CS201337B1 - Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo - Google Patents
Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo Download PDFInfo
- Publication number
- CS201337B1 CS201337B1 CS604278A CS604278A CS201337B1 CS 201337 B1 CS201337 B1 CS 201337B1 CS 604278 A CS604278 A CS 604278A CS 604278 A CS604278 A CS 604278A CS 201337 B1 CS201337 B1 CS 201337B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- radioactive
- adenosine
- adenine
- guanine
- ribonucleoside
- Prior art date
Links
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 67
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 67
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 title claims description 64
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 title claims description 50
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 49
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 title claims description 48
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 36
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 33
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=NC=N[C]21 IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 57
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 30
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 29
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 29
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 19
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 claims description 17
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 claims description 17
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 13
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 7
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 35
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 23
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 108010076278 Adenosine kinase Proteins 0.000 description 17
- 102100032534 Adenosine kinase Human genes 0.000 description 17
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 14
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 5-(3-bromophenyl)-7-(6-morpholin-4-ylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-amine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=12C(N)=NC=NC2=NC(C=2C=NC(=CC=2)N2CCOCC2)=CC=1C1=CC=CC(Br)=C1 OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 9
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 108010091901 purine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 7
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 7
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 7
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N azanium;hydroxide;hydrate Chemical compound N.O.O ZFSFDELZPURLKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000491 Corchorus aestuans Species 0.000 description 2
- 235000011777 Corchorus aestuans Nutrition 0.000 description 2
- 235000010862 Corchorus capsularis Nutrition 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- 101100202428 Neopyropia yezoensis atps gene Proteins 0.000 description 2
- 108010044790 Nucleoside-Phosphate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000005811 Nucleoside-phosphate kinase Human genes 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CCCCO MHLMRBVCMNDOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JDWFOTLBRARKLZ-UHFFFAOYSA-N azanium;ethanol;hydroxide;hydrate Chemical compound [NH4+].O.[OH-].CCO JDWFOTLBRARKLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- JWDLEVZYUTZUBA-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;phosphono dihydrogen phosphate Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(O)=O.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 JWDLEVZYUTZUBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003936 Diphosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000330 Diphosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L IMP(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-L 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710180958 Putative aminoacrylate hydrolase RutD Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- KJCBCYNGQDISNK-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butan-1-ol;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CC(O)=O.CCCCO KJCBCYNGQDISNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 108010036383 guanosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N oic acid Natural products C1CC2C3CC=C4CC(OC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)CC(O)C4(C)C3CCC2(C)C1C(C)C(O)CC(C)=C(C)C(=O)OC1OC(COC(C)=O)C(O)C(O)C1OC(C(C1O)O)OC(COC(C)=O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HVFSJXUIRWUHRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002718 pyrimidine nucleoside Substances 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Předmětem vynálezu je způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-monofosfátů, ribonukleosid-5-difosfátů a ribonukleosid-5-trifosfátů adeninu a guaninu, značenýoh v molekule specificky nebo nespecificky radioizotopem X4C nebo ’Η, založený na fosforibosylaoi radioaktivního adeninu a guaninu, resp. fosforylaci radioaktivního adenosinu za katalýzy polyenzymovým preparátem izolovaným z kvasinek Saooharomyoes cerevisiae v přítomnosti fosforibosylovýoh, resp. fosfátových skupin a hořečnatýoh iontů.
Způsob enzymové syntézy radioaktivníoh ribonukleosid-5-fosfátů podle vynálezu využívá katalytických vlastností enzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae, získaných specifickým postupem izolace enzymového preparátu z bezbuněčných extraktů kvasinek, jak uvádíme dále. Enzymový preparát je souborem šesti enzymů, a to adenosinkinasy, adeninfosforibosyltransferasy, hypoxanthinfosforibosyltransferasy, ribosofosfátpyrofosfokinasy, nukleosidmonofosfátkinasy a núkleosiddifosfátkinasy, které buď jednotlivě nebo ve vzájemné kombinaci katalyzují syntézu shora uvedených radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů. Řízeným způsobem lze takto aplikací zmíněného enzymového preparátu připravit v jediné reakci radioaktivní ribonukleosid-5-fosfáty adeninu a guaninu z jejich radioaktivních bází nebo nukleosidů o požadovaném stupni fosforylace, včetně
201 337 přímé enzymové syntézy radioaktivního adenosin-5-trifosfátu z radioaktivního adeninu. Pro tyto specifické vlastnosti, které uvedený enzymový preparát charakterizují, uvádíme ho dále jako polyenzymový preparát z kvasinek Saccharomyces oerevisiae. Široká substrátová speoifioita polyenzymového preparátu kromě toho dovoluje aplikovat různé donory fosfátových a fosforibosylových skupin, což, dále rozšiřuje počet možných reakčních kombinaoí pro enzymovou syntézu radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu.
Při enzymové syntéze radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů podle vynálezu se neprojevuje vliv degradativníoh enzymů; v průběhu reakcí nedochází k poklesu molové radioaktivity produkovaných ribonukleosid-5-fosfátů a stupeň konverze obou purinovýoh bází, resp» adenosinu na ribonukleosid-5-fosfáty zpravidla převyšuje 90 %,
Aplikace radioaktivních 5-ribonukleotidů, včetně ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených radioizotopem nebo ^H, má pro řešení problémů základního výzkumu mnoha vědních oborů zásadní význam a je dnes již rozsáhlá. Zejména adenosin-5-trifosfát jako nej důležitější součást metaboliokého poolu živé buňky a přímý prekursor pro biosyntézu ribonukleových kyselin, je ve formě značené vhodným radioizotopem látkou vysooe atraktivní.
Stávající způsoby přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu vycházejí z metodických možností organické syntézy a biosyntézy. Nejméně vhodné jsou postupy organické syntézy, a to pro nutnost specifického chránění funkčních skupin výchozích látek, velký počet reakčních stupňů a požadavek vysoké stereospeoificity. Prakticky nepoužitelné jsou tyto postupy pro přípravu radioaktivních preparátů o vysoké molové radioaktivitě.
