účinky adenosinu nahradit dithiothreitol. Odstranění stabilizátorů vede k úplné ztrátě enzymové aktivity vysoce purifikováných kinas. Proces je doprovázen agregací enzymově aktivních jednoduchých polypeptidů v inaktivní makromolekuly o molekulové hmotnosti kolem 400 000.G. I., Neudecker, T. J., Peschke, G., Puchwein, G., and Hartman, G. R., Hoppe-Seyler * with Z. Physiol. Chem. 352. 328 (1971) / · Enzymes have been isolated in the form of molecular homogeneous polypeptide chains with a molecular weight of about 40,000. Enzymes are highly labile and their enzyme activity can be safely stored only in the presence of high adenosine during storage and purification. concentration (typically 5 millimolar adenosine solution). As a stabilizer of enzyme activity, adenosine is specific and cannot be replaced by any other naturally occurring nucleoside. To some extent, the protective effects of adenosine may be replaced by dithiothreitol. Removal of the stabilizers leads to a complete loss of the enzyme activity of the highly purified kinases. The process is accompanied by the aggregation of enzyme-active single polypeptides in an inactive macromolecule with a molecular weight of about 400,000.
Specificita adenosinkinas izolovaných z různých zdrojů a různými purifikačními postupy je shodně vymezena s ohledem na nukleosidový substrát: fosforylaci adenosinu a některých jeho strukturálních analog katalyzují intenzivně, zatímco vůči guanosinu, inosinu a všem pyrimidinovýra ribo- nebo deoxyribonukleosidům jsou zcela inaktivní. 2ÉDeoxyadenosin je fosforylován jen zanedbatelně, a to pouze vysoce purifikovanými preparáty enzymu. Substrátová specificita adenosinkinas vůči donorům fosfátových skupin je podstatně širší} vedle adenosin-5-trifosfátu lze v určitých případech aplikovat rovněž jiné nukleosid-5-trifosfáty, vždy však s výrazně menší účinností.The specificity of adenosine kinases isolated from different sources and different purification procedures is equally defined with respect to the nucleoside substrate: they catalyze the phosphorylation of adenosine and some of its structural analogues intensely, whereas they are completely inactive against guanosine, inosine and all pyrimidine ribo- or deoxyribonucleosides. 2Deoxyadenosine is phosphorylated only negligibly, and only by highly purified enzyme preparations. The substrate specificity of adenosine kinases to phosphate group donors is considerably wider. In addition to adenosine 5-triphosphate, other nucleoside-5-triphosphates may also be applied in some cases, but with significantly less potency.
Katalytický účin adenosinkinasy je obecně podmíněn přítomností dvojmocných kationtú, obvykle Mg - nebo Mn -iontů. Naproti tomu optimální pH enzymových reakcí je individuálně závislé na zdroji a způsobu purifikace adenosinkinasy; v některých případech byla u adenosinkinasy zaznamenána dvě reakční pH optima.The catalytic activity of adenosine kinase is generally determined by the presence of divalent cations, usually Mg- or Mn-ions. In contrast, the optimal pH of the enzyme reactions is individually dependent on the source and method of purifying adenosine kinase; in some cases, two reaction pH optimums were observed with adenosine kinase.
Jestliže není pochyb o existenci adenosinkinasy v živých buňkách, pak existence guanosinkinasy není prokázána, a některé informace v tomto směru je nutno brát jako předběžné.If there is no doubt about the existence of adenosine kinase in living cells, then the existence of guanosine kinase has not been established, and some information in this regard should be taken as preliminary.
Výčet informací o biologických a fyzikálně-chemických vlastnostech adeninfosforibosyltransferasy, hypoxanthinfosforibosyltransferasy a adenosinkinasy, jak je shoraList of information on biological and physicochemical properties of adenine phosphoribosyltransferase, hypoxanthine phosphoribosyltransferase and adenosine kinase as above
201 337 v přehledu uveden, lze shrnout do těchto hlavních závěrů:201 337 in the overview, can be summarized as follows:
1) Přítomnost uvedených enzymů byla prokázána v normálních i maligních živočišných tkáních, v bakteriích a v kvasinkách. Z kvasinek byly enzymy izolovány v molekulárně homogenní formě.1) The presence of these enzymes has been demonstrated in normal and malignant animal tissues, bacteria and yeast. The enzymes were isolated from yeast in molecular homogeneous form.
2) Enzymy katalyzují v přítomnosti donorů fosforibosylovýoh, resp. fosfátovýoh skupin fosforibosylaci adeninu a guaninu, resp. fosforylaoi adenosinu, při čemž reakčními produkty jsou ribonukÍeosid-5-monofosfáty adeninu a guaninu.2) The enzymes catalyze phosphoribosyl and / or phosphoribosyl donors in the presence of a donor. phosphate groups phosphoribosylation of adenine and guanine, respectively. adenosine phosphorylates, the reaction products being ribonucleoside-5-monophosphates of adenine and guanine.
3) Enzymy jsou nestabilní, při čemž míra jejioh nestability závisí především na způsobu izolace z tkání a vzrůstá s počtem purifikačníoh stupňů. Osvědčenými stabilizátory enzymů jsou buď reakční produkty nebo výchozí substráty katalyzovanýoh enzymových reakcí.3) Enzymes are unstable, whereby the degree of their instability depends primarily on the method of tissue isolation and increases with the number of purification steps. Proven enzyme stabilizers are either reaction products or starting substrates catalyzed by enzyme reactions.
Enzymová syntéza radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu o vysoké molové radioaktivitě, značených v molekule radioizotopem resp. ^H, má však své specifické zvláštnosti, které ve shora uvedených studiích se speciálním zaměřením nejsou řešeny, které je však nutno zásadně respektovat při návrhu technologického modelu přípra vy radioaktivních purinových ribonukleotidů v preparativním měřítku. Jde zejména o tato specifika:Enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine with high molar radioactivity, labeled in the molecule with radioisotope and resp. However, it has its specific peculiarities which are not addressed in the above-mentioned specialty studies, but which must be fundamentally respected when designing a technological model of preparation of radioactive purine ribonucleotides on a preparative scale. Specifically, these are:
a) Při izolaci enzymů z tkáňových homogenátů je nezbytné odstranit kvantitativně nukleové kyseliny a zamezit tak jejioh přítomnosti v purifikovaných enzymových preparátech. V opačném případě nelze vyloučit atakování nukleovýoh kyselin nukleasami v průběhu enzymových reakoí, což vede k sekundárnímu vzniku neaktivních, nukleotidů. Tyto neaktivní nukleotidy mohou inhibovat katalytickou účinnost enzymů, v každém případě však snižují molovou radioaktivitu purinových ribonukleotidů značených radioizotopy,a) When isolating enzymes from tissue homogenates, it is necessary to remove nucleic acids quantitatively to prevent their presence in purified enzyme preparations. Otherwise, nucleic acid attack by nucleases during enzymatic reactions cannot be excluded, leading to secondary formation of inactive nucleotides. These inactive nucleotides may inhibit the catalytic activity of enzymes, but in any case reduce the molar radioactivity of radioisotope-labeled purine ribonucleotides,
b) Příprava radioaktivních purinových nukleotidů v technologickém měřítku je realizovatelná za předpokladu, že jsou k dispozici enzymové preparáty, jejiohž katalytická účinnost se zachová minimálně po dobu několika týdnů nebo měsíců skladování. Bylo již shora uvedeno, že dosud publikované postupy přípravy enzymových systémů vedly pouze k vysoce labilním enzymovým preparátům.b) Preparation of radioactive purine nucleotides on a technological scale is feasible provided that enzyme preparations are available, the catalytic activity of which is maintained for at least several weeks or months of storage. It has been mentioned above that previously published processes for the preparation of enzyme systems have resulted only in highly labile enzyme preparations.
