CS197101B1 - Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof - Google Patents
Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CS197101B1 CS197101B1 CS532177A CS532177A CS197101B1 CS 197101 B1 CS197101 B1 CS 197101B1 CS 532177 A CS532177 A CS 532177A CS 532177 A CS532177 A CS 532177A CS 197101 B1 CS197101 B1 CS 197101B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- aggregates
- activity
- enzyme
- wet
- Prior art date
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims description 10
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 84
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 22
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 137
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 109
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 11
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N deuterio(phenyl)methanone Chemical compound [2H]C(=O)C1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N 0.000 claims 1
- 239000003502 gasoline Substances 0.000 claims 1
- 150000005171 halobenzenes Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 claims 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium atom Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 7
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 abstract description 6
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 abstract description 6
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 abstract description 3
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 abstract 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 60
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 17
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 16
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- FCPVYOBCFFNJFS-UHFFFAOYSA-N sodium;3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound [Na+].O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 2
- 241000187419 Streptomyces rimosus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1-phenylpropan-2-one Chemical compound CC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCFUWBOSXMKGIP-UHFFFAOYSA-N 2-benzylpyridine Chemical compound C=1C=CC=NC=1CC1=CC=CC=C1 PCFUWBOSXMKGIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N D-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- ZYZWOSIRFVIBRH-UHFFFAOYSA-N chloroform;cyclohexane Chemical compound ClC(Cl)Cl.C1CCCCC1 ZYZWOSIRFVIBRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010409 ironing Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- CKHOZVOPYJLCNY-UHFFFAOYSA-N methanol;prop-2-enal Chemical compound OC.C=CC=O CKHOZVOPYJLCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/16—Enzymes or microbial cells immobilised on or in a biological cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/06—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by desacylation of the substituent in the 6 position
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(54) Mikr.Oiální buněčné agregáty k přeměně penicilínu na kyselinu(54) Mic Oial cell aggregates to convert penicillin to acid
6-aminopen.iiiliánovou a způsob jejich přípravyAnd a process for their preparation
Vynález se týká mikrobiálních buněčných agregátůfobsahujících buňky s vysokým obsahem enzymu penicilinliylázy,rteré jsou vázány navzájem nebo na buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou buá celé,neporušené anebo fyzirálně,chemicky či biochemicky ošetřené buňky nebo jejich nerozpustné fragmenty>chemiikk,koovlentní vazbou a způsobu jejich přípr^fi^vy.Mi^i^r^l^J^é^lní buněčné agregáty jsou použitelné k přípravě 6-lminopeniciliгmové kyseliny enzymovou hydrolýzou penicilínu,zjjména bank^ení-cilínu, přččemi jejich vllstnosti,zjjménl chemicky vysoce stabilizovaná enzymová aktivita,dobré sedimentační a mechanliré vlastnosti,dovoluj jejich dlouhodobé pobití na principu enzymového reakto:iui,v8ákoov<é nebo kontinuálním způsobem,podle volby technologie enzymové hydrolýz.ytresp.volby typu reaktoru^ následnou izolací 6-^^^6^0iliánové kyseliny úpravou pH a teploty z čiré rapplinyyresužtujíií po jejich snadném oddělení.The invention relates to microbial cell aggregates f containing cells with a high content of penicillinliylase, which are bound to one another or to cell carriers of different kinds of organisms, which are either whole, intact or physically, chemically or biochemically treated cells or insoluble fragments thereof. and methods for their preparation. The cell aggregates are useful for the preparation of 6-aminopenicillinic acid by the enzymatic hydrolysis of penicillin, in particular of the banking-cillin, despite their properties, particularly chemically highly stabilized enzyme activity and mechanliré good sedimentation properties permit their long term slaughter on the principle of enzyme reactivity: IUI v8ákoov <é or continuous process, the choice of enzyme technology hydrolýz.ytresp.volby-type reactor followed by isolation of 6 - ^^^ ^ 6 0iliánové acid by adjusting the pH and temperature of the clear rapplines is enhanced by p about their easy separation.
Běžně známé způsoby přípravy 6-amino oceli iliEmové kyseliny ^-APK^kkerá je důležité meziproduktem pro připraví tzo.polovyitetcckých penňcilínů,jsou v podssatě čtyř základních typů, priČemi každý z nich má své výhody a nevýhody a tím ekonorněckílimity.Conventionally known processes for preparing 6-amino steel of β-APK, which is an important intermediate for the preparation of tzo-polysetetic pennillins, are in a subset of four basic types, each of which has its advantages and disadvantages, and hence the economical stability.
Jednorázové pouužCí nativních buněk eikroorganiseύfoOivahjjcíih aktivní enzym penicClCiacylázu k enzymové přeměně nebo fenoxymthylpeniiilínu na 6-APK; např.NCR patentový spis č.l 114 766 uvádí jednorázové pouužtí nativních buněk E.coli ke štěpení benzylp^i^í^c^íIí^í^u. .Disposable pouužCí native cells eikroorganiseύ f oOivahjjcíih penicClCiacylázu active enzyme or enzymatic conversion to 6-fenoxymthylpeniiilínu APK; For example, NCR Patent No. 1,114,766 discloses a one-time use of native E. coli cells to cleave benzyls. .
Podstatnou nevýhodou vyiužtí tohoto postupu v praxi je požadavek stálé a opakované přípravy těchto buněk novou kultivací ve velkokapacitním fermentačním zařízení,nebot buňky se nedajíA significant disadvantage of using this procedure in practice is the requirement for constant and repeated preparation of these cells by re-cultivation in a large-scale fermentation plant, since the cells cannot be
197 101197 101
197 101 použít op akovvai ^nehledě na skutečnost kontaminace produktu bílkovinami z autolysovaných buněk a zbytky kultivační kapaliny a z toho vypllýrvjící složitosti volby vhodného izolačního postupu.197 101, regardless of the fact that the product is contaminated with autolysed cell proteins and culture fluid residues and the resulting complexity of choosing a suitable isolation procedure.
Chemický způsob přípravy б-APK z penicilínu; . tento způsobjdiskuitovímý např.v přehledném článku TRCcrringtona (Proč.R. Soc.Lond.B. 179. 321-333· 1871)je ekonomicky velice náročný^zejména pro nutnost chemického chránění skupin lenicilíiž,dále pro nutnost pobití velmi nízkých 'teplot reakční směsi při chemické hydrolýze (kolem -50 °C)„v neposlední řadě pro pobití velkého mnnoisví organických rozpouštědel s omezenou moonnosí jejich regenerace a konečně pro použití agresivních látek,které-přispívají ke značnému a rychlému opotřebení výrobní aparatury vlivem koroze.Výhodou tohoto postupu však je moonoet přípravy kvalitní 6-APKtniobiaahžící balastní bílkovinné příměsi a možnost hydrolýzy vysokých ^^β^^οί lenicilíiž s dobrý výtěžkem v izolačním stupni.Chemical method of preparing β-APK from penicillin; . This method of discovery, for example in a review article by TRCcrrington (Proc. R. Soc.Lond.B. 179. 321-333 · 1871), is economically very demanding, especially because of the need for chemical protection of the lenicile groups, as well as the necessity of killing very low temperatures. in chemical hydrolysis (about -50 ° C) "not least for killing a large number of organic solvents with limited moonnosity of their regeneration and finally for the use of aggressive substances, which contribute to a considerable and rapid wear of the production apparatus due to corrosion. moonoet preparation high-quality 6-APK t niobiahni ballast protein admixtures and the possibility of hydrolysis of high ^^ β ^^ οί lenicilie with good yield in the isolation stage.
Způsob přípravy б-APK fyzikálně nebo chemicky zmobilizovanou lenlcllinaβylázož na nejrůznější anorganické, umělé organické nebo přírodní m^at^e^riály.Pr^o vazbu na tyto nosiče je používáno do různého stupně čištěných preparátů penicilinacylázy,zíkaných z buněk mikroorganismů relati^ně drahý ó,s ložit ými a hlavně ztráoovýi postupy.Tak napRČs. patentový spis 6.145 849 uvádí postup čištění lenicilliaβylázy a její vazby na ncsi^Tato mnibootulňboá příprava končí ziskem cca 30 % . původního mrnossví enzymu o Čistotě technického preparátu peniciliiaLβylázy 10 ai 20 .,vztaženo na čistý enzym.Tento technický preparát enzymu pak slouží k vazbě na některé nosiče např.ρolysaβharidového typu (komerčně dostupné pod názvem Sepharose) po jejich předchozí chemické aktivaci bromkyanem.A process for the preparation of physically or chemically mobilized cellulose lipases for a wide variety of inorganic, artificial organic or natural materials. Binding to these carriers is used to varying degrees of purified penicillin acylase preparations recovered from cells of microorganisms relatively expensive. Oh, with diligent and, above all, loss-making procedures. U.S. Pat. No. 6,145,849 discloses a process for purifying lenicillia-pylase and its binding to ncsi. This multiboot preparation results in a yield of about 30%. This enzyme preparation is then used to bind to certain carriers of, for example, polyol-beta-type (commercially available under the name Sepharose) after their prior chemical activation with cyanogen bromide.
Nosiče tohoto a podobných typů jsou velice drahé,které náklady na vázaný enzym zvyš^í do té míryrie jen cca 200 násobné pobití vázaného enzymu ve srovnání s jednorázový použitím nativních buněk přináší lepší efektioost.Lioitžjícíoi ekonomickými faktory při.tomto způsobu výroby jsou tedy cena a dostupnost nosiče^em zaurnuící aktivaci nebo moíi^ik^i^:! nosiče a technologie izolačního postupu enzymu (cena preparátu) ve vztahu k dlouhodobé stabilitě a účinnooti opakovaně nebo kontinuálně využívaného zmobilizovaného enzymu pro přípravu 6-AMGPři tomto způsobu výroby je předností dobrá kvaHta 6-AJPKprosté biologických příoOstttrbonateliá s chemickým způsobem výroby a - podle některých údajů z časopisecké a patentové literatury,také jednoduchá izolace a dobrý výtěžek produktu.Carriers of this and similar types are very expensive that the costs of the enzyme-bound ^ i to the point r ie only about 200 fold slaughter bound enzyme as compared with single use of native cells yields better efektioost.Lioitžjícíoi economic factors při.tomto manufacturing method therefore the cost and availability of the carrier for activation or moiety; carriers and Technology isolation procedure the enzyme (rate of the preparation) in relation to the long-term stability and účinnooti repeatedly or continuously utilized the immobilized enzyme preparation of 6-AMGPři this production method, the advantages of good kvaHta 6 AJPKprosté biological příoOst t trbonateliá chemical production process, and - according to some data from magazine and patent literature, as well as simple isolation and good product yield.
Příprava б-APK fyzikálně nebo chemicky imobilizooanlýi buňkami produkčních mikroorganismů obsa^ícími penicilínacylázu. Tento způsob je zatím ne jméně prozkoumán a pokud je známOozatím není ve výrobním měřítku vyšíván.0 způsob vybití ioobilizovaných enzymově aktivních buněk jako biokatalyzátorů je zejména v několika posledních letech nebývalý zájem (E.J.Vnnamfme,Chem. Ií1..1076· 1976) a to z evidentních ekonomických důvodй,ieio:L při tomto způsobu odpadá především náročná a ztrátová technologie čištěni a izolace enzymu a větší ztráty jeho - aktivity během im^o^íi^:izace.Preparation of β-APK by physically or chemically immobilizing cells of production microorganisms containing penicillin acylase. This method has not yet been investigated by name and, as far as is known, the method of discharging ioobilized enzymatically active cells as biocatalysts has been unprecedented in recent years (EJVnnamfme, Chem. III. 1076 · 1976). economic důvodй, ieio: L in this method eliminates the difficult and especially lossy technology to purify and isolate the enzyme, and a greater loss - activity during im ^ o ^ ii ^: ISATIO.