Mnohem větší možnosti pro přípravu radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu poskytuje naopak celá metodická oblast biochemických syntéz. Příkladem může být izolace radioaktivních rihnukleosid-5-monofosfátů adeninu a guaninu, nespecificky značených v molekule radioizotopem ^C, z nukleových kyselin jednobuněčných zelených nebo modrozelených řas pěstovaných autotrofně v atmosféře radioaktivního kysličníku uhličitého. Uvedený příklad je typem charakteristickým pro nespecifický způsob biosyntézy radioaktivních 5-ribonukleotidů; radioaktivní ribonukleosid-5Ámonofosfáty adeninu a guaninu se zde získají jako součást komplexu dalších základních radioaktivních nukleosid-5-monofosfátů ribonukleové i deoxyribonukleové řady. Specifické způsoby biosyntézy 5-ribonukleotidů se vyznačují naopak tím, že vedou zpravidla k tvorbě jediného reakčního produktu; metodicky spadají do oblasti enzymových syntéz a provádějí se téměř výlučně pomooí enzymů tak zvaných zachraňujících mechanizmů (salvage mechanismus), jimiž jsou některé biologické systémy vybaveny.
Pokud jde o možnosti specifické enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, připadá především v úvahu využití katalytických vlastností adeninfosforibosyltransferasy pE.C. 2.4.2.7., AMP: pyrofosfátfosforibosyltrans201 33 ferasa^jresp. hypoxanthinfosforibosyltransferasy £e.C. 2.4.2.8., IMP: pyrofosfátfosforibosyltransferasaj, případně adenosinkinasy £e.C. 2.7.1.20. ATP: adenosin-5-fosfotrans ferasaj. Uvedené enzymy katalyzují enzymovou syntézu ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu podle následujících reakcí:
E.C. 2.4.2.7. ,
a) adenin + 5-fosfo-/^-D-ribosa-l-difosfát =^=====^ adenosin-5-monofosfát + + pyrofosfát,
E.C. 2.4.2.8. *
b) guanin + 5-fosfo-/»-D-ribosa-l-difosfát s^=====5s guanosin-5-monofosfát + + pyrofosfát, t E.C. 2.7.1.20.
o) adenosin + adenosin-5-trifosfát ag— --·—--- >= adenosin-5-monofosfát + + adenosin-5-difosfát.
Za prvou informaci o existenci purinové fosforibosyltransferasy lze považovat zjištění, že v přítomnosti enzymových frakcí z holubích jater, adenosin-5-trifosfátu a riboso-5-fosfátu se z hypoxanthinu syntetizuje inosin-5-monofosfát, aniž se tvoří inosin jako reakční meziprodukt (Williams, W. J. a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem.
203. 583 /1953/).
V dalších letech byly enzymové preparáty obsahující purinové fosforibosyltransferasy izolovány z řady normálních i maligních živočišných tkání a dále z bakterií a kvasinek (Korriberg, A., Lieberman, I. a Simms, E., <J. Biol. Chem. 215. 417 /1955/} Korn,
E. D., Remy, C. N., Wasilejko, Η. N, a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem. 217. 875 /1955/} Flaks, J. G., Erwin, M. J. a Buchanan, J. M., J. Biol. Chem. 228. 201 /1957/} lukens,
I. N. a Herrington, K. A., Biochim, Biophys. Acta 24. 432 /1957/} Kalle, G, P. a Gots,
J. S., Biochim. Biophys. Acta 53. 166 /1961/} Kalle, G. P. a Gots, J. S., Science 142. 680 /1963/} Hoři, H. a Henderson, J. F., J. Boil. Chem. 241. 1406 /1966/} Henderson,
J. F., Brox, 1. W., Kelley, W. N., Rosenbloom, F. M. a Seegmiller, J. E., J. Biol.
Chem. 243. 2514 /1968/} Miller, R. L. a Bieber, A. 1., Biochemistry 2, 1420 /1968/} Berlin, R. D., Arch. Biochim. Biophys. 134. 120 /1969/} Hochstadt-Ozer, J., Fed. Proceed. 29. 342 /1970/} Srivastava, S. K. a Beutler, E., Arch. Biochim. Biophys. 142. 426 /1971/). Purinové fosforibosyltransferasy, přítomné v enzymových preparátech, byly blíže charakterizovány prozkoumáním fyzikálních a chemických vlastností, studiem kinetických vlastností a objasněním role v metabolismu nukleovýoh kyselin} souběžně byly ověřovány i rozmanité způsoby purifikace enzymů z tkáňových homogenátů.
Za nejzávažnější zjištění, která vzešla z těchto studií, lze považovat dále uvedené skutečnosti:
1) Aktivním meziproduktem v enzymových reakcích, katalyzovaných purinovými fosforibosyltransferasami je 5-fosfo-^-D-ribosa-l-difosfát, který funguje jako donor fosforibosylových skupin v reakci:
Purin + 5-fosfo-<fr -D-ribosa-l-difosfát -7 ==^/purin/nukleosid-5-monofo3fát + + pyrofosfát.
201 337
2) Existují dva základní typy purinových fosforibosyltransferas, a to adeninfosíoribosyl transferasa £e.C. 2.4.2.7.J, která je aktivní vůči adeninu a některým jeho derivátům, ale nikoli vůči guaninu a hypoxanthinu, a dále hypoxanthinfosforibosyltransferasa [e.C. 2.4.2,8.^, aktivní naopak vůči hypoxanthinu, guaninu, případně i xanthinu, avšak zcela neaktivní vůči adeninu a jeho derivátům. Určitá nejasnost, zda totiž obecně existuje v biologických systémech jediná fosforibosyltransferasa, aktivní vůči guaninu a hypoxanthinu, či zda jde o dva specifické enzymy, není však dosud uspokojivě zodpovězena.
3) Purinové fosforibosyltransferasy patří k nestabilním thermolabilním enzymům. Míra jejich stability je závislá, mimo jiné, na stupni jejioh purifikace, resp. na způsobu jejich izolace z tkáňových homogenátů. Udává se například ztráta 25 až 35 % enzymové aktivity adeninfosforibosyltransferasy izolované z kvasinek, a to během týdnů skladování enzymového preparátu při -15 °C, ale také ztráta 33 % enzymové aktivity v enzymovém preparátu izolovaném z Ehrlichova asoitiokého tumoru, a to během 3 dní skladování při -20 °C.
4) Katalytická účinnost obou enzymů je obecně podmíněna přítomností dvojmocných kationtů, zpravidla Mg2+-iontů, ale rovněž Mn2+- nebo Ca2+-iontů.
