CS199433B1 - Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy - Google Patents
Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy Download PDFInfo
- Publication number
- CS199433B1 CS199433B1 CS269178A CS269178A CS199433B1 CS 199433 B1 CS199433 B1 CS 199433B1 CS 269178 A CS269178 A CS 269178A CS 269178 A CS269178 A CS 269178A CS 199433 B1 CS199433 B1 CS 199433B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- activity
- isoenzyme
- amylase
- isoenzymes
- total
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title claims description 6
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims description 6
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 title claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 50
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 19
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 18
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 18
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026375 Salivary gland disease Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu oddělování isoenzymů alía-amylázy, vhodného ke stanoveni aktivity isoenzymů alfaamylázy v krvi a v moči u lidí.
Alfa-amyláza je .diagnosticky velmi významným enzymem. V klinické praxi má své stálé místo již po.dobu více než půl století. Pro stanovení celkové aktivity enzymu v krvi a v moči byla vypracována řada metod,, jako například' amyloklastická, aacharogenní, nebo nefelometrická, nebo dnes. nejužívanějSi .... metoda s barevným substrátem. Celkovou aktivitu amylázy v krvi i v moči tvoři aktivity dvou isoenzymů, označovaných jako S-isoamyléza (zpravidla přítomná ve slinách, méně přesněji označovaná jako slinný isoenzym amylázy) a P-isoamyláza (pankreatický isoenzym, přítomný ve slinivce břišní).
Dosavadní známé postupy oddělení obou isoenzymů byly buď jen kvalitativ- . ní, tedy bez možnosti kvalitativního hodnocení aktivity isoenzymů, nebo to byly postupy časové a přístrojově náročné. Za kvantitativně hodnotitelné nelze považovat hodnocení isoenzymů. po jejich rozdělení elektroforézou, nebo , elektrofokusací v gelu, pokud se hodnotí zóny aktivity enzymu vizualizované jodóškrobovou reakcí, nebo reakcí s barevným substrátem přímo v dělicím nosiči, např. agaru nebo pólyakrylámidovém gelu. Příkladem jsou drive publikované metody (Berk, J.E., Hyashi, S., Searcy, R.L., Amer, J. Digest. Dis* 11, 695,1966, nebo Long, W.B., Grider, J.R., Gastroenterology 71, 589,1976).
Stejně málo přesná je i eluce isoenzymů amylázy z gelu po jejich elektrofóretickém oddělení, a následné stanovení aktivity v eíuátech. Preparátivní elek199433
- 2 troforézy se ke stanovení aktivity isoenzymů amylézy rovněž nepoužívá. Důvodem je časová a přístrojová náročnost postupu.
Kvantitativní stanovení aktivit isoenzymů amylázy umožňují zatím dva způsoby. První publikovali Fridlander, L.> Berk, J.E., Ueda, M., Clin, Chem. 18,1493,1972. Užívá ee nejprve pasáže směsi isoenzymů, t.j. krevního séra nebo moči, kolonou s organickým gelem. Získaný eluát s enzymovou aktivitou se pak nanáší na kolonu dextranového gelu s navázanými diethylaminoethylovými skupinami. Eluce sa provádí pufrem s přídavkem chloridu sodného, při čemž se S-isoenzym amylázy vzhledem ke svému elektronegativnějšímu náboji opožďuje za isoenzymem P. Elučni profily obou isoenzymů se překrývají, oddělují se tedy nedostatečně. Další nevýhodou je časová náročnost, protože se sbírá více než 50 frakcí z každé kolony a aktivita amylázy se stanovuje v každé frakci. S tím souvisí i náročnost na přístrojové vybavení a na citlivost metody, kterou se stanoví amylázová aktivita. Z uvedených důvodů se metoda neosvědčila jako rutinní. , .
Druhá kvantitativně hodnotítelná metoda byla publikována v ropě 1977 (0'Donnell, M.D., FitzGerald, 0,, McGeehey, K.F., Clin. Chem. 23, 560, 1977) Využívá různého stupně inhibice pankreatického a slinného isoenzymů amylázy v séru inhibitorem bílkovinné povahy, isolovaným ze pšenice, širšímu využití metody zatím brání jednak obtížná dostupnost inhibitoru, jednak použitelnost metody jen pro odlišení isoenzymů v séru, nikoli v moči. Vedle toho zatím nejsou uveřejněné výsledky u zdravých osob v plném souhlase s dosud známými literárními údaji. ...