Je popsáno fyzikální uzavření m^i^k^(^l^i^i^:Lních buněk ob aaarn ujcích leniciliiacylázž^a to nati v» nich nebo částečně narušených toluenem^ agarboýoh granulí (^.patentový spis . Č.113 soehdále nativních buněk do poly(akrylmzdového) gelu (TS^^to, T.Tosa· I.Chibata, Europeeal.J.Appl·MicrbííoI.,2, 153· 197i6) nebo do vláken triacetátu celulosy (D.Dinneli· - Pro^Biochem. J, 9, 1972)·There is described the physical closure of mucoid cells containing cerebellar cell lysates, either in or partially disrupted by toluene or agglomerate granules (U.S. Pat. No. 113, particularly native). cells into a poly (acrylic wax) gel (TS ^^ to, T.Tosa · I.Chibata, Europeeal.J.Appl · Micrbííl., 2, 153 · 19716) or to cellulose triacetate fibers (D.Dinneli · - Pro ^ Biochem J, 9, 1972)
Uvedené způsoby nejsou výhodné z hlediska průmyslového vybití,nebbí při tomto způsobu je rychlost enzymové reakce silně limitována difúzí dvojí difuzní bariérou (gel a buněčná stěna),Said methods are not advantageous from an industrial discharge point of view, since in this method the rate of enzyme reaction is strongly limited by diffusion through a dual diffusion barrier (gel and cell wall),
197 101 dochází k nepříznivému vytvoření gradientu pH lokální .kumižací produktů reakce (6-APK a kyseliny fenyloctové) a tím k inhikici reakce,v důsledku čehož se snižuje reakční rychlost a stupen hydrolýzy penicilínu a reakce se zastavuje obvykle na nízkém absolutním . výtěžku (40 až 70 %) při poměrně nízkých koncentracích štěpeného penicilínu (1 až 4 £).Další nevýhodou fyzikálního uzavření nativních buněk do gelové matrice je^že buňky v průběhu opakovaného použití lysují, takže se z nich enzym spolu s balastními bílkovinami uvolňuje,čímž se snižuje rychlost a účinnost enzymové transfomace a také CvO-ita produktu v důsledku obsažených bílkovin.In addition, the pH gradient of the reaction products (6-APK and phenylacetic acid) is unfavorably formed and thus the reaction is inhibited, thereby reducing the reaction rate and degree of penicillin hydrolysis, and the reaction is usually stopped at a low absolute. Another disadvantage of the physical closure of the native cells into the gel matrix is that the cells lysed during reuse, so that the enzyme and the ballast proteins are released from the cells, thereby reducing the rate and efficiency of the enzyme transformation as well as the CvO-ita product due to the proteins contained therein.
Dále je popsán chemický způsob ' imooilizace buněk mikroorganismů pro dudlících p^t^Cc^ííLícacylázu na umělé organické Vazba buněk na organický polymer syntetického původu se ' provádí smíšením s následnou chemickou reakcí buněk ve vodné suspenzi s cejčastěji sfércck^fai částicemi polymeru (získanými cíleně vedenou polymeraí ),jenž obsahuje skupiny chemicky aktivní ke skupinám povrchu bшΊtk.Renužluží polym mírní částic^Cteré nesou'celé buňky připojené chemicky» pravděpodobně kovaaentní vazbou^hemický způsob imobíiizace buněk různých mikroorganismů na umělé organické ^a^S<^]r4^1y vedoucí k preparátů^ použitelných k nejiůznějším enzymovým transformacím je popsán v NSR patentovém spisu DOS 2 513 929 a rovněž je známý výhradně k přípravě 6-APK.Further described is a chemical process for the immobilization of microorganism cells for pacifiers for artificial organic binding of cells to an organic polymer of synthetic origin by mixing with subsequent chemical reaction of the cells in aqueous suspension with the most commonly spherical polymer particles (obtained by targeting). Certain non-cellular cells attached chemically, probably by a covalent bond, to the chemical method of immobilizing cells of various microorganisms to artificial organic species. leading to preparations useful for a wide variety of enzyme transformations is described in German Patent Specification No. 2,513,929 and is also known exclusively for the preparation of 6-APK.
Postup imooilizace enzymově aktivních buněk podle NSR patentového spisu DOS 2 513 929 spočívá v reakci buněk s reakti^nTÍm monomerem a v následné polymeraci nebo kopolymeraci nebo s glycidylmnthaCrylátivým polymeremtpopřípadě v kombinaci s kovalentní fixací enzymů uv^n^ltř buněk vhodným bifunkčním činidlem.Procedure imooilizace enzymatically active cells according to German Patent Application DOS 2,513,929 involves reacting the cells with reactivity ^ NTIME monomer and subsequent polymerization or copolymerization or glycidylmnthaCrylátivým polymer t optionally in combination with covalent fixation of enzymes uv ≤ n ≤ LTR cells with a suitable bifunctional reagent.
Známý postup přípravy a využití pevného biokatalyzátoru k přeměně ienzzCpuntiilinž na 6-APK spočívá ve vazbě hyperprodukčních mmlant J.coli obsíanuících vysoké mno^v! ^№.0111^acylázy na sférické částice syntetických polymerů především na bázi mmehí-acrylaldehydu (aktivní aldehydové skupiny^glycidylmethakrylátu (aktivní epoxidové skupiny) apod.,a to tak^e se polymer nejprve ošeuří amineimčímž se převede na příslušný abinopolyber a následné navázání buněk na povrch částice se provede pomocí bifimkčního činidla. Dlžlhlodlbá enzymová stabilita a účinnost získaných preparátu zmobilizovaných buněk při opakovaném použití pro hydrolýzu 7% (hmotai/objem) vodných roztoků solí na 6-APK v míchaném reaktoru a dobré sedimentační a mmehírnické vlastnosti u^c^Orí^^žjí průmzslové vyžití.A known process for the preparation and use of a solid biocatalyst to convert ienzzpuntiillin to 6-APK involves the binding of hyperproductive microns of coli containing high amounts. Acylases for spherical particles of synthetic polymers, in particular based on methanol-acrylaldehyde (active aldehyde groups of glycidyl methacrylate (active epoxy groups) and the like, so that the polymer is first treated with an amine and then converted to the appropriate abinopolyber and subsequent cell binding Long-term enzyme stability and efficacy of the obtained re-used mobilized cell preparation for the hydrolysis of 7% (w / v) aqueous salt solutions to a 6-APK in a stirred reactor and good sedimentation and ironing properties. Orí ^^ live industrialization.
Zjistilo se супС^п pro vazbu buněk s vysoký^ obsahem pentcilitlαcylázy lze použit nejrůznějších mikroorganismů nebo jejich fragbentй,ktnré lze pro daný účel připravit cílenou СлИ^гЕvací. S výhodou lze použžt odpadních m.ae^i^r.álů mikroorganismů (odpadní biomasy) po fermentačních výrobách jakéhokoliv drUhu.Naαu.lzn použít odpadních kvasinek po výrobě piva,odpadního mrcceia při výrobě antibioiCk,mϊCnokytnltn,tzc;mU nebo ' odpadního buněčného maatriálu v podstatě po jakékoliv průmyslové biltrιnt80omιaci·Poslupem podle vynálezu lze tak mnohonásobně ekonomizovat výrobu 6-APK tímto způsobem^ebol cena buněk mikroorganismů jako c^íču je z«^<^<^I^í^S(^:lná ve srovnání s ja^ký^^^cOiLv uměle připravcnjfa nosičem syntetického nebo přírodního původu,v případě po^lžtí odpadní mikrobiální biomasy po většině výrob je převážně nullvá,nnboí s likvidací buněčného odpadu mmaí výrobní uoddtkcczviáště farbasenžické,čatto řeší odvozem těchto mmaeriálů do zemmačlských podniků ke hnojení polí čí k přidávání do krmných smměí, popřípadě spalováním.It has been found that a variety of microorganisms or fragments thereof can be used to bind cells with a high content of pentcilityl acylase and can be prepared for this purpose by targeted targeting. Preferably, waste materials of microorganisms (waste biomass) can be used after fermentation processes of any kind. It is possible to use waste yeast after beer production, waste carcass in the production of antibiotic, mercury, heavy cell waste or cellular waste. By virtue of the process of the present invention, the production of 6-APK in this way can be economically multiplied in this way, because the cost of the microorganism cells as a scavenger is less than that of the microorganisms. As the artificially prepared carrier of synthetic or natural origin, in the case of the field waste microbial biomass after most of the production is mostly null, or with the disposal of cellular waste, the production is largely farbasenical, and this is solved by the transfer of these materials to fertilizers. to be added to the fodder or by incineration.
Podesata vynálezu spočívá ve vyžiti mikrobiálních buněk a jejich fragmentů jako nerozpuit197 101 nýoh nosičů pro vazbu . mikrobiálních buněk obalujících požadovaný enzy^prostřednictvím do reakce vstupujícího bifunkčního činidla,glutrrdialdehydu.Kovalentní vazba mezi buňkou vázanou a buňkou nebo jejím fragmentem mmjící charakter nerozpustného noí^:iče,v^zniká převážně reakcí aminoskupin povrchu jedné buňky nebo jejíhi fragmentu s bifinxkčním činidlem na jedné straně a tímto činidlem s aminoskupinou druhé buňky na straně rruhé,rřieemž dojde ke kovalentnímu zesítění a fixaci bílkovin a tím i požadovaného - enzymu v takto vzniklém mikrobiálním agregátu.The present invention is based on the use of microbial cells and fragments thereof as non-dissolving carriers for binding. The covalent bond between the bound cell and the cell or fragment thereof, having the insoluble carrier character, is predominantly due to the reaction of the amino groups of the surface of one cell or fragment thereof with the bifunctional agent on one and the amine group reagent of the second cell on the other side, whereby covalent crosslinking and fixation of the proteins and hence the desired enzyme in the microbial aggregate thus formed.
KoovLlentní vazba je tady uskutečněna bifrnikčním činidlem,které reaguje především s aminoskupinami přirozeně se vyskyhuuících amincpolymerů tvořících povrchové struktury mikrobiální buňky (buněčná stěna,chstorlasmatická membrááia).U rrckιarhcntnícU mikrcorgani8mй,zejména bakterií, se této reakce účwtní především mukopolymer (miueen)9u eukaryontních mikroorganismů především chitin a ohitoβim.Do reakce vstupují pravděpodobně i strukturální bílkoviny buněčných povrchů. Chemickou strukturu buněčných povrchů bohatou na aminoskupiny dostatečně popř-sují pro prokaryontní mikrcorganiemy,zeeména bakterie,D.A.Reavley a R. E.Burge (v Adrvn.KicroCiiC.Phy-sid., X, 2-71, ed AHRoae & AccadPress, London N.Y., 1972))pro eukaryontní organismy, zejména plísně a vyšší houby, JM-A^nsou (v The Fugi, 1, 49-76, ed. G.C. Ainsworth & A.S.Sussman, Acad.Pese, NY. & London, 1965 ).U těchto druhů crgani8mů,kde je přirozeně se vysk^^ící amincpolymer tvořící integrální eoučáet nerozpustné struktury povrchu buněk pro reakci s bifrnkcčním činidlem nedoc^tuppý,kryhrický,např.u grammeggaivních mikroorganismů (bakterií), lze buňky libovolný způsobem destnove! a získat tak nerozpustné fragmenty buněk (gnosse), které lze již pro uvedený princip reakce podle vynálezu p^v^uíí;.Stejn^ě tak je možno chemicky, např.trCehCococtovcu kyselinou předem ošeeřit některé druhy mikroorgwiismů,např.z rodu BBacilus, kde je -mureinová vrstva překryta polymerem složeným z derivátů teichoových kyselin.Rezzutují dlouhá náhá nerozpustná dutá vlákna obsíaihuící na povrchu prakticky čistý muuein,na jejichž povrch lze pak buňky prostřednictvím bifunkčního činidla kovalentně vázat.Rovněž je možno předem ošeeřit buněčný nosič biochemicky, enzymový natrávením,např.hyczhmemchitináoou.Konečně je možné prostřednictvím vhodného fl·ckulačníhc činidla nebo jiných látek,účastnících se reakce s glutardLiarehhydem,kovdentně vázat buňky navzájem.KoovLlentní binding is effected here bifrnikčním agent which reacts primarily with the amino groups naturally vyskyhuuících amincpolymerů forming the surface structure of microbial cells (cell walls, chstorlasmatická membrááia) .For rrckιarhcntnícU mikrcorgani8mй, especially bacteria, this reaction mainly účwtní mukopolymer (miueen) 9 eukaryotic microorganisms mainly chitin and ohitoβim.Do the reaction probably enter the structural proteins of cell surfaces. The chemical structure of amine-rich cell surfaces is sufficiently described for prokaryotic microbes, bacterial strain, DAReavley and REBurge (in Adrv.KicroCiiC.Physid., X, 2-71, ed AHRoae & AccadPress, London NY, 1972)) eukaryotic organisms, especially fungi and higher fungi, JM-A? ns (in The Fugi, 1, 49-76, ed. GC Ainsworth & ASSussman, Acad.Pese, NY. & London, 1965). the naturally occurring amincpolymer forming an integral part of the insoluble cell surface structure for reaction with the bifunctional reagent is not dull, cryhric, e.g., in Gram-negative microorganisms (bacteria), the cells can be freely destined. and thus obtain insoluble cell fragments (gnosse) which can already be treated chemically, for example, with Coccacetic acid, with certain types of microorganisms, e.g. of the genus BBacilus, by virtue of the reaction principle of the invention. where the murein layer is covered with a polymer composed of teichoic acid derivatives.They resist long sudden insoluble hollow fibers containing virtually pure muuein on the surface, to which the cells can then be covalently bound by the bifunctional reagent.Also it is possible to pre-treat the cell carrier biochemically, by enzyme digestion, Finally, it is possible, by means of a suitable flocculating agent or other substances involved in the reaction with glutard Liarehhyd, to bind the cells to one another.