Purifikaoí do vysokého stupně (1000 až 1200 násobnou) byly adeninfosforibosyltransferasa i hypoxanthinfosforibosyltransferasa připraveny z kvasinek Sohizosaccharomyces pombe ve formě homogenních enzymů o definované molekulové hmotnosti (Nagy,
M. a Ribot, A. M., Eur. J. Biochem. 77. 77 /1977/). Takto vysoce puriíikované enzymy jsou ovšem extrémně termolabilní a rychle ztrácejí enzymovou aktivitu. Tomu se dá zčásti zabránit jejich přechováváním při -20 °C v prostředí 5-fosfo-/z-D-riboso-l-difosfátu a chloridu hořečnateho o vysoké koncentraci; za těchto podmínek si enzymy zachovávají stabilitu přibližně 4 týdny. Termolabilitu adeninfosforibosyltransferasy lze blokovat již v průběhu izolaoe enzymu z kvasinek, a to nasycením tkáňových homogenátů kyselinou adenylovou, tedy vlastním produktem reakce katalyzované zmíněným enzymem.
Posforylaoe purinových i pyrimidinových nukleosidů na nukleosid-S^fosfáty v přítomnosti adenosin-5-trifosfátu probíhá podle reakcet
Nukleosid + adenosin-S^trifosfát '^7-· =— nukleosid-S^monofosfát + + adenosin-5-difosřát a považuje se za alternativní proces k doplnění nukleotidového poolu v živé buňce.
Posforylaoe adenosinu pomocí adenosin-S^trifosfátu v přítomnosti extraktů z kvasinek je dokonce historicky prvou zmínkou o studiu enzymové syntézy nukleotidu (Ostern, P. a Terszakoweč, J., Hoppe - Seylers Z. Physiol. Chem. 250. 155 /1937/)· Později byl enzym, zodpovědný za tuto reakci, identifikován v částečně purifikovaných extraktech z kvasinek, resp. ledvin a jater králíka (Caputto, R., J. Biol. Chem. 189.
801 /1951/; Kornberg, A. a Pricer, W. E. Jr., J. Biol. Chem, 193. 481 /1951/) a defi201 337 nován jako adenosinkinasa £e.C. 2.7.1.20., ATP: Adenosin-5-fosfotransferasaJ. Dalšímu studiu biologické role enzymu a jeho vlastností bránila vysoká nestabilita, která se navíc zvětšovala úměrně s rostoucím stupněm purifikace. Přesto byly nalezeny způsoby izolace enzymu z normálních i maligních živočišných tkání /Schnebli, Η. P., Hill, D. 1. a Bennett, L. L. Jr, J. Biol. Chem. 242/1997 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H. a Hansen, K.,
J. Biol. Chem. 242. 350 (1967)} Lindberg, B., Klenow, H. a Hansen, K., J. Biol. Chem.
242. 350 (1967)} Lindberg, B., Biochim. Biophys. Acta 185. 245 (1969)} Divekar, A. Y. a Hakala, Μ. T., Mol. Pharmacol. 2, 663 (1971)} Henderson, P. J., Mikoshiba, A., Chu,
S. Y. a Caldwell, I. C., J. Biol. Chem. 242, 1972 (1972)/, které dovolily blíže charakterizovat substrátovou specificitu a některé další vlastnosti adenosinkinasy a studovat její kinetické a molekulární vlastnosti. Z pivovarských kvasinek bylo dokonce izolováno několik izoenzymů, vykazujících adenosinkinasovou aktivitu /Leibach, Τ. Κ», Speiss,
G. I., Neudecker, T. J., Peschke, G., Puchwein, G. a Hartman, G. R., Hoppe-Seyler*s Z. Physiol. Chem. 352. 328 (1971)/· Enzymy byly izolovány ve formě molekulárně homogenních polypeptickýoh řetězců o molekulové hmotnosti kolem 40 000. Enzymy jsou vysoce labilní a jejich enzymovou aktivitu lze jak při skladování, tak v průběhu purifikačního procesu bezpečně uchovat pouze v přítomnosti adenosinu o vysoké koncentraci (zpravidla 5 milimolárního roztoku adenosinu). Jako stabilizátor enzymové aktivity je adenosin specifický a nemůže být nahrazen žádným jiným přirozeně se vyskytujícím nukleosidem. V určitém rozsahu může protektivní účinky adenosinu nahradit dithiothreitol. Odstranění stabilizátorů vede k úplné ztrátě enzymové aktivity vysoce purifikováných kinas. Proces je doprovázen agregací enzymově aktivních jednoduchých polypeptidů v inaktivní makromolekuly o molekulové hmotnosti kolem 400 000.
Specificita adenosinkinas izolovaných z různých zdrojů a různými purifikačními postupy je shodně vymezena s ohledem na nukleosidový substrát: fosforylaci adenosinu a některých jeho strukturálních analog katalyzují intenzivně, zatímco vůči guanosinu, inosinu a všem pyrimidinovýra ribo- nebo deoxyribonukleosidům jsou zcela inaktivní. 2ÉDeoxyadenosin je fosforylován jen zanedbatelně, a to pouze vysoce purifikovanými preparáty enzymu. Substrátová specificita adenosinkinas vůči donorům fosfátových skupin je podstatně širší} vedle adenosin-5-trifosfátu lze v určitých případech aplikovat rovněž jiné nukleosid-5-trifosfáty, vždy však s výrazně menší účinností.
Katalytický účin adenosinkinasy je obecně podmíněn přítomností dvojmocných kationtú, obvykle Mg - nebo Mn -iontů. Naproti tomu optimální pH enzymových reakcí je individuálně závislé na zdroji a způsobu purifikace adenosinkinasy; v některých případech byla u adenosinkinasy zaznamenána dvě reakční pH optima.
Jestliže není pochyb o existenci adenosinkinasy v živých buňkách, pak existence guanosinkinasy není prokázána, a některé informace v tomto směru je nutno brát jako předběžné.
Výčet informací o biologických a fyzikálně-chemických vlastnostech adeninfosforibosyltransferasy, hypoxanthinfosforibosyltransferasy a adenosinkinasy, jak je shora
201 337 v přehledu uveden, lze shrnout do těchto hlavních závěrů:
1) Přítomnost uvedených enzymů byla prokázána v normálních i maligních živočišných tkáních, v bakteriích a v kvasinkách. Z kvasinek byly enzymy izolovány v molekulárně homogenní formě.