o) Blokovat labilitu katalyzujíoíoh enzymů produkty či substráty katalyzovanýoh reakcí, ať již v průběhu purifikaoe nebo skladování enzymových preparátů, není v případě enzymové syntézy radioaktivních purinových nukleotidů možné, protože by docházelo k mnohonásobnému snížení jejioh molové radioaktivity.o) Blocking the lability of enzymes by products or substrates catalysed by the reaction, whether during purification or storage of enzyme preparations, is not possible in the case of enzyme synthesis of radioactive purine nucleotides, as this would result in a multiple reduction in its molar radioactivity.
d) V případě enzymové fosforylaoe adenosinu nelze aplikovat adenosin-5-trifosfát jako všeobecně užívaný donor fosfátovýoh skupin, a to opět z důvodu případného nežádoucího snížení molové radioaktivity produkovaného adenosin-5-monofosfátu.d) In the case of the enzyme phosphorylase of adenosine, adenosine 5-triphosphate cannot be used as a commonly used phosphate group donor, again because of the possible undesirable reduction in the molar radioactivity of the produced adenosine 5-monophosphate.
Kromě těohto čistě radioehemiokých aspektů je při navrhování universálního enzymového způsobu přípravy radioaktivních purinových ribonukleosid-5-fosfátů nutno vzít v úvahu ještě další podstatné okolnosti:In addition to these purely radio-chemical aspects, other essential considerations must be taken into account when designing a universal enzyme process for the preparation of radioactive purine ribonucleoside 5-phosphates:
A) Metody přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu se obecně zaměřují především na získání adenosin-5-trifosfátu a guanosin-5-trifosřátu JakoA) Methods for preparing radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine generally focus primarily on obtaining adenosine-5-triphosphate and guanosine-5-triphosphate as
201 3!201 3!
primárních prekursorů pro studium biosyntézy ribonukleových kyselin a řadu dalšíoh studií. Shora uvedené enzymové reakce využívající katalytických vlastností purinovýoh fosforibosyltransferas a adenosinkinasy však přímou syntézu obou zmíněných radioaktivních nukleotidů z jednoduohých radioaktivních substrátů neumožňují} ve všech případech jsou finálními produkty ribonukleosid-5-monofosfáty adeninu a guaninu. Nalzení způsobu jednoduché přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-trifosfátů adeninu a guaninu enzymovou cestou je proto aktuálním problémem.primary precursors for ribonucleic acid biosynthesis studies and a number of other studies. However, the above enzymatic reactions utilizing the catalytic properties of purine phosphoribosyltransferases and adenosine kinases do not allow direct synthesis of both said radioactive nucleotides from simple radioactive substrates. In all cases, the final products are ribonucleoside-5-monophosphates of adenine and guanine. Finding a method for the simple preparation of radioactive ribonucleoside-5-triphosphates of adenine and guanine by the enzyme route is therefore a topical problem.
Β) V enzymových systémeoh, studujících vlastnosti fosforibosyltransferas adeninu a guaninu, resp. adenosinkinasy, se zpravidla aplikují purifikované enzymy, zoela speoifioké vůči uvedeným substrátům} katalytické vlastnosti dalšíoh přítomných enzymů se obvykle nezkoumají. Tento přístup je pro vypracování obecného modelu enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů jak adeninu, tak guaninu, navíc o libovolně požadovaném stupni fosforylaoe, nevyhovující, Řešení problému spočívá naopak v přípravě enzymového preparátu, obsahujícího veškeré enzymy potřebné k syntéze shora uvedené škály radioaktivních nukleotidů a zbaveného přitom nežádoucích degradativníoh enzymů.Β) In enzyme systems studying properties of adenine and guanine phosphoribosyltransferases, resp. The catalytic properties of the other enzymes present are usually not investigated. This approach is unsatisfactory for the elaboration of a general model of enzymatic synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of both adenine and guanine, in addition to any desired degree of phosphorylaea. The solution to the problem lies in preparation of an enzyme preparation containing all enzymes necessary for synthesis of the above radioactive nucleotide range and free of undesirable degradative enzymes.
Vynález uvádí právě takový způsob enzymové syntézy širokého souboru ribonukleosid-5^fosfátů adeninu a guaninu specificky nebo nespecificky značených v molekule radioizotopem resp. 3H, jehož základem je využití specifických katalytických vlastností polyenzymového preparátu izolovaného nově vypracovaným postupem z kvasinek Saccharomyoes cerevisiae.The invention provides precisely such a method for the enzymatic synthesis of a wide range of adenine and guanine ribonucleoside-5-phosphates specifically or non-specifically labeled in a molecule with a radioisotope and / or an isotope. 3 H, based on utilization of specific catalytic properties of polyenzyme preparation isolated by newly developed procedure from yeast Saccharomyoes cerevisiae.
Princip způsobu enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu podle předmětného vynálezu spočívá ve fosforibosylaoi radioaktivního adeninu a guaninu, resp. fosforylaci adenosinu, případně v kombinaci fosforibosylaoe a fosforylaoe uvedených radioaktivních složek nukleovýoh kyselin, a to katalytickým účinem specifických enzymů přítomných v polyenzymovém preparátu izolovaném z kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Zmíněné enzymové reakce probíhají v přítomnosti donorů fosforibosylových skupin, s výhodou 5-fosfo-oó-D-ribosa-l-difosfátu, dále v přítomnosti donorů fosfátových skupin, s výhodou adenosin-5Átrifosfátu nebo guanosin-5Átrifosfátu, případně v přítomnosti systému regenerujíoího donory fosfátových skupin, s výhodou v přítomnosti kreatin fosfokinasy a kreatinfosfátu. Pro průběh enzymových reakcí je žádoucí přítomnost dvojmocných kationtů s výhodou hořečnatých iontů. Enzymové reakce probíhají v prostředí libovolného vhodného pufru s výhodou Tris-HCl pufru o pH 7,5 až 8,0 a dále při optimální reakčni teplotě, s výhodou při 37 °C.The principle of the method for the enzymatic synthesis of the radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine according to the invention is based on phosphoribosylaos of radioactive adenine and guanine, respectively. phosphorylation of adenosine, optionally in combination with phosphoribosylation and phosphorylation of said radioactive nucleic acid components, by the catalytic action of specific enzymes present in a polyenzyme preparation isolated from yeast Saccharomyces cerevisiae. Said enzymatic reactions take place in the presence of phosphoribosyl group donors, preferably 5-phospho-o-D-ribose-1-diphosphate, further in the presence of phosphate group donors, preferably adenosine-5A triphosphate or guanosine-5A triphosphate, optionally in the presence of a phosphate donor regenerating system groups, preferably in the presence of creatine phosphokinase and creatine phosphate. The presence of divalent cations, preferably magnesium ions, is desirable for the conduct of the enzyme reactions. The enzyme reactions are carried out in an environment of any suitable buffer, preferably Tris-HCl buffer at pH 7.5 to 8.0 and further at an optimum reaction temperature, preferably at 37 ° C.