Postupem podle vynálezu rezuutují dobře зerimeettjícítnerczrlstné,kcvalentně zesítěné mikrobiální agregáty tvořící integrální jednotky s vysokým stupněm zachycené požadované enzymové akkivith,které lze opakovaně pouHt pro enzymovou katalýzu.According to the invention rezuutují well зerimeettjící nerczrlstné t, kcvalentně crosslinked microbial aggregates forming an integral unit with a high degree of trapped akkivith desired enzyme, which can be repeatedly pouHt for enzyme catalysis.
Předmětem vynálezu jsou mikrobiální buněčné agregáty obsíaiuuící buňky s vysokfa rnioostvím enzymu r®nicilinachlázh k přeměně penicilínu,zejména benzyhprniiClínu na kyselinu 6-aminopenioilínovou, vyznačené stím,že sestávají z enzymově aktivních mikroorganismů chemicky vázaných prostřednictvím polyfunkčních aldehydů,s výhodou glutjrrliarehhydu,navzeeem nebo na jiné buňky různých druhů organismů,kterýMi jsou buí celě,nercrušené,nativní anebo fhzikálněchhemickh 61 biochemicky ošetřené buňky . či nerozpustné fragmenty proka^o^ních nebo eukaryontních buněk různé moofologie.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides microbial cellular aggregates comprising cells with a high degree of enzymes for the conversion of penicillin, especially benzylpyridine to 6-aminopenioillinic acid, characterized in that they consist of enzyme-active microorganisms chemically bonded via polyfunctional aldehydes, cells of different kinds of organisms which are either whole, non-intrinsic, native or physically chemically treated cells. or insoluble fragments of prokaryotic or eukaryotic cells of various moophologies.
Mlikodální buněčné agregáty podle vynálezu jsou dále vyznačeny tím,že celé,nercrušeně,nativní anebo fyzikálněiChemickyiči biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty rrokaryontních nebo eukaryontních buněk jsou ve tvaru vlákentkulcvitých,elirscirnícUf-popřípadě jinýoh útvarů o rozměrech 1,1 až 1 000 —- - či buněčných fragmentů těchto buněk vzniklých samovolnouMlikodální cell aggregates of the invention are further characterized in that the entire, nercrušeně native fyzikálněiChemickyiči or biochemically treated cells or insoluble fragments rrokaryontních or eukaryotic cells are in form of fibers kulcvitých t, f elirscirnícU -optionally jinýoh bodies measuring 1.1 to 1 000 - - or cell fragments of these spontaneously generated cells
197 101 nebo uměle navozenou autolýzoufČi jakýmkoliv jinifa způsobemfnavozenam rozrušením.197101 or induced autolysis f jinifa or in any way disrupting navozenam f.
Při výrobě mikrobiálních buněčných agregátů se podle vynálezu postupuje tak,že se nechají reagovat celé nepoouěenéfnativní anebo fyzikálnětchemicky či biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty prokaryontních nebo eukaryontních buněk různé moofologie s enzymově aktivními buňkami s penicilénacyláoovou aktivitou a polyfunkčním aldehydem.When producing microbial cell aggregates according to the invention proceeds by reacting whole nepoouěené f native or chemically or physically t biochemically treated cells or insoluble fragments of prokaryotic or eukaryotic cells with various moofologie enzymatically active cells with penicilénacyláoovou activity and polyfunctional aldehyde.
Reakci lze provádět v přítorniooti flokulačního činidla s výhodou.flokulačního čiéillt,Oteré má nejméně dvě primárně anebo sekundárně aminové skupiny vstupující do reakce.The reaction may be carried out in a flocculating agent, preferably a flocculating agent having at least two primary or secondary amine groups entering the reaction.
Způsobem podle vynálezu lze postupovat také tak^e se enzymově aktivní ' . buňky s penicilinacylázovou aktivitou ne^l^fi^;jí reagovat s polyfunkčním aldehydem,s výhodou glutadLaaieehďeem v přítomnooti flokulačního činidla.The process according to the invention can also be carried out with enzyme activity. cells with penicillin acylase activity do not react with a polyfunctional aldehyde, preferably glutadaldehyde in the presence of a flocculating agent.
Výhodné je použít flokulační činiHoikteré má nejméně dvě primární anebo sek.tminltkupCny vstupující do reakce.It is preferred to use a flocculating agent which has at least two primary or sec.
Způsob podle vynálezu je dále vyznačený tímfíe po reakci s polyfunkčním aldehydem,s výhodou glutardtaleehddem se získané agregáty promyjí organickém rozpouštědlem neznale tčvujícím peéCiiiéαihyláuu,hibαéým ze tOuppcιéjθeetávvjíií z ChCllenxιaéUjbenéznéjbinéZnUjtlluenu,xhleéu, trichOometeαéuttettiehOoraetetnuttr,iehOoreetéuu,diehlorethéuшt cOlirbenzéuutmethylesoiutylketléulChilleexιaéooéjbiUyhacetátufplpřípjLlě jejich směsi.The inventive method is further characterized by f Ie upon reaction with a polyfunctional aldehyde, preferably glutardtaleehddem the obtained aggregates washed organic solvent ignorant tčvujícím peéCiiiéαihyláuu, hibαéým of tOuppcιéjθeetávvjíií of ChCllenxιaéUjbenéznéjbinéZnUjtlluenu, xhleéu, trichOometeαéu t tettiehOoraetetnu t tr iehOoreetéuu, diehlorethéuш t cOlirbenzéuu t methylesoiutylketléu l ChilleexιaéooéjbiUyhacetátu f plpřípjLlě mixtures thereof.
Při výrobě mikrobiálních buněčných agregátů podle vynálezu je možné pouuítí odpadních buněk organismů nebo nerozpustných fragmentů z nich předem připravených či samovolně vzniklých.In the production of the microbial cell aggregates according to the invention, it is possible to use waste cells of organisms or insoluble fragments thereof prepared or spontaneously produced therefrom.
Dále předmětem vynálezu je způsob přípravy miкrobiáléíce buněčných agregátů vyznačený tím, že se enzymově aktivní buňky s peniiClénacyláoovlu aktivitou smLísí s polyfunkčním aldehydem, s výhodou glutardtαleehddem,éαčeí se zchladí pod teplotu tání.A further object of the invention is to provide a process for the preparation of microbial cellular aggregates, characterized in that the enzymatically active cells with peniacyl acyl activity are mixed with a polyfunctional aldehyde, preferably glutardaldehyde, or cooled below the melting point.
Při tomto způsobu lze s výhodou pouužt enzymově aktivních buněk s penicilénacytzoovou aktivitou Částečně autolyzovaných.In this method, enzymatically active cells with penicillenacytzo activity partially autolysed can be advantageously used.
Dále je způsob přípravy mikrobiálních buněčných agregátů podle vynález^vyznačený tím,že se po^íje polyfunkčního aldehydu v mnnožtví 0,1 až 10 % hmolnéltníih (w/v).Further, the process for the preparation of microbial cell aggregates according to the invention is characterized in that the polyfunctional aldehyde is used in an amount of 0.1 to 10% by weight (w / v).
MiCкoliální buněčné agregáty podle vynálezu obeplují buňky s vysokým mužstvím enzymu peéiiilénaihlázh, k přeměně peniiilénu,zejmééα bnnzyhpenéciliéu na kyselinu 6-tminopenécililnюvou, přičemž jsou enzymově aktivní mikroorganismy chemicky vázány navzájem nebo na jiné buňky různých druhů orgaéitmй,kterými jsou buá ielé,énplrušené,nativéí anebo fhzCkálněiehemCckh, či biochemicky ošetřené buňky či jejich nerozpustné fragmenty,přičemž vlastnosti těchto agregát^zejména chemicky vysoce ttαbilZoovjnt enzymová ak^^vita a dobré sedimentační a mecheaéiiOé vlastnosti, d^^^c^ol^;jí dlouhodobé opakované nebo konéiéuáléí pouužtí na proncipu enzymového reaktoru, podle libovolné volby technologie s následnou izolací 6-aminooenécilitnové kyseliny úpravou pH a teploty z čiré Oapatinyjrezzžtujíií po jejich snadném oddělení z reakční směěi.The multicellular cellular aggregates of the present invention encircle cells with a high maleity of the enzyme peneilenalalz , to convert peniiilene, in particular, to a pyrophenoic acid, wherein the enzyme-active microorganisms are chemically bound to one another or to other cells which are In particular , chemically treated cells or biochemically treated cells or insoluble fragments thereof, the properties of these aggregates, in particular the chemically high enzymatic activity and the good sedimentation and mechanical properties, have long-term repeated or conse- quent use in the enzyme. of the reactor, of any choice of technology, followed by isolation of 6-aminooenitinitic acid by adjusting the pH and temperature from the clear Oapatins after they are readily separated from the reaction mixture.
U mikrobiálních buněčných agregátů podle našeho vynálezu jsou enzymově aktivní buňky mikroorganismů anebo jejich enzymově aktivní nerozpustné glutаrdtid.nehddem chemicky navázány na povrch celýce,éeplrušenýci,natCvéích anebo fhzCktléěiehemCcky . či biochemicky předem ošetřených prokaryontních nebo eukaryontních buněk různé molfolooie,či fragmentů těchto buněk, vzniklých samovolnou nebo uměle navozenou autolýzouiči jakýmkoOiv jin^m způsobem navozený rozrušením, čímž dojde nejen ke kovalentní vazbě mezi buňkami majícími charakter nosičetnýbrž i ke kovalentnímu zesítění vnitlobшlěčnéhl obsahu celého buněčného agregátu a tím i k chemické fiIn the microbial cell aggregates of the present invention, the enzyme-active cells of the microorganisms or their enzyme-insoluble glutamide are chemically bound to the surface of the whole, the infectious, the natural or the human. or biochemically pretreated prokaryotic or eukaryotic cells of various molfolithia, or fragments thereof, produced by spontaneous or artificially induced autolysis in any other manner induced by excitement, thereby not only covalently binding between cells having a carrier character but also covalent cross-linking of the intracellular cell contents and thus also chemical fi
197 101 б197 101 b
xaci a stabilizaci penicilinacylázy a zamezení kontaminace vzniklé 6-aminopěniciliánové kyseliny biologickými příměsemi,zvláště bílkovinného charakteru.xation and stabilization of penicillin acylase and prevention of contamination of the resulting 6-aminopenicilianic acid by biological impurities, especially of a protein nature.