2) Enzymy katalyzují v přítomnosti donorů fosforibosylovýoh, resp. fosfátovýoh skupin fosforibosylaci adeninu a guaninu, resp. fosforylaoi adenosinu, při čemž reakčními produkty jsou ribonukÍeosid-5-monofosfáty adeninu a guaninu.
3) Enzymy jsou nestabilní, při čemž míra jejioh nestability závisí především na způsobu izolace z tkání a vzrůstá s počtem purifikačníoh stupňů. Osvědčenými stabilizátory enzymů jsou buď reakční produkty nebo výchozí substráty katalyzovanýoh enzymových reakcí.
Enzymová syntéza radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu o vysoké molové radioaktivitě, značených v molekule radioizotopem resp. ^H, má však své specifické zvláštnosti, které ve shora uvedených studiích se speciálním zaměřením nejsou řešeny, které je však nutno zásadně respektovat při návrhu technologického modelu přípra vy radioaktivních purinových ribonukleotidů v preparativním měřítku. Jde zejména o tato specifika:
a) Při izolaci enzymů z tkáňových homogenátů je nezbytné odstranit kvantitativně nukleové kyseliny a zamezit tak jejioh přítomnosti v purifikovaných enzymových preparátech. V opačném případě nelze vyloučit atakování nukleovýoh kyselin nukleasami v průběhu enzymových reakoí, což vede k sekundárnímu vzniku neaktivních, nukleotidů. Tyto neaktivní nukleotidy mohou inhibovat katalytickou účinnost enzymů, v každém případě však snižují molovou radioaktivitu purinových ribonukleotidů značených radioizotopy,
b) Příprava radioaktivních purinových nukleotidů v technologickém měřítku je realizovatelná za předpokladu, že jsou k dispozici enzymové preparáty, jejiohž katalytická účinnost se zachová minimálně po dobu několika týdnů nebo měsíců skladování. Bylo již shora uvedeno, že dosud publikované postupy přípravy enzymových systémů vedly pouze k vysoce labilním enzymovým preparátům.
o) Blokovat labilitu katalyzujíoíoh enzymů produkty či substráty katalyzovanýoh reakcí, ať již v průběhu purifikaoe nebo skladování enzymových preparátů, není v případě enzymové syntézy radioaktivních purinových nukleotidů možné, protože by docházelo k mnohonásobnému snížení jejioh molové radioaktivity.
d) V případě enzymové fosforylaoe adenosinu nelze aplikovat adenosin-5-trifosfát jako všeobecně užívaný donor fosfátovýoh skupin, a to opět z důvodu případného nežádoucího snížení molové radioaktivity produkovaného adenosin-5-monofosfátu.
Kromě těohto čistě radioehemiokých aspektů je při navrhování universálního enzymového způsobu přípravy radioaktivních purinových ribonukleosid-5-fosfátů nutno vzít v úvahu ještě další podstatné okolnosti:
A) Metody přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu se obecně zaměřují především na získání adenosin-5-trifosfátu a guanosin-5-trifosřátu Jako
201 3!
primárních prekursorů pro studium biosyntézy ribonukleových kyselin a řadu dalšíoh studií. Shora uvedené enzymové reakce využívající katalytických vlastností purinovýoh fosforibosyltransferas a adenosinkinasy však přímou syntézu obou zmíněných radioaktivních nukleotidů z jednoduohých radioaktivních substrátů neumožňují} ve všech případech jsou finálními produkty ribonukleosid-5-monofosfáty adeninu a guaninu. Nalzení způsobu jednoduché přípravy radioaktivních ribonukleosid-5-trifosfátů adeninu a guaninu enzymovou cestou je proto aktuálním problémem.
Β) V enzymových systémeoh, studujících vlastnosti fosforibosyltransferas adeninu a guaninu, resp. adenosinkinasy, se zpravidla aplikují purifikované enzymy, zoela speoifioké vůči uvedeným substrátům} katalytické vlastnosti dalšíoh přítomných enzymů se obvykle nezkoumají. Tento přístup je pro vypracování obecného modelu enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů jak adeninu, tak guaninu, navíc o libovolně požadovaném stupni fosforylaoe, nevyhovující, Řešení problému spočívá naopak v přípravě enzymového preparátu, obsahujícího veškeré enzymy potřebné k syntéze shora uvedené škály radioaktivních nukleotidů a zbaveného přitom nežádoucích degradativníoh enzymů.
Vynález uvádí právě takový způsob enzymové syntézy širokého souboru ribonukleosid-5^fosfátů adeninu a guaninu specificky nebo nespecificky značených v molekule radioizotopem resp. 3H, jehož základem je využití specifických katalytických vlastností polyenzymového preparátu izolovaného nově vypracovaným postupem z kvasinek Saccharomyoes cerevisiae.
Princip způsobu enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu podle předmětného vynálezu spočívá ve fosforibosylaoi radioaktivního adeninu a guaninu, resp. fosforylaci adenosinu, případně v kombinaci fosforibosylaoe a fosforylaoe uvedených radioaktivních složek nukleovýoh kyselin, a to katalytickým účinem specifických enzymů přítomných v polyenzymovém preparátu izolovaném z kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Zmíněné enzymové reakce probíhají v přítomnosti donorů fosforibosylových skupin, s výhodou 5-fosfo-oó-D-ribosa-l-difosfátu, dále v přítomnosti donorů fosfátových skupin, s výhodou adenosin-5Átrifosfátu nebo guanosin-5Átrifosfátu, případně v přítomnosti systému regenerujíoího donory fosfátových skupin, s výhodou v přítomnosti kreatin fosfokinasy a kreatinfosfátu. Pro průběh enzymových reakcí je žádoucí přítomnost dvojmocných kationtů s výhodou hořečnatých iontů. Enzymové reakce probíhají v prostředí libovolného vhodného pufru s výhodou Tris-HCl pufru o pH 7,5 až 8,0 a dále při optimální reakčni teplotě, s výhodou při 37 °C.