Polyenzymový preparát z kvasinek Saccharomyces cerevisiae se připravuje dále popsaným způsobem. Čerstvá kultura kvasinek se suspenduje v 0,02 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a vzniklá suspenze se odstředí při 5 000 x g a 0 až 4 °C během 40 minut (pokud to není výslovně uvedeno jinak, tak i všechny další operace se provádějí při 0 až 4 °C a v prostředí 0,02 M Tris-HCl pufru o pH 7,5)·Supernatantní frakce se odstraní a sediment se znovu suspenduje v pufru tak, že 0,8 až 1,0 g vlhké váhyThe yeast poly-enzyme preparation of Saccharomyces cerevisiae is prepared as described below. A fresh yeast culture is suspended in 0.02 M Tris-HCl buffer pH 7.5 and the resulting suspension is centrifuged at 5,000 xg and 0 to 4 ° C for 40 minutes (unless otherwise specifically stated, all other operations are performed). carried out at 0 to 4 ° C and in an environment of 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) · The supernatant fractions are removed and the sediment is resuspended in the buffer so that 0.8 to 1.0 g wet weight
201 337 kvasinek připadá na 10 ml pufru· Suspenze se homogenizuje ultrazvukem (příkon 60 Watt, frekvence 22 kHz) po dobu 2 minut· Homogenát se zoentrifugujo při 25 000 x g během 30 minut a buněčné debrity se odstraní. K supernatantní frakci se postupně přidává 15% vodný roztok streptomycinsulfátu· jímž se totálně vysrážejí buněčné nukleové kyseliny· Po jejioh odstranění odstředěním při 30 000 x g během 20 minut se čirý roztok dvoustupňové saturuje pevným síranem amonným· V prvém stupni se sycením roztoku na 50 % saturace vysrážejí,kontaminující bílkoviny a pigmenty, které se odstraní odstředěním. Ve druhém stupni se sycením roztoku síranem amonným na 85 % a následujícím stáním při 0 až 4 °0 po dobu několika hodin vyloučí sraženina, která se odstředí, rozpustí v pufru, a podrobí gelové filtraci (G-25 /ooarse/). Touto frakoionaoí se získá surový polyenzymový preparát, zbavený síranu amonného a streptomyoinsulfátu, a ten se dále purifikuje ve dvou stupních na DEAE-oelulose. V prvém stupni se polyenzymový preparát adsorbuje na DEAE-oelulose a zbaví se kontaminujíoíoh bílkovin promytím pufrem; promývání se ukončí v okamžiku, kdy eluční roztok vykazuje nulovou absorbanei při 280 nra. Desorpoe polyenzymového preparátu se provede 0,25 M roztokem chloridu sodného v pufru. Ve druhém stupni se roztok polyenzymového preparátu nejprve desetinásobně zředí pufrem, znovu se adsorbuje na DEAE-oelulose a promyje 0,05 M roztokem chloridu sodného v pufru. Desorpoe polyenzymového preparátu se uskuteční 0,175 M roztokem chloridu sodného v pufru. Roztok polyenzymového preparátu se rozdělí na menší podíly, které se skladují při -20 °C.201 337 yeast accounts for 10 ml of buffer · The suspension is homogenized by ultrasound (power input 60 Watt, frequency 22 kHz) for 2 minutes · The homogenate is centrifuged at 25,000 x g for 30 minutes and cell debris is removed. 15% aqueous streptomycin sulphate solution is gradually added to the supernatant fraction · totally precipitating cellular nucleic acids · After removal by centrifugation at 30,000 xg for 20 minutes, the clear two-stage solution is saturated with solid ammonium sulphate · In the first stage, saturating the solution to 50% saturation precipitates contaminating proteins and pigments that are removed by centrifugation. In the second stage, saturation of the solution with ammonium sulfate to 85% followed by standing at 0-4 ° C for several hours precipitates, which is centrifuged, dissolved in buffer, and subjected to gel filtration (G-25 (ooarse)). This fractionation yields a crude polyenzyme preparation, devoid of ammonium sulfate and streptomyelin sulfate, which is further purified in two stages on DEAE-oelulose. In a first step, the polyenzyme preparation is adsorbed onto DEAE-cellulose and freed of contaminated proteins by washing with a buffer; the wash is terminated when the elution solution shows no absorbance at 280 nm. The desorpoe of the polyenzyme preparation is performed with a 0.25 M sodium chloride solution in buffer. In the second step, the solution of the polyenzyme preparation is first diluted 10-fold with buffer, re-adsorbed onto DEAE-oellulose and washed with 0.05 M sodium chloride solution in the buffer. The desorpoe of the polyenzyme preparation is carried out with 0.175 M sodium chloride buffer solution. The polyenzyme preparation solution is divided into smaller portions which are stored at -20 ° C.
V polyenzymovém preparátu, izolovaném shora popsaným způsobem z kvasinek Saocharomyces oerevisiae, byla bezpečně prokázána existence dále uvedených enzymů, jejichž katalytických vlastností bylo buď jednotlivě nebo v jejich vzájemné kombinaoi využito k enzymové syntéze ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených v molekule radioaktivními izotopy ^c, resp. ^HíIn a polyenzyme preparation isolated from Saocharomyces oerevisiae yeast as described above, the existence of the following enzymes has been safely demonstrated, the catalytic properties of which have been used, either individually or in combination with each other, for the enzymatic synthesis of adenine and guanine ribonucleoside 5-phosphates. ^ c, respectively. ^ Hí
1. Adenosinkinasa £e.C. 2.7.1.20., ATP: adenosin-5-fosfotransferasaJ.1. Adenosine kinase £ e.C. 2.7.1.20., ATP: adenosine-5-phosphotransferase.
2* Adeninfosforibosyltransferasa £e,C. 2.4.2.7., AMP: pyrofosfátfosforibosyltransferasaj.2 * Adenine phosphoribosyltransferase, e. 2.4.2.7., AMP: pyrophosphate phosphoribosyltransferase.
3. Hypoxanthinfosforibosyltransferasa £e.C. 2.4.2.8., IMPs pyrofosfátfosforibosyltransferasaj.3. Hypoxanthine phosphoribosyltransferase £ e.C. 2.4.2.8., IMPs pyrophosphate phosphoribosyltransferase.