Pro jejich přípravu lze použít buněk organismů nebo nerozpustných fragmentů z nich předem připravených či samovolně vzniklých,patřících mezi bakterie,zvláště grampositivní,gramnegativní a aktinomycety,nižší a vyšší houby,zejména plísně,kvasinky a vegetativní mycelia některých basidiomycet,vyjímaje všechny pathogenní mikroorganismy,rickettsie,mykoplasmata a viry.For the preparation thereof, cells of organisms or insoluble fragments thereof prepared or spontaneously produced, belonging to bacteria, in particular gram-positive, gram-negative and actinomycetes, lower and higher fungi, in particular fungi, yeasts and vegetative mycelia of certain basidiomycetes can be used. , mycoplasmas and viruses.
Velik08t,8edimantaČní vlastnosti a stupen zachycené enzymové aktivity penicilinacylázy kovalentně zesítěných agregátů buněk jsou řízeny hmotnostním poměrem vázaných buněk ku buňkám nosiče Či jejich nerozpustným fragmentům,přítomností či nepřítomností flokulačního Činidla v reakční směsi,jeho kvalitou a koncentrací,dobou stání buněčné suspense v přítomnosti flokulantu,hodnotou pH reakční směsi a reakční teplotou a použitou technikou kovalentniho zesitění buněk glutardialdehydem,zahrnující stání,míchání o různé intenzitě,mražení a následné pomalé roz-i mrazování,lyofilizaci,sušení,nebo kombinaci těchto technik.The size and extent of entrapped enzyme activity of penicillin acylase of covalently crosslinked cell aggregates are controlled by the weight ratio of bound cells to carrier cells or their insoluble fragments, presence or absence of flocculating agent in the reaction mixture, its quality and concentration, time of cell suspension in the presence of flocculant. the pH of the reaction mixture and the reaction temperature, and the glutardialdehyde covalent cell crosslinking technique used, including standing, stirring at varying strengths, freezing and subsequent slow freezing, lyophilization, drying, or a combination of these techniques.
Obsahuje-li látka schopná způsobit flokulaci buněk nejméně dvě primární anebo sekundární aminoskupiny,vstupuje do reakce zprostředkované glutardialdehydem a má funkci mezibuněčné prostorové spojky.When a substance capable of causing cell flocculation contains at least two primary or secondary amino groups, it enters a glutardialdehyde-mediated reaction and functions as an intercellular spatial linker.
>o reakci s glutardialdehydem získané buněčné agregáty se promyjí organickým rozpouštědlem neinaktivujícím penicilinacylázu v zesítěných agregátech.čímž dojde к vyplavení nezreagovaných lipoidních látek,které jsou součástí struktury buněčných povrchů,buněčných stěn a cytoplasmatických membrán,a tím ke zdokonalení difuzních vlastností těchto agregátů.The cellular aggregates obtained by the reaction with glutardialdehyde are washed with an organic solvent not inactivating penicillin acylase in the crosslinked aggregates, thereby leaching unreacted lipoid substances which are part of the cell surface structure, cell walls and cytoplasmic membranes, thereby improving the diffusion properties of these aggregates.
Způsobem podle vynálezu bylo použito к přípravě mikrobiálních buněčných agregátů hyperprodukční mutanty Escherichia coli - 77 obsahující vysoké množství penicilinacylázy,která byla získána genetickou manipulací postupem podle čs.autorského osvědčení č.162 274; kmen je chráněn podle čs.autorského osvědčení č.188 631.Je samozřejmé,že použitím jiného produkčního mikroorganismu (kmene) lze podle vynálezu připravit agregáty s odlišným kvalitativním a kvantitativním zastoupením enzymových aktivit.According to the method of the invention, a hyperproductive mutant of Escherichia coli-77 containing a high amount of penicillin acylase, obtained by genetic manipulation according to the method according to the author's certificate no. the strain is protected according to the author's certificate no.188 631. It goes without saying that by using another production microorganism (strain) according to the invention, aggregates with different qualitative and quantitative representation of enzyme activities can be prepared.
Velikost mikrobiálních agregátů byla posuzována mikroskopicky (optickým mikroskopem) в použitím kalibrovaného měrného okuláru při různém zvětšení.Některé agregáty byly posuzovány scann-elektronovým mikroskopem.Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny buí centrifugací při definované relativní centrifugační síle a době (obvykle 500 G, 5 min.a méně),nebo použitím sedimentační hematologické soupravy běžně užívané při vyšetřování sedimentace krevních tělísek po odběru krve v humánní medicíně (FW test),popřípádě sedimentací stáním v odměrném válci.The size of microbial aggregates was assessed microscopically (by optical microscope) using a calibrated specific eyepiece at various magnifications. Some aggregates were scanned by scanning electron microscopy.Sedimentation properties were assessed either by centrifugation at a defined relative centrifugal force and time (usually 500 G, 5 min.a). less), or by using a sedimentation hematology kit commonly used in the examination of blood sedimentation after blood collection in human medicine (FW test), or by standing sedimentation in a graduated cylinder.
Stabilita enzymové aktivity mikrobiálních agregátů byla hodnocena dlouhodobým třepáním vodné suspenze těchto agregátů (obvykle 10 g vlhké hmoty/100 ml) při teplotě 30 °C v 500 ml varných baňkách umístěných na rotačním třepacím stroji o počtu otáček 240/min.Ve zvolených časových intervalech byly odebírány vzorky suspenze a hodnocena enzymová aktivita v sedimentu a supe mat antu.The stability of the enzyme activity of the microbial aggregates was evaluated by shaking the aqueous suspension of these aggregates (usually 10 g wet mass / 100 ml) at 30 ° C in 500 ml beakers mounted on a rotary shaker at 240 rpm at 30 ° C. suspension samples were taken and enzyme activity in sediment and supernatant was evaluated.
V některých případech byly hodnoceny mechanické vlastnosti mikrobiálních agregátů dlouhodobým třepáním vodné suspenze těchto agregátů za výše uvedených podmínek s tím rozdílem,že banky byly opatřeny jedním nebo několika vlisy (zarážkami).Mimo enzymovou aktivitu sedimentu a supematantu byla měřená rychlost sedimentace a průměrná velikost agregátů po vystavení mechanickým vlivům.In some cases, the mechanical properties of microbial aggregates were evaluated by shaking the aqueous suspension of these aggregates for a long time under the above conditions except that the flasks were provided with one or more indentations. Besides the enzymatic activity of the sediment and supernatant, exposure to mechanical influences.
197 101197 101
Aktivita penicilinacylázy byla hodnocena spektrofotometricky barevnou reakcí p-dimethylaminobenzaldehydu a 6-APK podle čs.patentového spisu δ.116 959 v modifikaci podle Balasinghama a sp.(Biochim.Biophys. Acta, 276. 250, 1972),při 42 °C a hodnotě pH 7,6 v oblasti reakční kinetiky nultého řadu.Jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu,které katalýzuje vznik jednoho <umolu 6-APK z benzylpenicilinu,respektive jeho solí za hodinu.The activity of penicillin acylase was evaluated spectrophotometrically by the color reaction of p-dimethylaminobenzaldehyde and 6-APK according to U.S. Pat. No. δ.116 959 modified by Balasingham et al (Biochim.Biophys. Acta, 276. 250, 1972) at 42 ° C and The pH of the enzyme activity is the amount of enzyme that catalyses the formation of one micromole of 6-APK from benzylpenicillin or its salts per hour, respectively.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení,aniž by se jimi omezoval.In the following, the invention is illustrated in more detail by the examples without limiting them.
Příklady provedeníExamples
Příklad 1Example 1
Submerzní kultivací asporogenního kmene Bacillus megatherium CCM 2037 ve 150 1 fermentačním tanku při teplotě v rozmezí 40 až 48 °C v přítomnosti vysokých koncentrací aminokyselin (ve formě kukuřičného extraktu) postupem podle J.Chaloupky a sp.,(Biotechnol.and Biosng.Symp.No. 4, 985 až 993# 1974) bylo získáno přibližně 3 000 g buněčné hmoty.Tímto způsobem bylo docíleno tvorby velmi dlouhých vláken uvedeného kmene.Submerged cultivation of an asporogenic Bacillus megatherium CCM 2037 strain in a 150 L fermentation tank at 40-48 ° C in the presence of high concentrations of amino acids (as corn extract) according to the procedure of J.Chaloupka et al., (Biotechnol.and Biosng.Symp. No. 4, 985-993 (1974), approximately 3,000 g of cell mass were obtained. In this way, very long fibers of said strain were obtained.
000 g takto získané nativní buněčné hmoty bylo suspendováno ve 2 000 ml vody,za míchání zahřát o na 64 °C a přidáno 4 000 ml 10% (w/v) kyseliny trichloroctové předehřáté na 62 °C.Směs byla za míchání ohřátá na 80 °C a při této teplotě zahřívána 20 minut.Poté byla směs ochlazena na 30 °C,suspenze buněk odstředěna a buněčná hmota promyta 25 1 vody.Takto bylo získáno 1010 g vlhké buněčné hmoty ve formě pasty; velikost vláken se pohybovala v rozmezí 15 až 30 лип.000 g of the native cell mass thus obtained were suspended in 2000 ml of water, heated to 64 ° C with stirring, and 4000 ml of 10% (w / v) trichloroacetic acid preheated to 62 ° C were added with stirring. Then the mixture was cooled to 30 ° C, the cell suspension was centrifuged and the cell mass was washed with 25 L of water. This gave 1010 g of wet cell mass as a paste; the fiber size ranged from 15 to 30%.
7.5 g vlhké hmoty popsaným způsobem získané a ošetřené buněčné pasty B.megatherium bylo spolu s 15 g vlhké hmoty buněk E.coli - 77 obsahujících penicilinacylázu suspendováno v 50 ml O,1M fosfátového pufru, pH 7,0 v erlenmayerově baňce a přidány 4 ml 50% roztoku glutardialdehydu. Baňka s reakční směBÍ byla umístěna na reciproký třepací stroj o počtu kyvů 200/min. při teplotě 27,5 °C po dobu 3 hodin.Poté byla reakční směs zředěna 6x vodou,odstředěna (1000 G,5 min.) a sediment suspendován do 250 ml vody a suspenze znovu odstředěna (5000 G, 10 min.)· Popsaným postupem bylo získáno 23 g vlhké hmoty (ve formě pasty) mikrobiálních agregátů obsahujících 4%4 % původní aktivity penicilinacylázy o specifické aktivitě enzymu 2,32 j/mg vlhké hmoty preparátu.Velikost agregátů činila průměrně 25 Лип.7.5 g of wet mass obtained and treated with B.megatherium cell paste were suspended together with 15 g of wet mass of E.coli-77 cells containing penicillin acylase in 50 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 in an erlenmeyer flask and added 4 ml 50% glutardialdehyde solution. The reaction flask was placed on a reciprocating shaker at 200 rpm. at 27.5 ° C for 3 hours. Thereafter, the reaction mixture was diluted 6x with water, centrifuged (1000 G, 5 min.) and the sediment suspended in 250 ml of water and centrifuged again (5000 G, 10 min.). The procedure yielded 23 g of wet mass (in the form of a paste) of microbial aggregates containing 4% 4% of the original penicillin acylase activity with a specific enzyme activity of 2.32 J / mg wet mass of the preparation. The aggregate size was an average of 25%.
2.5 g vlhké hmoty agregátů suspendované v 50 ml vody kvantitativně eedimentoval· při 100 G,5 min. (Čirý supematant).2.5 g wet mass of aggregates suspended in 50 ml of water quantitatively eedimented at 100 G, 5 min. (Clear supernatant).