Polyenzymový preparát z kvasinek Saccharomyces cerevisiae se připravuje dále popsaným způsobem. Čerstvá kultura kvasinek se suspenduje v 0,02 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a vzniklá suspenze se odstředí při 5 000 x g a 0 až 4 °C během 40 minut (pokud to není výslovně uvedeno jinak, tak i všechny další operace se provádějí při 0 až 4 °C a v prostředí 0,02 M Tris-HCl pufru o pH 7,5)·Supernatantní frakce se odstraní a sediment se znovu suspenduje v pufru tak, že 0,8 až 1,0 g vlhké váhy
201 337 kvasinek připadá na 10 ml pufru· Suspenze se homogenizuje ultrazvukem (příkon 60 Watt, frekvence 22 kHz) po dobu 2 minut· Homogenát se zoentrifugujo při 25 000 x g během 30 minut a buněčné debrity se odstraní. K supernatantní frakci se postupně přidává 15% vodný roztok streptomycinsulfátu· jímž se totálně vysrážejí buněčné nukleové kyseliny· Po jejioh odstranění odstředěním při 30 000 x g během 20 minut se čirý roztok dvoustupňové saturuje pevným síranem amonným· V prvém stupni se sycením roztoku na 50 % saturace vysrážejí,kontaminující bílkoviny a pigmenty, které se odstraní odstředěním. Ve druhém stupni se sycením roztoku síranem amonným na 85 % a následujícím stáním při 0 až 4 °0 po dobu několika hodin vyloučí sraženina, která se odstředí, rozpustí v pufru, a podrobí gelové filtraci (G-25 /ooarse/). Touto frakoionaoí se získá surový polyenzymový preparát, zbavený síranu amonného a streptomyoinsulfátu, a ten se dále purifikuje ve dvou stupních na DEAE-oelulose. V prvém stupni se polyenzymový preparát adsorbuje na DEAE-oelulose a zbaví se kontaminujíoíoh bílkovin promytím pufrem; promývání se ukončí v okamžiku, kdy eluční roztok vykazuje nulovou absorbanei při 280 nra. Desorpoe polyenzymového preparátu se provede 0,25 M roztokem chloridu sodného v pufru. Ve druhém stupni se roztok polyenzymového preparátu nejprve desetinásobně zředí pufrem, znovu se adsorbuje na DEAE-oelulose a promyje 0,05 M roztokem chloridu sodného v pufru. Desorpoe polyenzymového preparátu se uskuteční 0,175 M roztokem chloridu sodného v pufru. Roztok polyenzymového preparátu se rozdělí na menší podíly, které se skladují při -20 °C.
V polyenzymovém preparátu, izolovaném shora popsaným způsobem z kvasinek Saocharomyces oerevisiae, byla bezpečně prokázána existence dále uvedených enzymů, jejichž katalytických vlastností bylo buď jednotlivě nebo v jejich vzájemné kombinaoi využito k enzymové syntéze ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených v molekule radioaktivními izotopy ^c, resp. ^Hí
1. Adenosinkinasa £e.C. 2.7.1.20., ATP: adenosin-5-fosfotransferasaJ.
2* Adeninfosforibosyltransferasa £e,C. 2.4.2.7., AMP: pyrofosfátfosforibosyltransferasaj.
3. Hypoxanthinfosforibosyltransferasa £e.C. 2.4.2.8., IMPs pyrofosfátfosforibosyltransferasaj.
4. RibosofosfátpyrofosfokinasaJe.C. 2.7.6.I., ATPs D-ribosa-5-fosfátpyrofosfotransferasaj.
5. Nukleosidmonofosfátkinasa [e.C. 2.7.4.4., ATP: nukleosidmonofosfátfosfotransferasaj.
6. Rukleosiddifosfátkinasa £e.C. 2.7.4.6., ATPs nukleosiddifosfátfosfotransferasaj.
Naproti tomu byly v průběhu purifikaČního prooesu odstraněny z polyenzymového preparátu degradativní enzymy, zejména enzymy ze skupiny nukleotidfosfohydrolas, aminohydrolas a ATP-fosforylas. Degradativní enzymy byly eliminovány buď zoela nebo do té míry, že jejich přítomnost již podstatně neovlivňuje účinnost enzymů katalyzujíoíeh syntézu radioaktivních nukleotidů. Z polyenzymového preparátu byly kromě toho kvantitativně odstraněny nukleové kyseliny, takže se nesnižuje molová radioaktivita vznikajících nukleotidů.
201 337
Díky těmto vlastnostem slouží uvedený polyenzymový preparát k produkci širokého souboru radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, a to tím, že katalyzuje reakce adeninu, guaninu, resp. adenosinu s rozličnými donory fosfátových, resp. fosforibosylovýeh skupin. Hlavní možné reakční kombinace uvádíme v tomto přehledu:
| Radioaktivní akoeptor | Neradioaktivní donor | Produkt |
| 1. Adenin+ | 5-Fosfo-<6-D-ribosa-l-difosfát | £adenin+jAdenosin-5-mono- fosfát |
| 2. Guanin* | 5-Posfo-«0-D-ribosa-l-difosfát | £guanin+^ Guano s i n-5-monofosfát |
| 3. Adenosin* | Quanosin-5-trifosfát | Adenosin+-5-monofosfát |
| 4. Adenosin* | Guanosin-5-trifosfát; Kreatinfosfát a kreatinfosfo- kinasa | Adenosin+-5-trifosfát |
| 5. Adenin+ | 5-Posfo- Jj -D-ribosa-l-dif osf át; Guanosin-5-trifosfát; Kreatinfosfát a kreatinfosfo- kinasa | £adenin+J Adenosin-5-trifosfát |
+ Specificky či nespecificky značeno radioizotopem •'^C nebo 3H
Okruh produktů hlavních reakčních kombinací se rozšiřuje o další typy výběrem různě značených radioaktivních substrátů (značené radioizotopem ^C, resp. 3H, značené v molekule specificky či nespecificky, a pokud je výchozím substrátem adenosin, tedy značené buž v bázi nebo v ribosylovém zbytku).
K dosažení optimálních přeměn typu purin->- /purin/ribonukleosid-5-monofosfát, katalyzovaných specifickými purinfosforibosyltransferasami, přítomnými v polyenzymovém preparátu z kvasinek, bylo nalezeno vhodné složení komponent výchozí reakční směsi v molárním poměru adenin/guanin/: 5-fosfo-,á-D-ribosa-l-difosfát: t chlorid hořečnatý =1:4: 10, Podstatným snížením koncentrace hořečnatých iontů až na molární poměr báze : hořečnaté ionty = 1 : 1 se sníží i stupeň konverze, zatímco zvýšení koncentrace hořečnatých iontů je bez podstatného vlivu. Extrémní' snížení nebo zvýšení molárního poměru donoru fosforibosylovýeh skupin vůči radioaktivní bázi, například na hodnotu 1 : 1 nebo 10 : 1, vede v každém případě ke snížení produkce radioaktivních ribonukleosid-5-monofosfátů.