4. RibosofosfátpyrofosfokinasaJe.C. 2.7.6.I., ATPs D-ribosa-5-fosfátpyrofosfotransferasaj.4. RibosophosphatepyrophosphokinaseJe.C. 2.7.6.I., D-ribose-5-phosphate-pyrophosphotransferase ATPs.
5. Nukleosidmonofosfátkinasa [e.C. 2.7.4.4., ATP: nukleosidmonofosfátfosfotransferasaj.5. Nucleoside monophosphate kinase [e.C. 2.7.4.4., ATP: nucleoside monophosphate phosphotransferase.
6. Rukleosiddifosfátkinasa £e.C. 2.7.4.6., ATPs nukleosiddifosfátfosfotransferasaj.6. Rucleoside diphosphate kinase £ e.C. 2.7.4.6., ATPs nucleoside diphosphate phosphotransferase.
Naproti tomu byly v průběhu purifikaČního prooesu odstraněny z polyenzymového preparátu degradativní enzymy, zejména enzymy ze skupiny nukleotidfosfohydrolas, aminohydrolas a ATP-fosforylas. Degradativní enzymy byly eliminovány buď zoela nebo do té míry, že jejich přítomnost již podstatně neovlivňuje účinnost enzymů katalyzujíoíeh syntézu radioaktivních nukleotidů. Z polyenzymového preparátu byly kromě toho kvantitativně odstraněny nukleové kyseliny, takže se nesnižuje molová radioaktivita vznikajících nukleotidů.In contrast, degradative enzymes, especially nucleotide phosphohydrolase, aminohydrolase and ATP-phosphorylase enzymes, were removed from the polyenzyme preparation during the purification process. Degradative enzymes have been eliminated either by zoela or to the extent that their presence no longer substantially affects the efficacy of enzymes catalysing the synthesis of radioactive nucleotides. In addition, nucleic acids have been quantitatively removed from the polyenzyme preparation so that the molar radioactivity of the resulting nucleotides is not reduced.
201 337201 337
Díky těmto vlastnostem slouží uvedený polyenzymový preparát k produkci širokého souboru radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, a to tím, že katalyzuje reakce adeninu, guaninu, resp. adenosinu s rozličnými donory fosfátových, resp. fosforibosylovýeh skupin. Hlavní možné reakční kombinace uvádíme v tomto přehledu:Due to these properties, the polyenzyme preparation serves to produce a wide range of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine, by catalyzing the reactions of adenine, guanine, resp. adenosine with various phosphate, resp. phosphoribosyl groups. The main possible reaction combinations are listed below:
+ Specificky či nespecificky značeno radioizotopem •'^C nebo 3H + Specific or nonspecific radioisotope • @ 1 C or @ 3 H
Okruh produktů hlavních reakčních kombinací se rozšiřuje o další typy výběrem různě značených radioaktivních substrátů (značené radioizotopem ^C, resp. 3H, značené v molekule specificky či nespecificky, a pokud je výchozím substrátem adenosin, tedy značené buž v bázi nebo v ribosylovém zbytku).Circuit products main reaction combination expands more types to select different labeled radioactive substrates (radiolabelled ^ C resp. 3 H-labeled in a molecule specifically or nonspecifically, and if the starting substrate adenosine, a labeled buz in base or ribosyl moiety) .
K dosažení optimálních přeměn typu purin->- /purin/ribonukleosid-5-monofosfát, katalyzovaných specifickými purinfosforibosyltransferasami, přítomnými v polyenzymovém preparátu z kvasinek, bylo nalezeno vhodné složení komponent výchozí reakční směsi v molárním poměru adenin/guanin/: 5-fosfo-,á-D-ribosa-l-difosfát: t chlorid hořečnatý =1:4: 10, Podstatným snížením koncentrace hořečnatých iontů až na molární poměr báze : hořečnaté ionty = 1 : 1 se sníží i stupeň konverze, zatímco zvýšení koncentrace hořečnatých iontů je bez podstatného vlivu. Extrémní' snížení nebo zvýšení molárního poměru donoru fosforibosylovýeh skupin vůči radioaktivní bázi, například na hodnotu 1 : 1 nebo 10 : 1, vede v každém případě ke snížení produkce radioaktivních ribonukleosid-5-monofosfátů.In order to achieve optimal purine -> - (purine) ribonucleoside-5-monophosphate transformations catalyzed by specific purine phosphoribosyltransferases present in the yeast polyenzyme preparation, a suitable composition of the components of the starting reaction mixture was found in the adenine / guanine / molar ratio: 5-phospho- α-D-ribose-1-diphosphate: t magnesium chloride = 1: 4: 10, By substantially reducing the concentration of magnesium ions to a molar ratio of base: magnesium ions = 1: 1, the degree of conversion is also reduced, significant influence. The extreme reduction or increase in the molar ratio of the donor of phosphoribosyl groups to the radioactive base, for example to 1: 1 or 10: 1, results in any event in a decrease in the production of radioactive ribonucleoside-5-monophosphates.
Stupeň konverze radioaktivního guaninu, resp. adeninu na ribonukleosid-5-monofosfát, lze výrazně ovlivnit množstvím aplikovaného polyenzymového preparátu; optimální množství preparátů izolovaných z různých šarží kvasničných kultur se stanovuje vždy znovu pro každou pokusnou sérii enzymových reakcí.The degree of conversion of radioactive guanine, respectively. adenine to ribonucleoside-5-monophosphate, can be significantly influenced by the amount of polyenzyme preparation applied; the optimum amount of preparations isolated from different lots of yeast cultures is determined again for each test series of enzyme reactions.
Při volbě 0,02 M Tris-HCl pufru jako reakčního prostředí byla nalezena dvě reakční optima, a to při pH 7,5 až 8,0 a při pH 9,0. Optimální teplota reakčního prostředí jeWhen selecting 0.02 M Tris-HCl buffer as the reaction medium, two reaction optimums were found at pH 7.5 to 8.0 and at pH 9.0. The optimum temperature of the reaction medium is
201 337 °C. V závislosti na koncentraci složek reakční směsi, množství polyenzymového prepa rátu a jeho enzymové aktivitě se pokusně určí optimální reakční doba.201.337 ° C. Depending on the concentration of the components of the reaction mixture, the amount of the polyenzyme prep and its enzyme activity, the optimum reaction time is determined experimentally.
Při dodržení shora uvedených optimálních reakčních podmínek se dosahuje až 90 % přeměny radioaktivního adeninu, resp. guaninu na odpovídající ribonukleosid-5-mohofosfáty.Up to the optimum reaction conditions mentioned above, up to 90% of the conversion of radioactive adenine and resp. guanine to the corresponding ribonucleoside-5-mohophosphates.