Vodná suspenze získaných agregátů (15 g pasty/50 ml) byla emulgována ve 100 ml toluenu v poměru Ií4 (v/v) obsahujícím 2 % (v/v) smáčedla (SPAN-85) a tato emulze byla míchána v 500 ml varné baňce se třemi vlisy (zarážkami) na rotačním třepacím stroji (240 ot/min.) 3 hodiny při 28 °C.Emulze byla odstředěna (5000 G, 10 min.) a sediment byl 2x promyt 50 ml 10% (v/v) vodného roztoku smáčedla (Tween-20) a 2x 250 ml vody; suspenze odstředěna vždy 15 minut při 5000 G. Specifická aktivina enzymu popsaným způsobem ošetřených agregátů činila 3,45 j/mg vlhké hmoty, tj. 149 % hodnoty specifické aktivity neošetřených agregátů.The aqueous suspension of the obtained aggregates (15 g of paste / 50 ml) was emulsified in 100 ml of toluene in a ratio of 14 (v / v) containing 2% (v / v) of a surfactant (SPAN-85) and this emulsion was stirred in a 500 ml beaker with three indentations (stoppers) on a rotary shaker (240 rpm) for 3 hours at 28 ° C. The emulsion was centrifuged (5000 G, 10 min) and the sediment was washed twice with 50 ml of 10% (v / v) aqueous wetting solution (Tween-20) and 2x 250 mL water; the suspension was centrifuged for 15 minutes at 5000 G. The specific enzyme activity of the treated aggregates as described was 3.45 J / mg wet mass, i.e. 149% of the specific activity value of the untreated aggregates.
197 101197 101
Příklad 2Example 2
Za 300 g vlhké pasty nativních (neošetřených) buněk Bacillus megatheriím získané kultivací podle príkladi 1 bylo připraveno 1000 ml suspenze v , 0,05 '$> (w/v) NaCl a její pH upraveno - na hodnotu 7,0.Po ohřátí suspenze na 36 °C bylo přidáno 0,2 g vaječného a směs při této teplotě míchána 30 minuu,poté byla hodnota pH upravena na 9,0 25% roztokem NaOH a směs prudce ohřáta na 80 °C a zahřívána ještě 10 minut při této teplotě.Bměs byla ochlazena na 30 °C a hodnota pH upravena konc.kyselinou chlorovodíkovou na 7,0.With 300 g of wet paste of native (untreated) Bacillus megatheria cells obtained by cultivation according to Example 1, 1000 ml of a suspension in 0.05 w / v NaCl was prepared and adjusted to pH 7.0. After heating the suspension 0.2 g of egg was added to 36 ° C and the mixture was stirred at this temperature for 30 min, then the pH was adjusted to 9.0 with 25% NaOH solution and the mixture was heated vigorously to 80 ° C and heated at this temperature for 10 minutes. The mixture was cooled to 30 ° C and the pH adjusted to 7.0 with conc. Hydrochloric acid.
Z 10 g této suspenze a 10 g vlhké -pasty buněk E.coli - 77 ob8íalhlíiích penicilinacylázu bylo připraveno 50 ml vodné suspenze a její pH upraveno na hodnotu 7,6 - 50% (w/v) roztokem NaOH a přidány 2 ml 50% roztoku glutardiaieehydu.Reakční směs byla míchána na reciprokém třepacím stroji (200 kmiiů/min.) 6 hodin při teplotě 29 °C,poté zředěna 2x vodou a odstředěna (500 G, 10 min.); sediment byl rozmíchán ve 200 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min. ).50 ml of an aqueous suspension was prepared from 10 g of this suspension and 10 g of wet cell paste of E. coli - 77 containing penicillin acylase and adjusted to pH 7.6-50% (w / v) with NaOH and 2 ml of 50% added. The reaction mixture was stirred on a reciprocating shaker (200 kM / min) for 6 hours at 29 ° C, then diluted 2X with water and centrifuged (500 G, 10 min); the sediment was stirred in 200 ml of water and centrifuged again (5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem získaná vlhká pasta agregátů obsahovala ' 24,9 % původní aktivity pěníciliiCLiylázy; specifická akivitc enzymu činila 1,44 j/mg vlhké hmoty preparátu.Agregáty vykazovaly průměrnou velikost HOftum a k jejich úplné sednminiaci vedlo odstředění při 500 G po dobu 10 minut (čirý supe]maClaΊi).The wet aggregate paste obtained as described above contained 24.9% of the original activity of the foamy protein; The specific activity of the enzyme was 1.44 J / mg wet weight of the preparation. The aggregates had an average HOftum size and their complete sedimentation was centrifuged at 500 G for 10 minutes (clear supernatant).
Příklad 3Example 3
Buněčná pasta B.megatheriím ošetřená - kyselinou t.richrooocrovru podle příkladu l,bylc v mnořství 10 g vlhké hmoty smíchána s 20 g - pasty buněk E.cooi rb81Clelíiíie penicilinciyLázu a ze směsi připraveno 200 ml vodné s^peene^o jíž hodnota pH byla upravena na 7,9 50% roztokem NaOH.K suspenzi bylo přidáno 20 ml 10% vodného roztoku (w/v) Sedipuru* ^zamícháno a poněcháno 18 hodin stát při teplotě +8°C.Po této době bylc hodnota pH upravena nc 7,4 25% roztokem NaOH a do suspenze vmícháno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu; směs ponechána stát 3 hodiny při teplotěThe cellulose paste treated with larynthroic acid according to Example 1 was mixed with 20 g of E. coli cellulose paste in a quantity of 10 g of wet mass and prepared with 200 ml of an aqueous solution having a pH value of 100 ml. 20 ml of a 10% aqueous solution (w / v) of Sedipur® were added and the mixture was allowed to stand at + 8 ° C for 18 hours. After this time, the pH was adjusted to 7 ° C. With 25% NaOH solution and 16 ml of a 25% glutardialdehyde solution; the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours
24,5 °C,poté bylo přidáno 100 ml vody,suspenze odstředěna (500 G 10 min.) a sediment 'uuspendován v 1000 ml vody a zfilmován přes silonovou tkaninu- o velikosti ok 500fum.Aggegáty zachycené na filtn byly suspendovány ve 200 ml vody a odstředěny (5000 G, 15 min.).24.5 ° C, then 100 ml of water was added, the suspension was centrifuged (500 g for 10 min) and the sediment suspended in 1000 ml of water and filtered through a 500 µm nylon fabric. The retained filters were suspended in 200 ml. water and centrifuged (5000 G, 15 min.).
Získaný preparát (56,2 g vlhké hmoty) obsahoval agregáty o velikosti průměrně 1400<Um o specifické ckkivitě enzymu 0,99 j/mg vlhké hmooy; zachycená ck;ivitc činila 30,5 % původní aktivity peniciLiiciyLázy.Stií vodné suspenze (10 g/100 ml) agregátů v odměmiém válci vedlo ke kvcanitctivní sedimeniaci během 5ti minut.The obtained preparation (56.2 g wet mass) contained aggregates having an average size of 1400 µm with a specific enzyme activity of 0.99 j / mg wet hmooy; The aqueous suspension (10 g / 100 ml) of the aggregates in a cylindrical cylinder resulted in quantitative sedimentation within 5 minutes.
U popsaným způsobem získaných agregátů byla testována stabilita enzymové aktivity spolu s mechanickými vlastnostmi při dlouhodobém míchání vodné suspenze 10 g vlhké . - hmoty agregátů (100 ml v 500 ml varné bance) opatřené jedním vlisem (zarážkou) tck,jck je uvedeno v popisu vynálezu. Za 60 dní klesle počáteční aktivita sedimentu nc 98,5 % a v supernatantu se olovil slabý zákal; zc uvedenou dobu nepřetržitého míchání činila velikost agregátů průměrně 1000<um a - rychlost sedimentace byla o něco pomalejší, (čirý supe та ten t rezultovel stáním v odměmém válci ze 10 minuu).The aggregates obtained in this way were tested for stability of enzyme activity together with mechanical properties with long-term stirring of an aqueous suspension of 10 g wet. aggregate masses (100 ml in a 500 ml boiling flask) provided with one indent (stop) tck, jck is disclosed in the description of the invention. After 60 days, the initial sediment activity nc decreased by 98.5% and the supernatant was slightly cloudy; z said aggregate size was on average 1000 <µm and the sedimentation rate was somewhat slower (the clear supernatant was standing in a measuring cylinder of 10 minuu).
Příklad 4Example 4
Buněčná - paste E.coli ^βι^^οί peniciLinaiylázu byla suspendována ve vodě nc hodnotu 400 mg vlhké hmooy/ml a teto suspenze byla deelntegrována čtyřnásobnou recyklací ne mechanickém des197 101 integrátoru Manton-Gaulin při tlaku 340 kp/cm při laboratorní teplotě.Homogenát byl odstředěn (5000 G/1 h).The cell colony paste of E. coli penicillin was suspended in water at 400 mg wet hmooy / ml and this suspension was de-integrated four times by mechanical recycling of the Manton-Gaulin integrator at 340 kp / cm at room temperature. was centrifuged (5000 G / 1 h).
g vlhké hmoty fragmentů E.coli bylo ve směsi a 20 g vlhké hmoty neporušených buněk E.coli téhož kmene obsahujících penicilinacylázu suspendováno ve vodě na výsledný objem 200 ml.Hodnota pH suspenze byla upravena 25% roztokem NaOH na 7,5 a suspenze byla po smíšení s 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu vpravena do 500 ml varné baňky a umístěna na rotační třepací stroj.Reakce probíhala za míchání (240 ot/min) 3 hodiny při teplotě 26 °C.Poté byla reakční směs zředěna 100 ml vody a odstředěna (500 G, 5 min),sediment promyt 250 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).g of wet mass of E. coli fragments was in the mixture and 20 g of wet mass of intact E. coli cells of the same strain containing penicillin acylase were suspended in water to a final volume of 200 ml. The pH of the suspension was adjusted to 7.5 with 25% NaOH solution. mixing with 16 ml of a 25% glutardialdehyde solution was placed in a 500 ml boiling flask and placed on a rotary shaker. The reaction was stirred at 240 rpm for 3 hours at 26 ° C. Then the reaction mixture was diluted with 100 ml of water and centrifuged ( 500 g, 5 min), wash the sediment with 250 mL of water and centrifuge again (5000 G, 15 min).
V takto získaném preparátu mikrobiálních agregátů (41,5 g vlhké hmoty) bylo zachyceno 81 % původní aktivity penicilinacylázy,specifická aktivita enzymu činila 1,80 j/mg vlh é hmoty preparátu. Velikost agregátů byla průměrně 320/um a jejich úplné sedimentace bylo docíleno stáním suspenze ve válci (5 g vlhké hmoty agregátů/100 ml) po dobu 10 minut.Dále byla sledována stabilita enzymové účinnosti agregátů podobně jako v příkladu 3; baňka nebyla však opatřena vlisem.Po 40 dnech nepřetržitého míchání nedošlo к poklesu enzymové aktivity v sedimentu a čirý supematant vykazoval nulovou aktivitu.In the thus obtained microbial aggregate preparation (41.5 g wet mass) 81% of the original penicillin acylase activity was captured, the specific activity of the enzyme being 1.80 J / mg wet mass of the preparation. The aggregate size was an average of 320 µm and their complete sedimentation was achieved by standing the suspension in the cylinder (5 g wet aggregate / 100 ml) for 10 minutes. The stability of the enzyme activity of the aggregates was similarly monitored as in Example 3; However, after 40 days of continuous stirring, the enzyme activity in the sediment did not decrease and the clear supernatant showed no activity.
Katalytická účinnost mikrobiálních agregátů byla ověřena při opakovaně prováděné hydrolýze benzylpenicilinu.Množství 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem připravených agregátů bylo vpraveno do 100 ml míchaného reaktoru a doplněno na 50 ml vodou.Teplota během enzymové hydrolýzy byla udržována na 37 °C a prováděna kontinuální úprava pH na hodnotu 7,6 čpavkovou vodou.Agregáty byly vždy odděleny z reakční směsi odstředěním (500 G, 5 min) a použity pro další opakovaný cyklus enzymové konverze.Za uvedených podmínek byla účinnost konverze 6,25% roztoku Na-eoli benzylpenicilinu na 6-APK 82,3 % za 1 1/2 hodiny pro první cyklus, 81,5 % za 1 1/2 hodiny proThe catalytic activity of the microbial aggregates was verified by repeated hydrolysis of benzylpenicillin. A quantity of 10 g of wet mass as described above was introduced into a 100 ml stirred reactor and made up to 50 ml with water. The temperature during enzyme hydrolysis was maintained at 37 ° C. The aggregates were always separated from the reaction mixture by centrifugation (500 G, 5 min) and used for another repeated cycle of enzyme conversion. Under the above conditions, the conversion efficiency of a 6.25% solution of Na-eoli benzylpenicillin to 6- APK 82.3% in 1 1/2 hours for the first cycle, 81.5% in 1 1/2 hours for
2.cyklus a 82,6 % za 1 1/2 hodiny pro 3·cyklus opakovaného použití.Cycle 2 and 82.6% in 1 1/2 hour for 3 reuse cycles.