Stupeň konverze radioaktivního guaninu, resp. adeninu na ribonukleosid-5-monofosfát, lze výrazně ovlivnit množstvím aplikovaného polyenzymového preparátu; optimální množství preparátů izolovaných z různých šarží kvasničných kultur se stanovuje vždy znovu pro každou pokusnou sérii enzymových reakcí.
Při volbě 0,02 M Tris-HCl pufru jako reakčního prostředí byla nalezena dvě reakční optima, a to při pH 7,5 až 8,0 a při pH 9,0. Optimální teplota reakčního prostředí je
201 337 °C. V závislosti na koncentraci složek reakční směsi, množství polyenzymového prepa rátu a jeho enzymové aktivitě se pokusně určí optimální reakční doba.
Při dodržení shora uvedených optimálních reakčních podmínek se dosahuje až 90 % přeměny radioaktivního adeninu, resp. guaninu na odpovídající ribonukleosid-5-mohofosfáty.
Skladováním polyenzymového preparátu při -20 °C po dobu 14 týdnů se enzymová akti vita purinových fosforibosyltransferas sníží o 10 &
V alternativě pro přímou přeměnu radioaktivní báze na ribonukleosid-5-trifosfát, zejména pak pro případ přímé konverze radioaktivního adeninu na adenosin-5-trifosfát, se zachovají stejné podmínky jako při enzymové syntéze adenosin-5-monofosfátu. Pouze složení výohozí reakční směsi se doplní o guanosin-5-trifosfát jako donor fosfátovýoh skupin, a to obvykle v molárním poměru adenin : guanosin-5Átrifosfát 1 : 20, a dále o systém kreatinfosfátu a kreatlnfosfokinasy, určený k regeneraci donoru fosfátovýoh skupin. Při dodržení uvedených reakčních podmínek proběhne v optimální době reakce přeměna adeninu na adenosin-5-trifosfát na 90 až 95 %·
Jako dalěí možné varianty enzymové syntézy radioaktivního purinového nukleotidu pomocí polyenzymového preparátu, izolovaného z kvasinek Saooharomyoes oerevisiae, lze výhodně využít katalytických vlastností adenosinkinasy, přítomné v polyenzymovém preparátu, a to pro přeměnu radioaktivního adenosinu na adenosin-5-monofosfát.
Pro tento případ bylo zvoleno složení výchozí reakční směsi v molárním poměru adenosin t chlorid hořečnatý í guanosin-SÁtrifosfát =1:5: 10. Reakce probíhá v prostředí 0,01 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 při teplotě 37 °C. Při shora zvoleném složení reakční směsi a molárním zastoupení jednotlivýoh složek má na průběh reakce výrazný vliv množství aplikovaného polyenzymového preparátu. Určení optimálního množství polyenzymového preparátu i reakční doby se řídí stejnými zásadami jako v předcho zích uvedenýoh případeoh. Při dodržení optimálního reakčního režimu dosahuje stupeň konverze radioaktivního adenosinu na adenosin-5-monofosfát až 90 %.
Adenosinkinasa je enzym dostatečně stabilní} při skladování polyenzymového preparátu po dobu 18 týdnů při -20 °C se její enzymová aktivita nemění.
Při zachování reakčních podmínek, uvedenýoh pro syntézu radioaktivního adenosin-5-monofosfátu z radioaktivního adenosinu, ale po doplnění výchozí reakční směsi o sys tém kreatinfosfátu a kreatlnfosfokinasy, se aktivizují nukleotldkinasy přítomné v póly enzymovém preparátu a dosáhne se přímé přeměny radioaktivního adenosinu na adenosln-5-trifosfát minimálně z 90 %·
Radioaktivní ribonukleosid-5Ádifosfáty adeninu nebo guaninu mohou po úpravě reakčních podmínek vznikat jako vedlejší produkty při fosforibosylaci, resp. fosforylaoi adeninu, guaninu nebo adenosinu. Jestliže jsou radioaktivní rlbonukleosid-5-difosfáty adeninu a guaninu jedinými požadovanými produkty, je možné s výhodou postupo11
201 337 vat podle obecné metody přípravy radioaktivních nukleosid-5-difosfátů, kterou jsme popsali dříve (viz čs. patent č. 138399).
Izolace radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu z reakčních směsí se provádí po deproteinaci irikubačníoh roztoků chromatografioky. U látek s vysokou molovou radioaktivitou je výhodná papírová chromatografie v některém z těchto rozpouštědlových systémů:
a) 1-butanol - aceton - kyselina octová - 5%ní hydroxid amonný - vóáa (9:3:2:2:4)
b) 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 : 5 : 7 : 2)
c) 1-butanol - kyselina ootová - voda (4:1:5)
Shora uvedenými postupy enzymové syntézy se aplikací polyenzymového preparátu izolovaného z kvasinek Saccharomyces cerevisiae a vhodnou volbou donorů fosforibosylových resp. fosfátových skupin připravují z radioaktivního adeninu, guaninu nebo adenosinu odpovídající ribonukleosid-5-fosfáty, a to bez nežádoucího snížení molové radioaktivity a o požadovaném stupni fosforylace. Způsoby přípráVý těchto radioaktivních nukleotidů, značených v molekule radioizotopy ^C, resp. ^H, jsou uvedeny v příkladech, aniž je tím omezena aplikační šíře použitého principu.
