CS199446B1 - Způsob kultivace chlorokokálních řas zaměřený na intenzivní syntézu radioaktivních sacharidu 0 vysoké specifické aktivitě, značených radionuklidem 14c - Google Patents

Description

Vynález řeší způsob kultivace chlorokokálních řas vhodného typu, zaměřený na intenzivní syntézu radioaktivních sacharidů ό vysoké specifické ak- .

v 14 tivite, značených radionuklidem C.

Příprava radioaktivních sloučenin, značených radionuklidem ¹⁴C, pomocí autotrofních organismů, které využívají radioaktivní kysličník uhličitý jako zdroj uhlíku, ee v současné době ve světě uplatňuje především při výrobě aminokyselin, bílkovin a nukleových kyselin. Některé postupy jsou předmětem patentů (viz. např. čs. patenty 100738, 121808, autorská osvědčení č. 1511, 1512, francouzský patent 7208482), jiné jsou tajeny. Rovněž postupy, používané u výrobců glycidů, značených radioisotopem ¹⁴C, nejsou zveřejněny. Předpokládá se, že i zde se k výrobě požadovaných sloučenin používá autotrofních organismů.

Dosavadní způsob kultivace, kterého československý monopolní výrobce radioaktivních sloučenin -Ústav pri výzkum, výrobu a využití radioisotopů při výrobě radioaktivních glycidů, značených radionuklidem ¹⁴C, používá, ae vyznačuje malou výtěžností cca 1 % z celkové inkorporované radioaktivity.

Předmětem vynálezu je způsob kultivace chlorokokálních ras vhodného typu, zaměřený na intenzivní syntézu radioaktivních sacharidů o vysoké specifické aktivitě, značených radionuklidem ^⁴C, jehož podstata spočívá v tom,

199446 - 2 že kultivace se provádí za teploty 35 až 38 °C..Ke kultivaci se použije populace dcéřinných buněk synchronní kultury, přičemž tato populace prochází _; před zahájením výrobního cyklu prodlouženou temnou periodou cyklu. Při tomto uspořádání pokusu je inhibována syntéza nukleových kyselin a stimulována syntéza glycidů. Během jednorázové, pouze několikahodinové kultivace, které je předpokladem pro přežití organismu, rostoucího v přítomnosti radioaktivního kysličníku uhličitého jako jediného zdroje uhlíku, se dosáhne syntézy významného množství Škrobu a sacharózy, a tím i vysoké specifické aktivity produktů.

Inhibitorem syntézy nukleových kyselin a bílkovin je vysoká pro daný kmen subletální teplota. Potosyntetická aktivita a růstová rychlost jsou stejné jako za optimálních kultivačních podmínek.

Podmínkou zdárného průběhu výrobní kultivace je, aby násada řas, se kterou se výroba začíná, měla požadované vlastnosti. Příprava násady včetně zařízení, ve kterém probíhá, je proto součástí popisovaného vynálezu.

Vzhledem k tomu, že odezva kultivované populace buněk na zásah do jejího metabolismu je různá v různých fázích života buňky», je pro dosažení vysokých výtěžků a získání produktu o vysoké specifické aktivitě nutné použít synchronní populace, tj. populace, ve které jsou všechny buňky ve stejném stadiu životního cyklu. Synchronní kultura umožňuje rovněž regulovat množství glycidů, především škrobu, v buňkách před začátkem kultivace na ^^COg. Toto startovní množství glycidů, které z hlediska dosaženi vysokých specifických aktivit musí být co nejnižší, se reguluje jednak délkou temné periody synchronního cyklu a teplotou, při které dělení mateřských buněk na buňky dcéřinné probíhá, jednak použitím specifických látek, které během temné periody cyklu aktivují působení enzymů, urychlujících štěpení glycidů.

Predkultivace v atmosféře ^^C0₂ i vlastní výrobní kultivace se provádějí v kultivačním zařízení téhož typu. Sestává ze skleněného kultivačního válce s dvojitým pláštěm (meziprostorem protéká chladivo, zajišťující optimální teplotu kultivované suspense) o pracovním objemu 750 ml. Y kultivačním prostoru je suspenze řas vystavena fotosynteticky účinnému záření, přičemž je intenzivně míchána a sycena kysličníkem uhličitým, probublávajícím suspenzí ve směsi COg/vzčuch.

Příslušenství výrobního kultivátoru sestává z :

l) ozařovacího tělesa U-tvaru, osazeného dvěma lampami typu Nitrafot o celkovém příkonu 1,000 W. Vnitřní strany telesa jsou pokryty zrcadlovými plochami, rovněž odrazová zadní stěna jě kryta zrcadlem. Přiložení osvětlovacího U-tělesa k zadní zrcadlové stěně umožňuje úplné uzavření kutivačního válce v prostoru ozařovacího tělesa. Intenzita fotosynteticky účinného zářeni (PAR), dopadajícího na čelní stěnu kultivátoru, se měří fýtoaktinometrem, tj. čidlem, neselektivně citlivým v oblasti fotosynteticky účinného záření v rozmezí 400 až 700 nm a je plynule nastavitelná pomoci transformátoru, regulujícího vstupní napětí.