Příklad 5Example 5
Z 10 g vlhké hmoty nativních buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu a 5 g vlhké hmoty fragmentů buněk E.coli téhož kmene získaných postupem uvedeným v příkladu 4,bylo připraveno 50 ml vodné suspenze,jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,5. К této suspenzi bylo přidáno 2 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru KA a vmícháno 4 ml 25% roztoku glutardialdehydu a směs nalita na kovový tác z nerezové oceli v tenké vrstvě.Vrstva byla ponechána 15 minut při laboratorní teplotě,dále pak 3 hodiny při teplotě -20 °C a nakonec pomalu rozmrazována 16 hodin pří teplotě 8 °C.Získaná hmota byla za vlhka rozřezána a útvary smíchány se 100 ml vody.Poté byly částice homogenizovány 1 minutu velmi intenzivním mícháním ocelovým vrtulovým míchadlem a homogenát odstředěn (500 G, 5 min).Sediment byl suspendován v 500 ml vody a filtrován přes kovové síto z nerezové oceli (průměr ok 0,7 mm).Zachycené agregáty byly ze síta smyty 250 ml vody a odstředěny (5000 G, 15 min).From 10 g of wet mass of native E. coli cells containing penicillin acylase and 5 g of wet mass of E. coli cell fragments of the same strain obtained as described in Example 4, 50 ml of an aqueous suspension was prepared, adjusted to pH 7.5. To this suspension was added 2 ml of a 10% (w / v) aqueous solution of Sedipur KA and mixed with 4 ml of a 25% glutardialdehyde solution and the mixture was poured onto a stainless steel metal tray in a thin layer. 3 hours at -20 ° C and finally thawed slowly at 8 ° C for 16 hours. The mass was wet-cut and mixed with 100 ml of water. The particles were then homogenized for 1 minute by vigorous stirring with a steel propeller stirrer and centrifuged ( The sediment was suspended in 500 ml of water and filtered through a stainless steel mesh (0.7 mm mesh). The collected aggregates were washed off the sieve with 250 ml of water and centrifuged (5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem získané mikrobiální agregáty vykazovaly průměrnou velikost 1750rum a kvantitativně eedimentovaly při stání suspenze (2,5 g vlhké hmoty agregátů/50 ml) za 5 minut.Zachycená enzymová aktivita preparátu byla 34,3 % při specifické aktivitě 1,23 j/mg vlhké hmoty.The microbial aggregates described above exhibited an average size of 1750rum and quantitatively eedimented on standing the suspension (2.5 g aggregate wet mass / 50 ml) in 5 minutes. The captured enzyme activity of the preparation was 34.3% at a specific activity of 1.23 j / mg wet mass.
5,5 g vlhké hmoty těchto agregátů bylo suspendováno ve vodě na celkový objem 100 ml a vpraveno do 500 ml varné baňky 8 jedním vlisem a způsobem uvedeným v příkladu 3 byla sledována stabilita5.5 g of the wet mass of these aggregates were suspended in water to a total volume of 100 ml and introduced into a 500 ml boiling flask 8 with one press, and the stability was monitored as described in Example 3.
197 101 aktivity penicilinacylázy a mechanické vlastnosti agregátů.Po 30ti dnech nepoklesla enzymová aktivita v sedimentu; slabě opalescentní supematant nevykazoval enzymovou aktivitu a agregáty o průměrné velikosti 1200/um sedimentovaly za výše uvedených podmínek zcela za 10 minut.Penicillin acylase activity and mechanical properties of aggregates. After 30 days the enzyme activity in the sediment did not decrease; the weakly opalescent supernatant did not show enzyme activity, and aggregates of an average size of 1200 µm sedimented under the above conditions completely for 10 minutes.
Příklad 6Example 6
Vlhký odpadní buněčný materiál Streptomyces rimosus po výrobě oxytetracyklinu (1500 g vlhké hmoty) byl promyt 20ti litry vody a odstředěn na poloprovozní centrifuze Sharples s výtěžkem 1300 g vlhké hmoty tohoto materálu.The moist waste cell material of Streptomyces rimosus after oxytetracycline production (1500 g wet mass) was washed with 20 liters of water and centrifuged in a Sharples pilot centrifuge to yield 1300 g wet mass of this material.
g vlhké hmoty těchto nativních promytých buněk a 20 g vlhké hmoty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu bylo rozmícháno ve vodě na celkový objem 200 ml; к suspenzi bylo přidáno 16 ml 25$ roztoku glutařdialdehydu.Reakční směs byla pomalu míchána kovovým vrtulovým míchadlem (400 ot/min) 3 hodiny při teplotě 20,5 °C,přičemž bylo pH reakční směsi udržováno 10$ roztokem NaOH pomocí pH-statu na hodnotě 7,0.Po této době byla suspenze zředěna přidáním 100 ml vody a odstředěna (500 0, 5 min); sediment byl dvakrát promyt 250 ml vody a odstředěn (5000 G, 15 min). Popsaným způsobem bylo získáno 24,2 g vlhké hmoty mikrobiálních agregátů·Zachycená aktivita penicilinacylázy v tomto preparátu činila 28,6 $, specifická aktivita enzymu byla 1,52 j/mg vlhké hmoty preparátu.Agregáty ve vodné suspenzi 5 g vlhké hmoty/100 ml kvantitativně sedimentovaly po 5ti minutách stání; jejich velikost se pohybovala průměrně okolo 450<um.g wet mass of these native washed cells and 20 g wet mass of E.coli cells containing penicillin acylase were mixed in water to a total volume of 200 ml; The reaction mixture was slowly stirred with a metal propeller stirrer (400 rpm) for 3 hours at 20.5 ° C while maintaining the pH of the reaction mixture with a 10 $ NaOH solution using a pH-state to After this time, the suspension was diluted by adding 100 ml of water and centrifuged (500 0.5 min); the sediment was washed twice with 250 ml of water and centrifuged (5000 G, 15 min). 24.2 g of wet mass of microbial aggregates were obtained as described. · The captured activity of penicillin acylase in this preparation was $ 28.6, the specific activity of the enzyme was 1.52 J / mg wet mass of the preparation. Aggregates in an aqueous suspension of 5 g wet / 100 mL sediment quantitatively after standing for 5 minutes; their size was on average about 450 µm.
Za podmínek uvedených v příkladu 3 byla testována stabilita enzymu u těchto agregátů s tím rozdílem,že varná banka nebyla opatřena vlisem.PO 28 dnech míchání nebyl zjištěn pokles aktivity enzymu v sedimentu,přičemž ve slabě zakaleném supematantu bylo zjištěno 5,9 $ výchozí enzymové aktivity suspenze.Under the conditions of Example 3, enzyme stability was tested on these aggregates except that the boiling flask was not embossed. After 28 days of stirring, there was no decrease in enzyme activity in the sediment, with a slightly turbid supernatant of $ 5.9 starting enzyme activity. suspension.
Dále bylo použito 50 ml suspenze,která obsahovala 5 g vlhké hmoty agregátu ve vodě к jednorázové enzymové hydrolýze 6,25 $ (w/v) roztoku Na-soli benzylpenicilinu na 6-APK, za podmínek u* vedených v příkladu 4 s teoretickým výtěžkem 73· 5 $ 6-APK za 2 hodiny.Further, 50 ml of a suspension containing 5 g of wet aggregate in water was used for a single enzyme hydrolysis of a 6.25 $ (w / v) solution of benzylpenicillin Na-salt to 6-APK under the conditions of Example 4 with theoretical yield. 73 · 5 $ 6-APK for 2 hours.
Příklad 7Example 7
Vlhká pasta buněk Streptomyces rimosus získaná promytím odpadního buněčného materálu,jak je uvedeno v příkladu 6,byla v množství 900 g rozmíchána v 1100 ml vody a po ohřítí této suspenze na 30 °C bylo přidáno 2000 ml 10$ (w/v) roztoku kyseliny trichloroctové předehřáté na teplotu 80 °C; směs byla zahřáta na teplotu 80 °C za pomalého míchání a při této teplotě udržována ještě 15 minut.Ke směsi byly přidány 4 1 studené vody a buňky separovány odstředěním na poloprovozní odstředivce Sharples.Buněčná hmota byla promyta 20 1 vody a odstředěna na témže zařízení do formy buněčné pasty.The Streptomyces rimosus wet paste obtained by washing the waste cell material as described in Example 6 was slurried in 900 ml of water in 1100 ml and after heating the suspension to 30 ° C 2000 ml of a 10 (w / v) acid solution was added. trichloroacetic pre-heated to 80 ° C; The mixture was heated to 80 ° C with slow stirring and maintained at this temperature for 15 minutes. To the mixture were added 4 L of cold water and the cells separated by centrifugation on a Sharples pilot centrifuge. The cell mass was washed with 20 L of water and centrifuged on the same equipment to forms of cell paste.
2,5 g vlhké hmoty této pasty a 5 g vlhké pasty buněk E.coli s pěnicilinacylázovou aktivitou bylo suspendováno ve vodě na celkový objem 50 ml; hodnota pH suspenze byla upravena na 7,25 a přidán 10$ (w/v) vodný roztok Sedipuru KA tak,aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,5 $ w/v.Směs byla krátce pomalu zamíchána a poté při stání po dobu 30ti minut probíhala flokulасе.Hodnota pH flokulované suspenze byla opět upravena na 7,25 a přidáno 2 ml 50$ roztoku glutardialdehydu a reakční směs byla umístěna na reciproký třepací stroj (200 kyvů/min);2.5 g of the wet mass of this paste and 5 g of the wet paste of E. coli cells with foamyillin aclase activity were suspended in water to a total volume of 50 ml; the pH of the suspension was adjusted to 7.25 and a 10 $ (w / v) aqueous solution of Sedipur KA was added so that its final concentration in the reaction mixture was 0.5 $ w / v. The mixture was stirred briefly and then standing The pH of the flocculated suspension was again adjusted to 7.25 and 2 ml of a 50% glutardialdehyde solution was added and the reaction mixture was placed on a reciprocating shaker (200 rpm);
,reakce probíhala 4 1/2 hodiny při teplotě 29 °C.Po této době byla reakční směs zředěna 2x vodou a odstředěna (500 g, 10 min),sediment byl suspendován ve 200 ml vody a znovu odstředěnThe reaction mixture was diluted 2x with water and centrifuged (500 g, 10 min), the sediment was suspended in 200 ml of water and centrifuged again.
197 101 (5000 d, 15 min).197-101 (5000 d, 15 min).
Popsaný^ způsobem bylo získáno 18,6 g vlhké hmoty agregátů; zachycená aktivita pěnícilinacylázy činila 67 % specifická aktivita enzymu byla 1,35 j/mg vlhké hmoty prepwrátu.Velitost agregátů se pohybovala přibližně okolo 300 rum a při navážce 2,5 g vlhké hmoty agregátů/50 ml vody byla jejich sedimentační rychlost měřená pomocí haematologické soupravy (MPW - 01, Poleko),As described above, 18.6 g of wet aggregate mass were obtained; The activity of the aggregates was about 300 rum and at the weight of 2.5 g of the wet mass of the aggregates / 50 ml of water, their sedimentation rate was measured using a haematological kit. (MPW-01, Poleko)
15,5 ' mm/min.15.5 mm / min.