Uvedené nedostatky odstraňuje způsob oddělování isoenzymů alfa-amylázy podle vynálezu. Jeho podstata spočívá v .tom, že se směs isoenzymů nanese na diethylaminoethylcelulózu, z niž se pankreatický isoenzym jednorázově eluuje do jediného objemu pufru, kterým je diethylaminoethylcelulóza ekvilibrována, načež se stanoví aktivita' pankreatického isoenzymů amylázy, s výhodou fotometricky, přičemž aktivita slinného isoenzymů, který zůstal vázán na diethyl aminoethylcelulóze, tvoří zbývající podíl z celkové aktivity.
Účinky způsobu podle vynálezu spočívají V jednoduchosti provedení, které je vhodné pro kterýkoli typ klinicko-biochemické laboratoře s běžným typem vybavení. Získá se kvantitativní forma výsledku, umožňující i dynamické hodnocení rozvoje změn aktivit isoenzymů během onemocnění pacienta. Další výhodou je časová úspornost, umožňující získat výsledky do 40 minut od odběru materiálu, s možností provádění několika analýz současně. Náklady na analýzu jsou pouze dvojnásobné v porovnání se stanovením pouze celkové aktivity enzymu, přičemž jsou použitelné běžné metody s barevným súbstrátém.
Způsob podle vynálezu se uplatní hlavně v. diagnostice onemocnění sliniv ky břišní a slinných žláz. U příušnic může docházet k onemocnění nejen slinných žláz, ale i například slinivky břišní. Postižení slinných žláz se podle klinického obrazu hodnotí dobře, zvýšení celkové aktivity alfa-amýlázy je zde obvyklé a připisuje se zpravidla aktivitě S-isoenzymu. Zvýšení celkové
- 3 199433 aktivity enzymu však může být podmíněno i zvýšenou aktivitou P-isoenzymu, pokud došlo k zánětu slinivky břišní. Tato komplikace se klinicky projeví až při těžším průběhu. Její včasné rozpoznání na základě vyšší aktivity P-isoenzymu může předejít komplikacím a umožní včasné zahájení cílené léčby. Stanovení aktivity isoenzymů amylázy se uplatňuje i při samotném onemocnění slinivky břišní. Při akutním zánětu má význam pro posuzování průběhu onemocnění, protože zvýšení aktivity P-isoenzymu přetrvává déle než zvýšení celkové aktivity amylázy. Diagnostický význam má déle nález zvýšené aktivity P-isoenzymu při chronickém zánětu slinivky břišní, kdy celkové aktivita může být v mezích normy· Naopak snížená aktivita P-isoenzymu může být i projevem poruchy zevně sekreční funkce žlázy. Chybění aktivity P-isoenzymu koncem prvního roku věku dítěte je cenné pro diagnostiku cystické fibrosy slinivky břišní. Stanoveni aktivity isoenzymů amylázy může napomoci i při vyšetřeni nemocných s rakovinou slinivky břišní. Způsob podle vynálezu se uplatní také při stanovení rychlosti, jakou je krev od jednotlivých isoenzymů očišťována, což je diagnosticky opět velmi cenný ukazatel.
Způsob podle vynálezu je v dalším blíže popsán na příkladu provedení.
Příklad
Byla použita kolona diethylaminoethylcelulosy a tris-(hydroxymethyl) -aminoraethanový pufr. Kolona se ekvilibruje pufrem. Na sloupec se nanese 0,1 ml směsi isoenzymů (krevní sérum, moč). Sloupec se promyje pufrem do konečného objemu eluátu 4,2 ml. V eluátu se stanoví aktivita amylázy, teda P-isoenzymu amylázy tak, že se k eluátu přidá tableta substrátu, protřepe, inkubuje 15 min. při 17 °C, reakce se ukončí, v supernatantu se fotometricky stanoví množství uvolněného barviva a z kalibrační křivky ee odečte odpovídající aktivita enzymu. Stejně ae provede stanovení celkové aktivity amylázy v původní směsi isoenzymů v séru nebo v moči po neředění 0,1 ml vzorku směsi isoenzymů pufrem do objemu 4,2 ml. Z rozdílu celkové aktivity a kativity pankreatického isoenzymů se propočte aktivita slinného isoenzymů, který se za uvedených podmínek zcela vázal na koloně. Pokud je žádoucí vyjádření aktivity arayláz za konvenčních podmínek, kdy se enzým ředí vodou a nikoli zmíněným pufrem, použije se zjištěné relativní zastoupení obou isoenzymů na celkové aktivitě k propočtení aktivit z hodnoty celkové aktivity, stanovené za standardních podmínek.