- 3 199446

2) Yyvíječe ¹⁴C02> zapojeného do okruhu cirkulace směsi C02/vzduch. ¹⁴C02 se uvolňuje ve vyvíječi ze suroviny, kterou je Ba¹⁴C03, dávkováním kyseliny. Do cirkulačního okruhu je zařazen indikátor koncentrace ¹⁴CO2 v plynné směsi, vlastní cirkulace směsi je zajištěna čerpadlem;

3) absorpční nádoby na pohlcení ¹⁴C0₂, která se připojuje do okruhu atmosféry, cirkulující aparaturou, po ukončené kultivaci nebo kdykoliv je třeba kultivaci přerušit;

4) vývěvy, připojené přes absorbér ¹⁴C0₂ na plynný prostor aparatury. Používá se jí pro vytvoření podtlaku, který indikuje těsnost aparatury a znemožňuje únik plynné směsi do vnějšího prostoru;

5) chladicího zařízení, tvořeného ultratermostatem, zapojeným přes kontaktní teploměr, v uzavřeném okruhu s kultivátorem.

Příklad provedení

K výrobní kultivaci se použije chlorokokální řasa Chlorella vulgaris

BEIJBRINCK, kmen OM -12/1975, jejíž kmenová kultura se přechovává ve zkumavkách na šikmých agarech, nasycených minerálním živným roztokem, při teplotě 15 °C a intenzita ozáření 10 W.m² FAR.

a) Příprava kultury

Kultura še z agaru převede do tekutého živného roztoku následujícího složení:

KNO₃, lg.l¹, MgSO4 . 7 H20 1 g.l¹ KH2P0₄ 680 mg.l¹,

Ca(NO₃J₂ . 4 H₂0 10 mg . l¹, chelatonát železito-sodný 18,4 mg.l“¹ (obsah

Fe⁺⁺⁺ 5,6 mg.l¹} , H^BO^ 6,18 mg.l¹ a stopové těžké kovy:

Cu 0,635 mg.l¹, Mn 0,6 mg.l¹, Mo 0,96 mg.l¹, Co 0,59 mg.l¹. K úpravě pH na hodnotu 6,8 se přidává do živného roztoku potřebné množství KOH.

V uvedeném živném roztoku se kultura pěstuje v kultivačním válci o objemu 300 ml při ozáření 50 W.m“², teplotě 27 °C a takové koncentraci C02 ve směsi se vzduchem, která odpovídá 2 % rozpuštěného C02 v suspenzi až do hustoty začátku stacionární fáze růstově křivky (nejčastěji 5 dní). Takto připravena kultura, převedená do kultivačního válce výrobního typu, se synchronizuje. Synchronizace ee provádí metodou střídání period světla a tmy (způsob provedení viz např. DOUCHA: Synchronous cultures; Algal Assays in Eutrophication Monitoring, Stuttgart 1978). Synchronní, po každém cyklu ředěná kultura se pěstuje v rozsahu optických hustot *0,150 (začátek světelné periody) až 1,200 (po rozdělení mateřských buněk na buňky dceřinné) při ozéřenosti FAR 150 W.m², teplotě 27 °C a.2 % rozpuštěného C02 v suspenzi. Za těchto podmínek trvá světelná perioda synchronního cyklu 14 hodin, temná perioda 8 hodin a průměrné specifická růstové rychlost kultury = 0,22 h¹. Po 3-4 cyklech je kultura připravena k výrobní kultivaci.

199446 - 4 Během přédkultivace i výrobní kultivace jsou průběžně sledovány a- korigovány následující údaje:

1) teplota suspenze ; ·

2) pH suspenze

3) koncentrace C0₂, rozpuštěného v suspenzi

4) optická hustota suspenze

5) intenzita FAR, dopadající na povrch

6) kultivační kyvety.

Optická hustota se měří v 5 mm kyvetě při vlnové délce 750 nm na fotometru SPECOL. Znásobíme -li hodnotu optické hustoty koeficientem 0,65, dostaneme -v rozsahu používaných kultivačních hustot populacepřibližnou hodnotu sušiny řas.

b) Výrobní kultivace

Temná perioda posledního předvýrobního synchronního cyklu probíhá po dobu 13 hodin. Hodinu před ukončením temné periody cyklu se ve výrobním kultivačním válci připraví 750 ml nového živného roztoka, který je zbaven veškerého fyzikálně rozpuštěného neradioaktivního kysličníku uhličitého. Poté se nasytí roztok radioaktivním kysličníkem uhličitým (rovnovážný stav v suspensi rozpuštěného ¹^‘C02 s atmosférou obsahující 2 % ¹^C02 nastane asi po 30 minutách intenzivního probublávání). Po nasycení se do válce vpraví takové množství proaytého rasového inokula, aby startovní hustota suspense byla 400 mg Sušiny.ml“¹. Inhibice syntézy nukleových kyselin a proteinů, doprovázenou následnou intenzivní syntézou glycidů, se dosáhne kultivací při vysoké, pro daný kmen subletální, teplotě v rozmezí 35 až 38 °C, při které proběhne na svetle vlastní šestihodinový výrobní cyklus. Počáteční ozárenost 130 W.m „ · . —2

FAR se po čtvrté hodině zvýši na 180 W.m FAR. Po ukončení kultivace se suspenze řas ochladí na 2 °C a při této teplotě eentrifuguje. Získaný rasový sediment je výchozím radioaktivním produktem pro vlastní zpracování. Průběh syntézy škrobu a sacharózy, vyjádřený v jag/ml suspenze a v procentech sušiny ras, je uveden na obr. 1 a 2. Specifická aktivita sacharózy a glukózy po hydrolýze Škrobu v průběhu kultivace je uvedena na obr. 3.

Claims (1)

1. Předmět vynálezu

   Způsob kultivace chlorokokálních řas, zaměřený na intenzivní syntézu radioaktivních sacharidů o vysoké specifické aktivitě, značených radionuklidem ^l4C, vyznačený tím, že se kultivace provádí za teploty 35 až 38 °C a ke kultivaci se použije populace dcéřinných buněk synchronní kultury, přičemž tato populace prochází před zahájením výrobního cyklu prodlouženou temnou periodou cyklu.