Skladováním polyenzymového preparátu při -20 °C po dobu 14 týdnů se enzymová akti vita purinových fosforibosyltransferas sníží o 10 &By storing the polyenzyme preparation at -20 ° C for 14 weeks, the enzyme activity of the purine phosphoribosyltransferases is reduced by 10 < -1 >
V alternativě pro přímou přeměnu radioaktivní báze na ribonukleosid-5-trifosfát, zejména pak pro případ přímé konverze radioaktivního adeninu na adenosin-5-trifosfát, se zachovají stejné podmínky jako při enzymové syntéze adenosin-5-monofosfátu. Pouze složení výohozí reakční směsi se doplní o guanosin-5-trifosfát jako donor fosfátovýoh skupin, a to obvykle v molárním poměru adenin : guanosin-5Átrifosfát 1 : 20, a dále o systém kreatinfosfátu a kreatlnfosfokinasy, určený k regeneraci donoru fosfátovýoh skupin. Při dodržení uvedených reakčních podmínek proběhne v optimální době reakce přeměna adeninu na adenosin-5-trifosfát na 90 až 95 %·In the alternative for the direct conversion of the radioactive base to ribonucleoside-5-triphosphate, in particular for the direct conversion of radioactive adenine to adenosine-5-triphosphate, the same conditions as for the enzymatic synthesis of adenosine-5-monophosphate are retained. Only the composition of the reaction mixture is supplemented with guanosine-5-triphosphate as a phosphate donor, usually in a 1: 20 molar ratio of adenine: guanosine-5'-triphosphate, and a system of creatine phosphate and creatine phosphokinase designed to regenerate the phosphate donor. If the reaction conditions are observed, the conversion of adenine to adenosine 5-triphosphate to 90 to 95% is achieved at the optimum reaction time.
Jako dalěí možné varianty enzymové syntézy radioaktivního purinového nukleotidu pomocí polyenzymového preparátu, izolovaného z kvasinek Saooharomyoes oerevisiae, lze výhodně využít katalytických vlastností adenosinkinasy, přítomné v polyenzymovém preparátu, a to pro přeměnu radioaktivního adenosinu na adenosin-5-monofosfát.As a further possible variant of the enzymatic synthesis of radioactive purine nucleotide using a polyenzyme preparation isolated from yeast Saooharomyoes oerevisiae, the catalytic properties of the adenosine kinase present in the polyenzyme preparation can be advantageously used to convert radioactive adenosine to adenosine-5-monophosphate.
Pro tento případ bylo zvoleno složení výchozí reakční směsi v molárním poměru adenosin t chlorid hořečnatý í guanosin-SÁtrifosfát =1:5: 10. Reakce probíhá v prostředí 0,01 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 při teplotě 37 °C. Při shora zvoleném složení reakční směsi a molárním zastoupení jednotlivýoh složek má na průběh reakce výrazný vliv množství aplikovaného polyenzymového preparátu. Určení optimálního množství polyenzymového preparátu i reakční doby se řídí stejnými zásadami jako v předcho zích uvedenýoh případeoh. Při dodržení optimálního reakčního režimu dosahuje stupeň konverze radioaktivního adenosinu na adenosin-5-monofosfát až 90 %.For this case, the composition of the starting reaction mixture was chosen in a molar ratio of adenosine t magnesium chloride or guanosine-S-triphosphate = 1: 5: 10. The reaction was run in 0.01 M Tris-HCl buffer pH 8.0 at 37 ° C. With the above-mentioned composition of the reaction mixture and the molar content of the individual components, the amount of the applied polyenzyme preparation has a significant influence on the course of the reaction. The determination of the optimum amount of the polyenzyme preparation and the reaction time are governed by the same principles as in the foregoing. With an optimum reaction regime, the conversion rate of radioactive adenosine to adenosine 5-monophosphate is up to 90%.
Adenosinkinasa je enzym dostatečně stabilní} při skladování polyenzymového preparátu po dobu 18 týdnů při -20 °C se její enzymová aktivita nemění.Adenosine kinase is an enzyme sufficiently stable when stored for 18 weeks at -20 ° C, the enzyme activity of the polyenzyme preparation remains unchanged.
Při zachování reakčních podmínek, uvedenýoh pro syntézu radioaktivního adenosin-5-monofosfátu z radioaktivního adenosinu, ale po doplnění výchozí reakční směsi o sys tém kreatinfosfátu a kreatlnfosfokinasy, se aktivizují nukleotldkinasy přítomné v póly enzymovém preparátu a dosáhne se přímé přeměny radioaktivního adenosinu na adenosln-5-trifosfát minimálně z 90 %·While maintaining the reaction conditions given for the synthesis of radioactive adenosine-5-monophosphate from radioactive adenosine but after adding the creatine phosphate and creatine phosphokinase system to the starting reaction mixture, the nucleotide kinases present in the poles of the enzyme preparation are activated and direct conversion of radioactive adenosine to adenosine-5 is achieved. - at least 90% triphosphate ·
Radioaktivní ribonukleosid-5Ádifosfáty adeninu nebo guaninu mohou po úpravě reakčních podmínek vznikat jako vedlejší produkty při fosforibosylaci, resp. fosforylaoi adeninu, guaninu nebo adenosinu. Jestliže jsou radioaktivní rlbonukleosid-5-difosfáty adeninu a guaninu jedinými požadovanými produkty, je možné s výhodou postupo11Radioactive ribonucleoside-5A adenine or guanine diphosphates may be formed as byproducts in phosphoribosylation, respectively, after modification of reaction conditions. adenine, guanine or adenosine phosphorylates. If radioactive ronbonucleoside-5-diphosphates of adenine and guanine are the only desired products, it is possible
201 337 vat podle obecné metody přípravy radioaktivních nukleosid-5-difosfátů, kterou jsme popsali dříve (viz čs. patent č. 138399).201 337 according to the general method for the preparation of radioactive nucleoside-5-diphosphates described previously (see U.S. Patent No. 138399).
Izolace radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu z reakčních směsí se provádí po deproteinaci irikubačníoh roztoků chromatografioky. U látek s vysokou molovou radioaktivitou je výhodná papírová chromatografie v některém z těchto rozpouštědlových systémů:The isolation of the radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine from the reaction mixtures is carried out after deproteination of the irrigation solutions by chromatography. For substances with a high molar radioactivity, paper chromatography in any of the following solvent systems is preferred:
a) 1-butanol - aceton - kyselina octová - 5%ní hydroxid amonný - vóáa (9:3:2:2:4)a) 1-butanol - acetone - acetic acid - 5% ammonium hydroxide - water (9: 3: 2: 2: 4)
b) 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 : 5 : 7 : 2)b) 1-butanol - 1-propanol - ammonium hydroxide - water (7: 5: 7: 2)
c) 1-butanol - kyselina ootová - voda (4:1:5)c) 1-butanol - oic acid - water (4: 1: 5)
Shora uvedenými postupy enzymové syntézy se aplikací polyenzymového preparátu izolovaného z kvasinek Saccharomyces cerevisiae a vhodnou volbou donorů fosforibosylových resp. fosfátových skupin připravují z radioaktivního adeninu, guaninu nebo adenosinu odpovídající ribonukleosid-5-fosfáty, a to bez nežádoucího snížení molové radioaktivity a o požadovaném stupni fosforylace. Způsoby přípráVý těchto radioaktivních nukleotidů, značených v molekule radioizotopy ^C, resp. ^H, jsou uvedeny v příkladech, aniž je tím omezena aplikační šíře použitého principu.The enzymatic synthesis procedures described above are applied by applying a polyenzyme preparation isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae and appropriately selecting phosphoribosyl donors, respectively. The phosphate groups prepare from the radioactive adenine, guanine or adenosine the corresponding ribonucleoside-5-phosphates without undesirably reducing the molar radioactivity and the desired degree of phosphorylation. Methods for preparing these radioactive nucleotides labeled in the C-radioisotope molecule, respectively. 1 H, are given in the examples without limiting the application width of the applied principle.