Příklad 1
Enzymová syntéza [u-^^cJadenosin-S-monofosfátu
Směs ^U-^cfjadenosinu (1 yumol,· molová radioaktivita 11 100 MBq.mmol*^), chloridu horečnatého (5 /umol) a guanosin-5-trifosfátu (10 /umol) byla rozpuštěna v 0,6 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 1 hodiny a při 37 °C. Reakční směs byla po termické denaturaci polyenzymového preparátu a jeho odstranění chromatografována preparativně v systému 1-butanol -aceton - kyselina octová - 5%ní hydroxid amonný - voda (9:3:2:2:4)na papíře Whatman o. 3, v sestupném uspořádání, při laboratorní teplotě a po dobu 20 hodin. Konverze adenosinu na [u-^^cJadenosin-S-raonofosfát proběhla na 91,3 %. Vedlejšími produkty reakce byly nezreagdvaný ^U-^cJadenosin a ^U-^cJadenosin-5-difosfát v množství 4,7 % resp. 4,0 % celkové radioaktivity reakční směsi. Qj-^cJAdenosin-5-monofosfát byl z chromatografického papíru eluován destilovanou vodou a jeho radiochemická čistota dále ověřena papírovou chromatografií v dalších rozpouštědlovýoh systémech (1-butanol - kyselina octová - voda /4:1: 5/j 1-butanol -1-propanol - hydroxid amonný - voda /7 : 5 : 7 : 2/; kyselina izolmáselná - hydroxid amonný - voda /66 : 1,5 : 33/), ve kterých byl indetifikován jako radiochemicky čistá látka. Celkově bylo získáno 8,9 MBq Ju-^cJadenosin-5-monofosfátu o molové radioaktivitě 11 lOOMBq.mmol-^, tj. 78 % radioaktivity výchozího |u-^cjadenosinu·
201 337
Příklad 2
Enzymové syntéza £u-14cj adenosinu-5-trifosfátu
Směs £u-14cjadenosinu (1 ^umol; molové radioaktivita 11.100 MBq.mmol“·*·), chloridu hořečnatého (5 /umol), guanosin-5-.trifosfátu (10 /Umol), kreatinfosfátu (7 /umol) a kreatinfosfokinasy (0,02 mg) byla rozpuštěna v 1,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,2 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 6 hodin při 37 °C, Po odstranění polyenzymového preparátu termickou denaturaoí byla reakční směs preparativně ohromatografována stejně jako v předchozím případě (viz příklad 1), Ohromatografiokou analýzou bylo zjištěno že konverze Qj-14cJadenosinu na [u-14cJadenqsÍn-5-trifosfát proběhla na 88 %, dalšími složkami reakční směsi byly fu-14c]adenosin-5-di£os£át a nezreagovaný £u-14C adenosin, v obou případeoh v množství 6 % celkové radioaktivity reakční směsi, Qj-14C Adenosin-5-trifosfát byl z ehromatografického papíru eluován směsí etanol - voda - hydroxid amonný (20 s 78 s 2) a jeho radioohemioká čistota byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozím případě (viz příklad 1). Celkově bylo získáno 8,3 MBq Qj-14cJadenosin-5-trifosfátu, tj. 75 % radioaktivity výchozího |u-14cjadenosinu, a to o radiochemioké čistotě vyšší než 97 % a molové radioaktivitě 11 100 MBq.mmo!
Příklad 3
Enzymové syntéza £adenin-14C/U/Jadenosin-5-trifosfátu
Směs £Ú-14cJadeninu (1 /umol; molová radioaktivita 7 400 MBq,mmol“1), 5-fosfo-«6-D-ribosa-l-difosfátu (4 /uraol), chloridu hořečnatého (30 /Umol), guanosin-5-trifosfátu (20 /umol), kreatinfosfátu (7 /umol) a kreatinfosfokinasy (0,02 mg) bylo rozpuštěno v 1,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 8,0 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saccharomyces cerevisiae po dobu 4 hodin při 37 °C. Po termické denaturaoi a odstranění polyenzymového preparátu byla reakční směs podrobena kvalitativní chromatografické analýzej bylo zjištěno, že konverze £u-14cjadeninu na £adenin-14C/U/]adenosin-5-trifosfát proběhla na 97 % a jedinou další radioaktivní složkou reakční směsi byl nezreagovaný ju-14cjadenin. Reakční směs byla preparativně ohromatografována na papíře Whatman č, 3 v systému 1-butanolu nasyceného vodou, a to po dobu 24 hodin, při laboratorní teplotě a v sestupném uspořádání. jadenin-14C/U/]Adenosin-5-trifos£át byl z ohromatografického papíru eluován směsí etanol - voda - hydroxid amonný (20 : 78 » 2) a jeho radiochemioké čistota byla ověřena papírovou chromatografii ve stejnýoh rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozích případech (viz příklad 1), Celkově bylo získáno 6,07 MBq Jadenin-14C/U/Jadenosin-5-třifosfátu, oož je 82 % radioaktivity výchozího £u-14cjadeninu o molové radioaktivitě 7 400 MBq.mmol“1 a radiochemioké čistotě vyšší než 97 %·
Příklad 4
Enzymová syntéza [e-^cJadenosin-S-monofosfátu
Směs [β-^cjadeninu (8 /umolj molové radioaktivita 1 850 MBq.mmol“1), 5-fosfo-oí*-D-ribosa-l-difosfétu (32 /umol) a chloridu horečnatého (120 yumol) byla rozouštěna v 6,0 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a inkubována s 5,0 ml pólyenzymového preparátu z kvasinek Saecharomyoes cerevisiae při 37 °C po dobu 3 hodin. Inkubace byla ukončena zahřátím reakční směsi ve vrouoí vodní lázni po dobu 3 minut a odstraněním denaturovaného polyenzymového preparátu. Chromatografickou analýzou bylo zjištěno, že reakční směs obsahuje pouze dvě radioaktivní látky, a to Je-^cJadenosin-S-monofosfát v množství 94 % a [θ-14cjadenosin v množství 6 % celkové radioaktivity reakční směsi, Finální směs byla preparativně chromatografována na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanolu nasyceného vodou, a to sestupně po dobu 24 hodin a při laboratorní teplotě. ^8-^4cjAdenosin-5-monofosfát byl z papíru eluován vodou a rechromatografován na papíře Whatman č. 3 v systému 1-butanol - 1-propanol - hydroxid amonný - voda (7 í 5 : 7 : 2), v sestupném uspořádání, při laboratorní teplotě a po dobu 18 hodinj z chromatografiokého papíru byl radioaktivní nukleotid eluován opět destilovanou vodou. Celkově bylo získáno 10,4 MBq radioohemicky čistého ^8-^4cJadenosin-5-monofosfátu, tj. 70 % radioaktivity výchozího [8-14c]adeninu o molové radioaktivitě 1 850 MBq.mmol”1} radiochemická čistota nukleotidu byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předchozích případech (viz příklad 1).