Příklad 8Example 8
Ze 2 g vlhké hmoty buněk E.coli obsíanUících penicilinacylázu a 1 g vlhké hmoty promytého odpadního buněčného (nativní biomasy) Stmptomyces rimoeus.bylo připrvvene ’ 10 ml vodné su8pennzfje jíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,6 a .přidáno 0,8 ml 25% roztoku glutard i aldehydu.From 2 g wet weight E. coli cells obsíanUících penicillin and 1 g wet weight of washed cell waste (native biomass) Stmptomyces rimoeus.bylo připrvvene '10 ml of aqueous su8pennz f which is the pH was adjusted to 7.6 and 0.8 .přidáno ml of 25% glutard and aldehyde solution.
Směs byla po zamíchání nalita na Petriho misku o průměru 9,5 cm.ponechána stát 15 minut při laboratorní teplotě.pak 3 hodiny při teplotě -20° C a poté ponechána 16 hodin při teplotě +8 °C stát.Po této době byla hmooa rozrušena velmi intenzi^niím mícháním ve 150 ml vody ocelo-^ým . vrtulovým míchaHem 1 minutu a odstředěna (500 g, 5 min^sediment suspendován ve stenném objemu vody a znovu odstředěn (5000 0, 10 min).After stirring, the mixture was poured into a 9.5 cm diameter Petri dish and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Then at -20 ° C for 3 hours and then allowed to stand at +8 ° C for 16 hours. was destroyed by very intensive stirring in 150 ml of steel water. by spinning for 1 minute and centrifuged (500 g, 5 min.) sediment suspended in a wall volume of water and centrifuged again (5000 0, 10 min).
Získaný preparát mikrobiálních agregátů o specifické !^1^:Ív:Ltě penicilinacylázy 2,22 j/mg vlhké hmoty a o zachycené !^t^:Lv:Ltě enzymu 34,2 % byl umístěn ve vodné suspenzi (3,8 g vlhké hmoty agregátů/100 ml) do 500 ml varné baňky bez vlisu a testována stabilita. enzymové aktivity jak je uvedeno v příkladu 3«Po 14 dnech nepřetržitého míchání klesla aktivita sedimentu .na 93,3 % původní enzymové aktivity; supematant byl .čirý a aktivita penicilinacylázy v něm byla nulová.The obtained microbial aggregate preparation having a specific content of 2.22 U / mg wet mass and retained 34.2% of the collected enzyme was placed in an aqueous suspension (3.8 g wet mass). aggregates (100 ml) into a 500 ml non-pressurized flask and tested for stability. enzyme activity as described in Example 3 After 14 days of continuous agitation, the sediment activity decreased to 93.3% of the original enzyme activity; the supernatant was clear and the activity of penicillin acylase therein was zero.
Příklad 9Example 9
Odpadní buněčný mmlteiiál. (5 1 řídké suspenze) Penicillúm chrysogenum po výrobě penicilínu byl prom. 25 1 vody a vlhký koláč dobře .odsát.Bylo získáno 550 g vlhké pasty buněčného maaaríálu.Waste cellular material. (5 L of slurry) Penicillum chrysogenum after production of penicillin was prom. 25 l of water and wet cake well sucked. 550 g of cell paste wet paste was obtained.
Z 10 g této vlhké pasty .a 30 g vlhké pasty buněk E.coli obsstnjících penicilinacylázu bylo připraveno 200 ml suspenze v 0,1 M fosfátovém pufrui.pH 7,5· K homogenní suspenzi bylo přidáno 16 ml 50% roztoku glutardialdehylu a mícháno 1,5 hodiny při teplotě 24 ’ °C na rotačním třepacím stroji (?40 ot/min).Reakční směs byla zředěna vodou na dvojnásobek objemu a odstředěna (500 G, 5 min); sediment byl suspendován v 300 ml vody a opět odstředěn (5000 G. 15 min).From 10 g of this wet paste and 30 g of wet paste of E.coli cells containing penicillin acylase, 200 ml of suspension in 0.1 M phosphate buffer was prepared. PH 7.5 To the homogeneous suspension was added 16 ml of 50% glutardialdehyde solution and stirred 1 5 hours at 24 ° C on a rotary shaker (? 40 rpm). The reaction mixture was diluted to twice the volume with water and centrifuged (500 G, 5 min); the sediment was suspended in 300 ml of water and centrifuged again (5000 g for 15 min).
Popsaným způsobem získaný preparát vykazoval specifickou aktivitu enzymu 2,20 j/mg vlhké hmoty, zachycená aktivita penicilinlcylázy byla 43,5 %.Velikost agregátů se pohybována průměrně okolo 220<um . a k úplné θι^^ι^οι agregátů (suspenze 100 mg vlhké hmooy/mÍ.) vedlo k odstředění při 500 G (5 min).The preparation obtained as described above exhibited a specific activity of the enzyme of 2.20 u / mg wet mass, the trapped activity of penicillin cylase was 43.5%. The size of the aggregates was on average about 220 µm. and complete aggregates (100 mg wet hmooy / ml suspension) resulted in centrifugation at 500 G (5 min).
Testování stability penicilinacylázy u získaných agregátů (5 g vlhké hm0^/100 ml) probíhalo stejně.jak je uvedeno v příkladu 8.Po 20ti dnech nepřetržitého mícháni nedošlo k poklesu enzymové· aktivity sedimentu; v čirém supernatantu nebyla nalezena žádná enzymová aktivita.Penicillin acylase stability testing of the aggregates obtained (5 g wet wt / 100 ml) was carried out as described in Example 8. After 20 days of continuous stirring, the enzyme activity of the sediment did not decrease; no enzyme activity was found in the clear supernatant.
Vlhká pasta agregátů o hmotě 15 g byla ošetřena směsným organickým rozpouštědlem,podobně jako v příkladu 1. Tentokrát však 50 mi butylacetátu obsahnuicího 1 % (v/v) smááedla (SPÁN 85) a s tím rozdílea^e třepání emulze probíhalo 2 hodiny a že sediment byl promyt 1x100 ml 2,5% (v/v) roztoku smááedla (TWEEN 20) a 3x250 ml vody.OOetřené agregáty měly specifickou aktivitu penicilínacylázy 3»67 j/mg vlhké hmoy,ttj167 % specifické aktivity neošetřených agregátů.A 15 g wet aggregate paste was treated with a mixed organic solvent, similar to Example 1. This time, however, 50 ml of butyl acetate containing 1% (v / v) wetting agent (SPAN 85) and with this the emulsion shaking was 2 hours and the sediment The washed aggregates had a specific penicillin acylase activity of 3.67 J / mg wet weight, i.e. a 16% specific activity of the untreated aggregates.
; ' -'L'··:; '-'L' ··:
197 101197 101
Příklad 10Example 10
Ke 200 ml homogenní vodné suspenze obsahující 20 g vlhké hmoty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou a 10 g vlhké hmoty promytých odpadních buněk Penicillium chrysogenum bylo přip dáno po úpravě pH na hodnotu 6,8 10 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru KA.Za pomalého míchání ponecháno flokulovat 25 minut,poté bylo pH upraveno na hodnotu 7,1 a přidáno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu; následné míchání probíhalo na reciprokém třepacím stroji (200 kyvů/ /min) 6 hodin při teplotě 28 °C. Po této době bylo к suspenzi přidáno 100 ml vody a dále postupováno stejným způsobem,jak je uvedeno v příkladu 9.200 ml of a homogeneous aqueous suspension containing 20 g of wet mass of E. coli cells with penicillin acylase activity and 10 g of wet mass of washed waste cells of Penicillium chrysogenum was added after adjusting the pH to 6.8 10 ml of 10% (w / v) aqueous solution Sedipuru KA.Will flocculated for 25 minutes with slow stirring, then the pH was adjusted to 7.1 and 16 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added; subsequent mixing was performed on a reciprocating shaker (200 rpm) for 6 hours at 28 ° C. After this time, 100 ml of water was added to the suspension, and the same procedure was followed as in Example 9.
Bylo získáno 62,4 g vlhké hmoty agregátů,v nichž zachycená enzymová aktivita činila 52,6 % a jejich specifická aktivita byla 1,24 j/mg vlhké hmoty preparátu.Velikost agregátů se pohybovala průměrně okolo 350л®,přičemž к jejich úplné sedimentaci,provedené stáním suspenze 5 g vlhké hmoty/100 ml v odměmém válci,došlo za 20 minut.62.4 g of wet mass of aggregates were obtained in which the entrapped enzyme activity amounted to 52.6% and their specific activity was 1.24 J / mg wet mass of the preparation. The aggregate size was on average about 350 µL, while for their complete sedimentation, A suspension of 5 g of wet mass / 100 ml in a measuring cylinder was performed in 20 minutes.
Stabilita enzymové aktivity agregátů (suspenze 15 g vlhké hmoty/100 ml) byla sledována etejně jako v příkladu 9; po 60ti dnech nepřetržitého míchání nedošlo к poklesu aktivity penicilinacylázy v sedimentu, supematant byl Čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.The stability of the enzyme activity of the aggregates (15 g wet mass / 100 mL suspension) was monitored as described in Example 9; after 60 days of continuous agitation, there was no decrease in penicillin acylase activity in the sediment, the supernatant was clear and its enzyme activity was zero.
Příklad 11Example 11
Směs vlhkých past buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu (10 g) a odpadních promytých buněk Penicillium chrysogenum (10 g),byla doplněna vodou na objem 200 ml a po homogenizaci upravena hodnota pH suspenze na 7,1. К této suspenzi bylo přidáno 20 ml 2% (w/v) vodného roztoku nA mixture of E.coli wet pastes containing penicillin acylase (10 g) and washed washed cells of Penicillium chrysogenum (10 g) was made up to 200 ml with water and adjusted to pH 7.1 after homogenization. To this suspension was added 20 mL of a 2% (w / v) aqueous solution of n
Praestolu 444 K. Po přidání flokulantu byla suspenze intenzivně míchána a poté míchána pomalu 20 minut.Po této době bylo upraveno pH flokulované suspenze na hodnotu 7,4 a za míchání přidáno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu.Reakční směs byla umístěna na reciproký třepací stroj (200 kyvů/min); reakce probíhala při teplotě 31 °C po dobu 3 hodin.Po této době byla suspenze zředěna 100 ml vody a odstředěna (5000 G, 10 min).Sediment byl rozmíchán v 500 ml vody a homogenní suspenze filtrována přes středně porézní filtrační papír;vlhký koláč byl intenzivně vakuově odsát.Praestol 444 K. After the addition of the flocculant, the suspension was stirred vigorously and then stirred slowly for 20 minutes. After this time, the pH of the flocculated suspension was adjusted to 7.4 and 16 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added with stirring. (200 rpm); The reaction was run at 31 ° C for 3 hours. After this time, the suspension was diluted with 100 ml of water and centrifuged (5000 G, 10 min). The sediment was stirred in 500 ml of water and the homogeneous suspension filtered through medium porous filter paper; was intensively vacuumed.
Popsaným způsobem získané agregáty měly specifickou aktivitu penicilinacylázy 1,05 j/mg vlhké hmoty při zachycené aktivivě enzymu 55,5 %; jejich velikost činila průměrně 650run a ke kvantitativní sedimentaci došlo stáním suspenze (10 g vlhké hmoty/100 ml) v odměmém válci za 20 minut.Agregáty bylo možno velmi dobře oddělit filtrací přes středně nebo široko porézní filtrační papír.The aggregates described above had a specific penicillin acylase activity of 1.05 U / mg wet mass with a captured enzyme activity of 55.5%; their size was on average 650run and quantitative sedimentation occurred by standing the suspension (10 g wet mass / 100 ml) in a measuring cylinder in 20 minutes. The aggregates could be separated very well by filtration through medium or broadly porous filter paper.
Test stability enzymové aktivity agregátů byl prováděn za podmínek uvedených v předchozích příkladech (příklady 8,9 a 10).Po 30ti dnech nepřetržitého míchání suspenze agregátů (15 g vlhké hmoty/200 ml) byl supematant čirý,neopalescentní,в nulovou enzymovou aktivitou.K poklesu aktivity penicilinacylázy v sedimentu nedošlo.The stability assay of the aggregate enzyme activity was carried out under the conditions described in the previous examples (Examples 8.9 and 10). After 30 days of continuous agitation of the aggregate suspension (15 g wet weight / 200 ml), the supernatant was clear, nonalescent, null enzyme activity. there was no decrease in penicillin acylase activity in the sediment.