Příklad 1Example 1
Enzymová syntéza [u-^^cJadenosin-S-monofosfátuEnzymatic synthesis of [α] - [beta] -adenosine-S-monophosphate
Směs ^U-^cfjadenosinu (1 yumol,· molová radioaktivita 11 100 MBq.mmol*^), chloridu horečnatého (5 /umol) a guanosin-5-trifosfátu (10 /umol) byla rozpuštěna v 0,6 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 1 hodiny a při 37 °C. Reakční směs byla po termické denaturaci polyenzymového preparátu a jeho odstranění chromatografována preparativně v systému 1-butanol -aceton - kyselina octová - 5%ní hydroxid amonný - voda (9:3:2:2:4)na papíře Whatman o. 3, v sestupném uspořádání, při laboratorní teplotě a po dobu 20 hodin. Konverze adenosinu na [u-^^cJadenosin-S-raonofosfát proběhla na 91,3 %. Vedlejšími produkty reakce byly nezreagdvaný ^U-^cJadenosin a ^U-^cJadenosin-5-difosfát v množství 4,7 % resp. 4,0 % celkové radioaktivity reakční směsi. Qj-^cJAdenosin-5-monofosfát byl z chromatografického papíru eluován destilovanou vodou a jeho radiochemická čistota dále ověřena papírovou chromatografií v dalších rozpouštědlovýoh systémech (1-butanol - kyselina octová - voda /4:1: 5/j 1-butanol -1-propanol - hydroxid amonný - voda /7 : 5 : 7 : 2/; kyselina izolmáselná - hydroxid amonný - voda /66 : 1,5 : 33/), ve kterých byl indetifikován jako radiochemicky čistá látka. Celkově bylo získáno 8,9 MBq Ju-^cJadenosin-5-monofosfátu o molové radioaktivitě 11 lOOMBq.mmol-^, tj. 78 % radioaktivity výchozího |u-^cjadenosinu·A mixture of N, N-adenosine (1 µmol, molar radioactivity 11,100 MBq.mmol *), magnesium chloride (5 µmol) and guanosine 5-triphosphate (10 µmol) was dissolved in 0.6 ml 0.1 M Tris-HCl buffer at pH 8.0 and incubated with 0.4 ml of Saccharomyces cerevisiae yeast polyenzyme preparation for 1 hour at 37 ° C. After thermal denaturation of the polyenzyme preparation and its removal, the reaction mixture was chromatographed preparatively in 1-butanol-acetone-acetic acid-5% ammonium hydroxide-water (9: 3: 2: 2: 4) on Whatman # 3 paper. in descending order, at room temperature and for 20 hours. The conversion of adenosine to [beta] -adenosine-S-raonophosphate was 91.3%. The by-products of the reaction were unreacted UU--adenosine-5-β-adenosine-5-diphosphate in an amount of 4.7% and 4%, respectively. 4.0% of the total radioactivity of the reaction mixture. The η 1 -denosine-5-monophosphate was eluted from the chromatographic paper with distilled water and its radiochemical purity was further verified by paper chromatography in other solvent systems (1-butanol-acetic acid-water / 4: 1: 5) 1-butanol -1- propanol - ammonium hydroxide - water (7: 5: 7: 2); butyric acid - ammonium hydroxide - water (66: 1,5: 33)) in which it was identified as a radiochemically pure substance. A total of 8.9 MBq of Ju-β-adenosine-5-monophosphate was obtained with a molar radioactivity of 11 10OMBq.mmol - 78, i.e. 78% of the radioactivity of the initial β-adenosine.
201 337201 337
Příklad 2Example 2
Enzymové syntéza £u-14cj adenosinu-5-trifosfátuEnzymatic synthesis £ U- 14 C-adenosine 5-triphosphate
Směs £u-14cjadenosinu (1 ^umol; molové radioaktivita 11.100 MBq.mmol“·*·), chloridu hořečnatého (5 /umol), guanosin-5-.trifosfátu (10 /Umol), kreatinfosfátu (7 /umol) a kreatinfosfokinasy (0,02 mg) byla rozpuštěna v 1,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,2 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 6 hodin při 37 °C, Po odstranění polyenzymového preparátu termickou denaturaoí byla reakční směs preparativně ohromatografována stejně jako v předchozím případě (viz příklad 1), Ohromatografiokou analýzou bylo zjištěno že konverze Qj-14cJadenosinu na [u-14cJadenqsÍn-5-trifosfát proběhla na 88 %, dalšími složkami reakční směsi byly fu-14c]adenosin-5-di£os£át a nezreagovaný £u-14C adenosin, v obou případeoh v množství 6 % celkové radioaktivity reakční směsi, Qj-14C Adenosin-5-trifosfát byl z ehromatografického papíru eluován směsí etanol - voda - hydroxid amonný (20 s 78 s 2) a jeho radioohemioká čistota byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozím případě (viz příklad 1). Celkově bylo získáno 8,3 MBq Qj-14cJadenosin-5-trifosfátu, tj. 75 % radioaktivity výchozího |u-14cjadenosinu, a to o radiochemioké čistotě vyšší než 97 % a molové radioaktivitě 11 100 MBq.mmo!A mixture of ε- 14 cadenosine (1 µmol; molar radioactivity 11,100 MBq.mmol ·), magnesium chloride (5 µmol), guanosine-5-triphosphate (10 µmol), creatine phosphate (7 µmol) and creatine phosphokinase (0.02 mg) was dissolved in 1.0 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 and incubated with 0.2 ml of the yeast poly-enzyme preparation of Saccharomyces cerevisiae for 6 hours at 37 ° C. removing the poly-enzyme preparation was thermal denaturaoí reaction mixture by preparative ohromatografována as in the previous case (example 1) Ohromatografiokou analysis indicated that conversion to cJadenosinu Qj- 14 [U- 14 cJadenqsÍn-5'-triphosphate was 88%, the other components of the reaction mixture fu- were 14 C] adenosine-5'-di-axis £ £ £ sulfate and unreacted U- 14 C adenosine případeoh both at 6% of the total radioactivity of the reaction mixture, 14 C Qj- adenosine-5'-triphosphate was eluted from the paper ehromatografického ethanol - water - ammonium hydroxide mixture (20 with 7 8 s 2) and its radio-chemical purity was verified in the same solvent systems as in the previous case (see Example 1). A total of 8.3 MBq of C14- C14 adenosine-5-triphosphate, i.e., 75% of the radioactivity of the initial C14- cadenosine, was obtained with a radiochemical purity greater than 97% and a molar radioactivity of 11,100 MBq.mmo!