Příklad 5
Enzymová syntéza Jguanin-^C/U/J guanosin-5-monofosfátu
Směs £u-^4c]guanlnu (1 /umol; molová radioaktivita 7 400 MEBq.mmol”^), 5-fosfo-<Zf-D-ribosa-l-difosfátu (4 /umol) a chloridu hořečnatého (15 yumol) byla rozpuštěna v 0,8 ml 0,1 M Tris-HCl pufru o pH 7,5 a inkubována s 0,4 ml polyenzymového preparátu z kvasinek Saecharomyoes cerevisiae při 37 °C po dobu 3 hodin. Po termické denaturaei a odstranění polyenzymového preparátu byla reakční směs preparativně chromatografována na papíře Whatman č. 3 v systému 1-butanol - kyselina octová - voda (4 s 1 : 5) v sestupném uspořádání a při laboratorní teplotě po dobu 18 hodin. Analyticky bylo zjištěno, že reakční směs obsahuje Jguanin-^4C/U/Jguanosin-5-monofosfát v množství 85 %, [guanin-^C/U/Jguanosin v množství 9 % a ju-^4C^guanin v množství 6 % celkové radioaktivity* Radioaktivní nukleotid byl z ohromatografického papíru eluován destilovanou vodou a rechromatografován na papíře Whatman č. 3 v soustavě 1-butanol - aceton - kyselina ostová - 5%ní hydroxid amonný - voda (9 : 3 : 2 s 2 : 4) po dobu 20 hodin, opět v sestupném uspořádání a při laboratorní teplotě. Celkově bylo získáno 4,6 MBq radioohemicky čistého ^guanin-14C/U/Jguanosin-5-raonofosfátu, tj. 62 % radioaktivity výchozího JÚ-^4cJguaninu o molové radioaktivitě 7 400 MBq.mmol“\ radiochemická čistota radioaktivního nukleotidu byla ověřena ve stejných rozpouštědlovýoh systémech jako v předcho14
201 337 zíoh případech (viz příklad 1)·
Claims (1)
- Předmět vynálezuZpůsob enzymové syntézy radioaktivních rlbonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených speoifioký nebo nespecificky radioizotopem ^C, případné ^H, založený na fosforylaoi radioaktivního adenosinu, resp. fosforlbosylaoi radioaktivního adeninu a guaninu a následné fosforylaoi vzniklýoh ribonúkleosid-5-monofosfátů katalytickým účinem enzymů z kvasinek, vyznačený tím, že se enzymová syntéza radioaktivních ribonukleosld-5-fosfátů adeninu a guaninu o požadovaném stupni fosforylace uskutečňuje řízeným způsobem jednostupňovou reakcí, v přítomnosti polyenzymového preparátu z kvasinek Saooharomyoes cerevisiae, v přítomnosti donorů fosforibosylovýoh, resp. fosfátových skupin, s výhodou 5-fosfo-<6 -D-ribosa-l-difosfátu resp, adenosin-5-trifosfátu nebo guanosin-5-trifosfátu, dále v přítomnosti kreatinfosfátu a kreatinfosfokinasy a v přítomnosti hořečnatýoh iontů.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (cs) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (cs) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS201337B1 true CS201337B1 (cs) | 1980-10-31 |
Family
ID=5406560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS604278A CS201337B1 (cs) | 1978-09-19 | 1978-09-19 | Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS201337B1 (cs) |
-
1978
- 1978-09-19 CS CS604278A patent/CS201337B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schnebli et al. | Purification and properties of adenosine kinase from human tumor cells of type H. Ep. No. 2 | |
| Brockman | Biochemical aspects of mercaptopurine inhibition and resistance | |
| NAKAO et al. | Phosphorus metabolism in human erythrocyte III. Regeneration of adenosine triphosphate in long-stored erythrocyte by incubation with inosine and adenine | |
| BENNETT et al. | Purine ribonucleoside kinase activity and resistance to some analogs of adenosine | |
| Bloch et al. | On the mode of action of 7-deaza-adenosine (tubercidin) | |
| BENNETT et al. | Metabolic studies with carbocyclic analogs of purine nucleosides | |
| Bennett Jr et al. | Formation and significance of 6-methylthiopurine ribonucleotide as a metabolite of 6-mercaptopurine | |
| Bennett Jr et al. | Activity of adenos1ne analogs against a cell culture, line resistant to 2-fluoroadenine | |
| Fridland et al. | Tiazofurin metabolism in human lymphoblastoid cells: evidence for phosphorylation by adenosine kinase and 5′-nucleotidase | |
| Raymond et al. | Evidence for the presence of 3′, 5′-cyclic AMP in plant tissues | |
| Suhadolnik et al. | Nucleoside Antibiotics: I. BIOCHEMICAL TOOLS FOR STUDYING THE STRUCTURAL REQUIREMENTS FOR INTERACTION AT THE CATALYTIC AND REGULATORY SITES OF RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE FROM LACTOBACILLUS LEICHMANNII | |
| Berens et al. | Adenosine analog metabolism in Giardialamblia: Implications for chemotherapy | |
| Kimball et al. | Inhibitory effects of the arabinosides of 6-mercaptopurine and cytosine on purine and pyrimidine metabolism | |
| Fan et al. | The conversion of dihydroneopterin triphosphate to sepiapterin by an enzyme system from Drosophila melanogaster | |
| Davis et al. | The enzymatic exchange of the acyl group of acyl dihydroxyacetone phosphate with free fatty acids | |
| Guha et al. | Brain glucose bisphosphatase requires inosine monophosphate. | |
| Remy | Ribonucleotides and ribonucleosides as methyl acceptors for S-adenosylmethionine:(Amino-and thio-) purine methyltransferases: Incorporation of 6-amino-2-methylaminopurine into ribonucleic acids | |
| Gotto et al. | Nucleoside metabolism in Ehrlich ascites tumor cells: Phosphorolysis of purine nucleosides | |
| CS201337B1 (cs) | Způsob enzymové syntézy radioaktivních ribonukleosid-5-fosfátů adeninu a guaninu, značených specificky nebo nespecificky radioizotopem nebo | |
| Paterson et al. | Ribonucleic acid synthesis in tumor homogenates | |
| Ikeda et al. | Multisubstrate analogs for deoxynucleoside kinases. Use in novel affinity media applied to resolution of Lactobacillus enzymes. | |
| Wheeler | Enzymes for purine synthesis and scavenging in pathogenic mycobacteria and their distribution in Mycobacterium leprae | |
| Hill et al. | The purine and pyrimidine metabolism of Tetrahymena pyriformis | |
| Zinchenko et al. | Enzymatic synthesis of nucleoside 5′-mono and-triphosphates | |
| Chiga et al. | The activities of certain nucleoside diphosphokinases of normal and regenerating rat liver |