Podle příkladu bylo na kolonu naneseno 0,1 ml krevního séra nemocného s příušnicemi. V eluátu byla stanovena aktivita P-isoenzymu 160 U/l, celková aktivita při ředění séra pufrem byla 880 U/l. Aktivita slinného isoenzymů tedy činila 880 - 160 = 720 U/l. Celková aktivita amylázy v séru stanovená konvenčním způsobem činila 760 U/l. Poměrné zastoupení pankreatického isoenzymu bylo 18,2 % z celkové aktivity, aktivita pankreatického isoenzymů vypočítaná ze standardně stanovené amylázové aktivity činila 138 U/l, aktivita slinného isoenzymů 622 U/l.
Claims (1)
- Způsob oddělování isoenzymů alfa-amylázy vyznačený tím, že se směs isoenzymů -nanese na.diethylaminoethylcelulóžu, z níž se P-isoenzym jednorázově eluuje do jediného objemu pufru, kterým je diethylaminoethylcelulóža ekvilibrnvána, načež Se stanoví aktivita P-isoenzymu v eluátu, s výhodou fotometricky, přičemž aktivita S-isoenzymu, který zůstal vázán na diethylaminoethylcelulóze, tvoří zbývající podíl z celkové aktivity.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS269178A CS199433B1 (cs) | 1978-04-26 | 1978-04-26 | Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS269178A CS199433B1 (cs) | 1978-04-26 | 1978-04-26 | Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS199433B1 true CS199433B1 (cs) | 1980-07-31 |
Family
ID=5364740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS269178A CS199433B1 (cs) | 1978-04-26 | 1978-04-26 | Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS199433B1 (cs) |
-
1978
- 1978-04-26 CS CS269178A patent/CS199433B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Evaluation and comparison of immunoinhibition and immunoprecipitation methods for differentiating MB and BB from macro forms of creatine kinase isoenzymes in patients and healthy individuals. | |
| Lee et al. | Relevance of macro creatine kinase type 1 and type 2 isoenzymes to laboratory and clinical data | |
| Berg et al. | Binding of α-bungarotoxin to acetylcholine receptors in mammalian muscle | |
| KR101222437B1 (ko) | 바이오마커 | |
| US20040126826A1 (en) | Device for measuring an analyte | |
| Tietz et al. | Multicenter evaluation of a specific pancreatic isoamylase assay based on a double monoclonal-antibody technique. | |
| Ellis et al. | Evaluation of an inhibitor assay to determine serum isoamylase distribution | |
| DE60217665T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Thymidinkinase-1 und dessen Verwendung | |
| JPS61170400A (ja) | 酵素阻害によるテオフイリンの分析用分析素子，組成物および方法 | |
| Tadepalli et al. | Differential assay of zidovudine and its glucuronide metabolite in serum and urine with a radioimmunoassay kit | |
| US4309188A (en) | Method for the clinical separation of α- and β-lipoproteins | |
| CS199433B1 (cs) | Způsob oddělovaní isoenzymu alfa-amylázy | |
| Butch et al. | Stratus automated creatine kinase-MB assay evaluated: identification and elimination of falsely increased results associated with a high-molecular-mass form of alkaline phosphatase. | |
| US4458013A (en) | Method for the immunoassay of elastase-1 and a set of reagents for such immunoassay | |
| Siegel et al. | Immunoreactivity and ouabain-dependent phosphorylation of (Na++ K+)-adenosinetriphosphatase catalytic subunit doublets. | |
| Chapelle et al. | Automated quantification of creatine kinase MB isoenzyme in serum by radial partition immunoassay, with use of the Stratus analyzer | |
| Eisenberg et al. | Concordance of creatine kinase-MB activity and mass. | |
| Tozawa | Electrophoretic analysis of enzyme-linked immunoglobulins and their clinical significance | |
| Elser et al. | Creatine kinase B-subunit activity in human sera: temporal aspects of its sensitivity after myocardial infarction. | |
| US20100041079A1 (en) | Method for predicting cardiovascular events | |
| Keshgegian et al. | Cathodal bands in electrophoretograms of creatine kinase isoenzymes in serum collected after cardiac surgery: a poor prognostic sign. | |
| Matsushita et al. | Specific gel electrophoresis method detects two isoforms of human intestinal alkaline phosphatase | |
| Henderson et al. | Anomalous response of macroamylase to assay temperature | |
| Bondar et al. | Improved separation of creatine kinase isoenzymes by use of DEAE-Sepharose Cl-6B. | |
| US6989240B2 (en) | Method for detecting hemolysis |