Příklad 3Example 3
Enzymové syntéza £adenin-14C/U/Jadenosin-5-trifosfátuEnzymatic synthesis of adenine- 14 C / U / Jadenosine-5-triphosphate
Směs £Ú-14cJadeninu (1 /umol; molová radioaktivita 7 400 MBq,mmol“1), 5-fosfo-«6-D-ribosa-l-difosfátu (4 /uraol), chloridu hořečnatého (30 /Umol), guanosin-5-trifosfátu (20 /umol), kreatinfosfátu (7 /umol) a kreatinfosfokinasy (0,02 mg) bylo rozpuštěno v 1,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 4 hodin při 37 °C. Po termické denaturaoi a odstranění polyenzymového preparátu byla reakční směs podrobena kvalitativní chromatografické analýzej bylo zjištěno, že konverze £u-14cjadeninu na £adenin-14C/U/]adenosin-5-trifosfát proběhla na 97 % a jedinou další radioaktivní složkou reakční směsi byl nezreagovaný ju-14cjadenin. Reakční směs byla preparativně ohromatografována na papíře Whatman č, 3 v systému 1-butanolu nasyceného vodou, a to po dobu 24 hodin, při laboratorní teplotě a v sestupném uspořádání. jadenin-14C/U/]Adenosin-5-trifos£át byl z ohromatografického papíru eluován směsí etanol - voda - hydroxid amonný (20 : 78 » 2) a jeho radiochemioké čistota byla ověřena papírovou chromatografii ve stejnýoh rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozích případech (viz příklad 1), Celkově bylo získáno 6,07 MBq Jadenin-14C/U/Jadenosin-5-třifosfátu, oož je 82 % radioaktivity výchozího £u-14cjadeninu o molové radioaktivitě 7 400 MBq.mmol“1 a radiochemioké čistotě vyšší než 97 %·A mixture of Ú- 14 cadenine (1 µmol; molar radioactivity 7,400 MBq, mmol -1 ), 5-phospho-6-D-ribose-1-diphosphate (4 µaol), magnesium chloride (30 µmol), guanosine-5-triphosphate (20 µmol), creatine phosphate (7 µmol), and creatine phosphokinase (0.02 mg) was dissolved in 1.0 mL of 0.1 M Tris-HCl buffer pH 8.0 and incubated with 0, 4 ml of yeast Saccharomyces cerevisiae polyenzyme preparation for 4 hours at 37 ° C. After the thermal denaturation and removal of the polyenzyme preparation, the reaction mixture was subjected to qualitative chromatographic analysis. It was found that the conversion of ε- 14 cadadiene to β-adenine 14 C (U) adenosine 5-triphosphate was 97% and the only other radioactive component of the reaction mixture. unreacted jute 14 cjadenin. The reaction mixture was preparatively chromatographed on Whatman # 3 paper in a water-saturated 1-butanol system for 24 hours, at room temperature and in descending order. jadenin- 14 C / U /] adenosine-5-triphosphate £ At was ohromatografického paper eluting with ethanol - water - ammonium hydroxide (20: 78 »2) and its purity was checked radiochemioké paper chromatography in stejnýoh rozpouštědlovýoh systems, as in the previous examples (see Example 1), a total of 6.07 MBq of Jadenin- 14 C / U / Jadenosine-5-triphosphate was obtained, which is 82% of the radioactivity of the starting £ 14- cadenine with a molar radioactivity of 7,400 MBq.mmol -1 and radiochemical purity greater than 97% ·
Příklad 4Example 4
Enzymová syntéza [e-^cJadenosin-S-monofosfátuEnzymatic synthesis of [eta] adenosine-S-monophosphate
Směs [β-^cjadeninu (8 /umolj molové radioaktivita 1 850 MBq.mmol“1), 5-fosfo-oí*-D-ribosa-l-difosfétu (32 /umol) a chloridu horečnatého (120 yumol) byla rozouštěna v 6,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a inkubována s 5,0 ml pólyenzymového preparátu z kvasinek Saecharomyoes cerevisiae při 37 °C po dobu 3 hodin. Inkubace byla ukončena zahřátím reakční směsi ve vrouoí vodní lázni po dobu 3 minut a odstraněním denaturovaného polyenzymového preparátu. Chromatografickou analýzou bylo zjištěno, že reakční směs obsahuje pouze dvě radioaktivní látky, a to Je-^cJadenosin-S-monofosfát v množství 94 % a [θ-14cjadenosin v množství 6 % celkové radioaktivity reakční směsi, Finální směs byla preparativně chromatografována na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanolu nasyceného vodou, a to sestupně po dobu 24 hodin a při laboratorní teplotě. ^8-^4cjAdenosin-5-monofosfát byl z papíru eluován vodou a rechromatografován na papíře Whatman č. 3 v systému 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 í 5 : 7 : 2), v sestupném uspořádání, při laboratorní teplotě a po dobu 18 hodinj z chromatografiokého papíru byl radioaktivní nukleotid eluován opět destilovanou vodou. Celkově bylo získáno 10,4 MBq radioohemicky čistého ^8-^4cJadenosin-5-monofosfátu, tj. 70 % radioaktivity výchozího [8-14c]adeninu o molové radioaktivitě 1 850 MBq.mmol”1} radiochemická čistota nukleotidu byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozích případech (viz příklad 1).A mixture of β-β-adenine (8 µmol molar radioactivity 1,850 MBq.mmol -1 ), 5-phospho-α-D-ribose-1-diphosphate (32 µmol) and magnesium chloride (120 µmol) was dissolved in 6.0 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.5 and incubated with 5.0 ml of a poly-enzyme preparation of yeast Saecharomyoes cerevisiae at 37 ° C for 3 hours. Incubation was terminated by heating the reaction mixture in a boiling water bath for 3 minutes and removing the denatured polyenzyme preparation. Chromatographic analysis revealed that the reaction mixture contains only two radioactive substances, it's- cJadenosin ^ S-monophosphate in an amount of 94% and [14 θ- cjadenosin of 6% of the total radioactivity of the reaction mixture, final mixture was preparatively chromatographed on paper Whatman # 3 in water-saturated 1-butanol, descending for 24 hours and at room temperature. 8- 8- ^ 4 α-Adenosine-5-monophosphate was eluted from the paper with water and rechromatographed on Whatman # 3 paper in 1-butanol-1-propanol-ammonium hydroxide-water (7: 5: 7: 2), in descending order , at room temperature and for 18 hours from chromatography paper, the radioactive nucleotide was eluted again with distilled water. A total of 10.4 MBq of radioohemically pure β-8- 4 cadadiene-5-monophosphate, i.e. 70% of the radioactivity of the starting [8- 14 c] adenine with a molar radioactivity of 1,850 MBq.mmol ” 1 }, was obtained. the same solvent systems as in the previous cases (see Example 1).
Příklad 5Example 5
Enzymová syntéza Jguanin-^C/U/J guanosin-5-monofosfátuEnzymatic synthesis of Jguanine-C / U / J guanosine-5-monophosphate
Směs £u-^4c]guanlnu (1 /umol; molová radioaktivita 7 400 MEBq.mmol”^), 5-fosfo-<Zf-D-ribosa-l-difosfátu (4 /umol) a chloridu hořečnatého (15 yumol) byla rozpuštěna v 0,8 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saecharomyoes cerevisiae při 37 °C po dobu 3 hodin. Po termické denaturaei a odstranění polyenzymového preparátu byla reakční směs preparativně chromatografována na papíře Whatman č. 3 v systému 1-butanol - kyselina octová - voda (4 s 1 : 5) v sestupném uspořádání a při laboratorní teplotě po dobu 18 hodin. Analyticky bylo zjištěno, že reakční směs obsahuje Jguanin-^4C/U/Jguanosin-5-monofosfát v množství 85 %, [guanin-^C/U/Jguanosin v množství 9 % a ju-^4C^guanin v množství 6 % celkové radioaktivity* Radioaktivní nukleotid byl z ohromatografického papíru eluován destilovanou vodou a rechromatografován na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanol - aceton - kyselina ostová - 5%ní hydroxid amonný - voda (9 : 3 : 2 s 2 : 4) po dobu 20 hodin, opět v sestupném uspořádání a při laboratorní teplotě. Celkově bylo získáno 4,6 MBq radioohemicky čistého ^guanin-14C/U/Jguanosin-5-raonofosfátu, tj. 62 % radioaktivity výchozího JÚ-^4cJguaninu o molové radioaktivitě 7 400 MBq.mmol“\ radiochemická čistota radioaktivního nukleotidu byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předcho14A mixture of u- 4 4 c] guanine (1 µmol; molar radioactivity of 7,400 MEBq.mmol ^), 5-phospho- Z 2 -D-ribose-1-diphosphate (4 µmol) and magnesium chloride (15 µmol) ) was dissolved in 0.8 ml 0.1 M Tris-HCl buffer pH 7.5 and incubated with 0.4 ml Saecharomyoes cerevisiae yeast polyenzyme preparation at 37 ° C for 3 hours. After thermal denaturation and removal of the polyenzyme preparation, the reaction mixture was preparatively chromatographed on Whatman # 3 paper in 1-butanol-acetic acid-water (4: 1: 5) in descending order and at room temperature for 18 hours. Analytically it has been found that the reaction mixture contains Jguanin- -4 C / U / Jguanosin-5-monophosphate in an amount of 85%, [guanine-C / U / Jguanosin of 9% and a jute-4 C-guanine at 6 % of total radioactivity * Radioactive nucleotide was eluted from the chromatographic paper with distilled water and rechromatographed on Whatman # 3 paper in 1-butanol-acetone-ostic acid-5% ammonium hydroxide-water (9: 3: 2 with 2: 4) for 20 hours, again in descending order and at room temperature. Overall yield was 4.6 MBq radioohemicky pure guanine-14 C / U / Jguanosin 5-raonofosfátu, i.e. 62% of the initial radioactivity jute -4 cJguaninu molar radioactivity of 7400 MBq.mmol "\ radiochemical purity was verified by a radioactive nucleotide in the same solvent systems as in the foregoing14
201 337 zíoh případech (viz příklad 1)·201 337 cases (see example 1) ·
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (en) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (en) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS201337B1 true CS201337B1 (en) | 1980-10-31 |
Family
ID=5406560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (en) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS201337B1 (en) |
-
1978
- 1978-09-19 CS CS604278A patent/CS201337B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schnebli et al. | Purification and properties of adenosine kinase from human tumor cells of type H. Ep. No. 2 | |
| Brockman | Biochemical aspects of mercaptopurine inhibition and resistance | |
| NAKAO et al. | Phosphorus metabolism in human erythrocyte III. Regeneration of adenosine triphosphate in long-stored erythrocyte by incubation with inosine and adenine | |
| BENNETT et al. | Purine ribonucleoside kinase activity and resistance to some analogs of adenosine | |
| Bloch et al. | On the mode of action of 7-deaza-adenosine (tubercidin) | |
| BENNETT et al. | Metabolic studies with carbocyclic analogs of purine nucleosides | |
| Bennett Jr et al. | Formation and significance of 6-methylthiopurine ribonucleotide as a metabolite of 6-mercaptopurine | |
| Bennett Jr et al. | Activity of adenos1ne analogs against a cell culture, line resistant to 2-fluoroadenine | |
| Fridland et al. | Tiazofurin metabolism in human lymphoblastoid cells: evidence for phosphorylation by adenosine kinase and 5′-nucleotidase | |
| Raymond et al. | Evidence for the presence of 3′, 5′-cyclic AMP in plant tissues | |
| Suhadolnik et al. | Nucleoside Antibiotics: I. BIOCHEMICAL TOOLS FOR STUDYING THE STRUCTURAL REQUIREMENTS FOR INTERACTION AT THE CATALYTIC AND REGULATORY SITES OF RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE FROM LACTOBACILLUS LEICHMANNII | |
| Berens et al. | Adenosine analog metabolism in Giardialamblia: Implications for chemotherapy | |
| Kimball et al. | Inhibitory effects of the arabinosides of 6-mercaptopurine and cytosine on purine and pyrimidine metabolism | |
| Fan et al. | The conversion of dihydroneopterin triphosphate to sepiapterin by an enzyme system from Drosophila melanogaster | |
| Davis et al. | The enzymatic exchange of the acyl group of acyl dihydroxyacetone phosphate with free fatty acids | |
| Guha et al. | Brain glucose bisphosphatase requires inosine monophosphate. | |
| Remy | Ribonucleotides and ribonucleosides as methyl acceptors for S-adenosylmethionine:(Amino-and thio-) purine methyltransferases: Incorporation of 6-amino-2-methylaminopurine into ribonucleic acids | |
| Gotto et al. | Nucleoside metabolism in Ehrlich ascites tumor cells: Phosphorolysis of purine nucleosides | |
| CS201337B1 (en) | Method for the enzyme synthesis of radioactive ribonucleoside-5-phosphates of adenine and guanine,specifically or non-specifically labeled with radioisotope c up14 or h up k | |
| Paterson et al. | Ribonucleic acid synthesis in tumor homogenates | |
| Ikeda et al. | Multisubstrate analogs for deoxynucleoside kinases. Use in novel affinity media applied to resolution of Lactobacillus enzymes. | |
| Wheeler | Enzymes for purine synthesis and scavenging in pathogenic mycobacteria and their distribution in Mycobacterium leprae | |
| Hill et al. | The purine and pyrimidine metabolism of Tetrahymena pyriformis | |
| Zinchenko et al. | Enzymatic synthesis of nucleoside 5′-mono and-triphosphates | |
| Chiga et al. | The activities of certain nucleoside diphosphokinases of normal and regenerating rat liver |