Příklad 12Example 12
Přibližně 1000 g odpadního buněčného materiálu Saccharomyoes carlsbergensis po výrobě fenylacetylkarbinolu bylo suspendováno v 10 1 vody a po 15 minutách míchání byl materiál odstředěn; bylo získáno 600 g vlhké hmoty promytých odpadních kvasinek.Approximately 1000 g of Saccharomyoes carlsbergensis waste cell material after phenylacetylcarbinol production was suspended in 10 L of water and centrifuged after 15 minutes of stirring; 600 g of wet mass of washed waste yeast was obtained.
Ze 2,5 g této vlhké pasty a 7 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu byloOf 2.5 g of this wet paste and 7 g of wet paste of E. coli cells containing penicillin acylase were
197 101 připraveno 50 ml homogenní suspenze,jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,4.Do této suspenze byl přidán 1 ml 50% roztoku glutardialdehydu a směs míchána 6 hodin na reciprokém třepacím stroji (200 kyvů/min) při teplotě 29,5 °C.Potom byla směs zředěna 2x vodou,odstředěna (500 G, 10 min),, sediment suspendován v 200 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).197 ml of a homogeneous suspension was prepared, the pH of which was adjusted to 7.4. To this suspension was added 1 ml of a 50% glutardialdehyde solution and the mixture was stirred for 6 hours on a reciprocating shaker (200 rpm) at 29.5 °. C. Then the mixture was diluted 2x with water, centrifuged (500 G, 10 min), the sediment was suspended in 200 mL water and centrifuged again (5000 G, 15 min).
Specifická aktivita penicilinacylázy u tohoto preparátu byla 2,28 j/mg vlhké hmoty a zachycená aktivita enzymu činila 60,4 %.Sedimentační rychlost agregátů o jejích průměrné velikosti 450/im, měřená sedimentací suspenze agregátů (0,05 g vlhké hmoty/ml) pomocí haematologické soupravy (MPW-01, Polsko),byla 16,5 Mi/min.The specific activity of the penicillin acylase in this preparation was 2.28 U / mg wet mass and the enzyme activity captured was 60.4%. The sedimentation rate of the aggregates of their average size of 450 µm, measured by sedimentation of the aggregate suspension (0.05 g wet mass / ml) using a haematological kit (MPW-01, Poland) was 16.5 Mi / min.
Vodná suspenze (10 g vlhké hmoty agragátů/25 ml) byla emulgována ve 100 ml směsného rozpouštědla chloroform-cyklohexan 1:4 (v/v) obsahující 2 % (v/v) smáčedla (Spán 85) a emulze intenzivně míchána 3 hodiny pří laboratorní teplotě.Po této době byla emulze odstředěna (5000 G,10 min) a sediment důkladně promyt 100 ml 10% (v/v) vodného roztoku smáčedla (Tween 20).Po oddělení roztoku smáčedla byl sediment 2x promyt 250 ml vody a vždy odstředěn (500 g, 5 min.a 5000 G, 15 min).The aqueous suspension (10 g wet matter / 25 ml) was emulsified in 100 ml of a 1: 4 (v / v) chloroform-cyclohexane mixed solvent containing 2% (v / v) wetting agent (Sleep 85) and the emulsion stirred vigorously for 3 hours After this time, the emulsion was centrifuged (5000 G, 10 min) and the sediment was thoroughly washed with 100 ml of a 10% (v / v) aqueous surfactant solution (Tween 20). After separating the surfactant solution, the sediment was washed twice with 250 ml of water. centrifuged (500 g, 5 min. and 5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem bylo získáno 6.2 g vlhké hmoty ošetřených agregátů,jejichž specifická aktivita Činila 131 % aktivity původní (2,98 j/mg vlhké hmoty).As described above, 6.2 g of wet mass of treated aggregates were obtained, whose specific activity was 131% of the original activity (2.98 J / mg wet mass).
Příklad 13Example 13
V homogenní suspenzi o objemu 200 ml obsahující 10 g vlhké pasty odpadních buněk Sacch.carlsbergensis zÍBkané a promyté jak je uvedeno v příkladu 12,a 40 g vlhké pasty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou,bylo upraveno pH na hodnotu 7,7 a vmícháno 20 ml 10% (w/v) vodného roztoku SedipuruR KA.Suspenze ponechána flokulovat 20 hodin při teplotě 8 °C a potom pH upraveno na hodnotu 7,8. Po přidání 32 ml 25% roztoku glutardialdehydu byla směs míchána na rotačním třepacím stroji (240 ot/min) 3 hodiny při teplotě 28 °C.Po této době byla reakční směs zředěna 100 ml vody a odstředěna (500 G, 5 min),sediment byl rozmíchán v 1000 ml vody a suspenze filtrována přes silonovou tkaninu o velikosti ok 350 <um.Agregáty byly z povrchu tkaniny smyty 200 ml vody a suspenze odstředěna (5000 G, 15 min).In a homogeneous 200 ml suspension containing 10 g wet paste of Sacch.carlsbergensis waste cells stained and washed as described in Example 12 and 40 g wet paste of E. coli cells with penicillin acylase activity, the pH was adjusted to 7.7 and mixed. 20 ml of a 10% (w / v) aqueous solution of Sedipur R KA. The suspension is allowed to flocculate at 8 ° C for 20 hours and then the pH is adjusted to 7.8. After addition of 32 ml of a 25% glutardialdehyde solution, the mixture was stirred on a rotary shaker (240 rpm) for 3 hours at 28 ° C. After this time the reaction mixture was diluted with 100 ml of water and centrifuged (500 G, 5 min), sediment The aggregates were washed off the surface of the fabric with 200 ml of water and the suspension was centrifuged (5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem bylo získáno 86,8 g vlhké hmoty agregátů o zachycené aktivitě penicilinacylázy 34,8 %,specifické aktivitě enzymu 2,1 j/mg vlhké hmoty a o jejich průměrné velikosti 750б-ит.As described above, 86.8 g of the wet mass of the aggregates were obtained, having a retained penicillin acylase activity of 34.8%, a specific enzyme activity of 2.1 U / mg wet mass, and an average size of 750 [deg.] C.
Z 10 g vlhké hmoty agregátů bylo připraveno 100 ml suspenze ve vodě a vpraveno do 500 ml banky opatřené třemi vlisy (zarážkami).Stabilita enzymové aktivity a mechanické vlastnosti byly zjišťovány jak je uvedeno v příkladu 3· Za 36 dní nepřetržitého míchání nepoklesla aktivita sedimentu, supematant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.Průměrná velikost agregátů činila 600 sedimentační vlastnosti zůstaly zachovány (10 g vlhké hmoty agregátů kvantitativně sedimentovalo stáním v odměmém válci za 5 minut).From 10 g of wet aggregate mass, 100 ml of suspension in water was prepared and introduced into a 500 ml flask equipped with three indentations. The enzyme activity stability and mechanical properties were determined as shown in Example 3. · The sediment activity did not decrease after 36 days of continuous mixing, the supernatant was clear and its enzyme activity was zero. The average aggregate size was 600 sedimentation properties were retained (10 g of wet aggregate mass sedimented quantitatively by standing in a measuring cylinder in 5 minutes).
Dále byla u popsaným způsobem získaných agregátu zjišťována katalytická účinnost při opakovaně provedené hydrolýze benzylpenicilinu na 6-APK tak,jak je uvedeno v příkladu 4,8 tím rozdílem, že bylo použito suspenze agregátů 13,5 g vlhké hmoty/50 ml vody a že výchozí koncentrace Na-soli benzylpenicilinu činila 7 % (w-v).Za těchto podmínek proběhl 1.cyklus konverze za 1 1/2 hodinu s účinností 89,1 % a 2.cyklus e účinností 91,4 % teoretického výtěžku 6-APK za 2 hodiny.Furthermore, the aggregates obtained in this manner were evaluated for catalytic activity in the repeated hydrolysis of benzylpenicillin to 6-APK as described in Example 4.8, except that an aggregate suspension of 13.5 g wet / 50 ml water was used and the benzylpenicillin Na-salt concentration was 7% (wv). Under these conditions, the 1 st conversion cycle was performed in 1 1/2 hour with an efficiency of 89.1% and the 2 st cycle with an efficiency of 91.4% of the theoretical yield of 6-APK in 2 hours .
197 101197 101
Příklad 14Example 14
Nepromjytý odpadní buněčný materiál Sacch.carlabergenais po výrobě piva ve formě vlhké pasty, v moŽaSví 20 g spolu se 40 g vlhké pasty buněk EcolLi obsítiujících penicilinacylázu byl použit k přípravě 400 ml směsné auspeenzejejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7.55.K této homogeemí p suspenzi bylo přidáno 40 ml 2% (w/v) vodného roztoku flokulantu Praestoln 444 K a směs byla pomsaLu míchána 20 minut.Potom bylo přidáno 32 ml 25% roztoku glutardialdehydu a za pomalého míchání míchadlem s ocelovou vrtulí bylo pH reakční směsi udržováno 10¾ (w/v) roztokem NaOH pomocí pH--tatu na hodnotě 6,9 po dobu 26 hodin při teplotě 10 °C.P0 této době byla reakční směs zředěna 250 ml vody a odstředěna (500 0, 5 min); sediment byl suspendován v 600 ml vody a opět odstředěn (5000 G, 15 min).Unwashed Sacch.carlabergenais waste cell material after brewing beer in the form of a wet paste, in an amount of 20 g together with 40 g of wet paste of EcolLi cells containing penicillin acylase, was used to prepare 400 ml of mixed auspeensis pH was adjusted to 7.55. 40 ml of a 2% (w / v) aqueous solution of Praestol n 444 K flocculant was added and the mixture was stirred for 20 minutes. Then 32 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added and the pH of the reaction mixture was maintained at 10¾ (v) NaOH solution at pH 6.9 at 26 ° C for 26 hours at 10 ° C. At this time, the reaction mixture was diluted with 250 mL of water and centrifuged (500 0.5 min); the sediment was suspended in 600 ml of water and centrifuged again (5000 G, 15 min).
Takto připravené agregáty obsahovaly v celkovém možaaví 90,4 g vlhké hmoty 52 % zachycené aktivity penOiilioacylázy,jejich specifická aktivita enzymu byla 1,14 j/mg vlhké hmoty a . jejich velikost byla průměrně 870 лшъThe aggregates thus prepared contained, in a total amount of 90.4 g of wet mass, 52% of the entrapped activity of the penilioiolaselase, their specific enzyme activity was 1.14 J / mg wet mass a. their size was on average 870 лшъ
V suspenzi 10 g vlhké hmoty agregátů/100 ml vody došlo ke kvÉaLnttativní sed^eenai^ stáním v odměrném válci za 10 minut.Se suspenzí těchto agregátů (15 g/200 ml) byl proveden test stability enzymové aktivity stejně jak je uvedeno v příkladu 11,Po 60ti dnech nepřetržitého míchání nedošlo k poklesu aktivity sedimentu a aktivita čiréhOjneopaleaceotoího su^ť^i^i^ta^tu byla nulová.In a suspension of 10 g of wet aggregate / 100 ml of water, there were qualitative sedimentation in a measuring cylinder in 10 minutes. The suspension of these aggregates (15 g / 200 ml) was tested for stability of the enzyme activity as described in Example 11. After 60 days of continuous agitation, there was no decrease in sediment activity, and the activity of the clear antioxidant was zero.
S 50 ml vodné suspenze obsíalhjící 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem získaných agregátů byly provedeny 2 opakované konverze 5% (w/v) roztoku Naa-ooi benoyУpenOičliou za stejných podmínek jako v předchozím příkladu,vyjma toho,že preparát byl z reakční směsi po 1.konvvrzi oddělen filtrací přes široko porézní filtrační papír a odsát; účinnost 1.konverze byla 87,5 % za 2 hodiny a 2.konverze 90,4 % teoretického výtěžku 6-APK za 1 1/2 hodiny.With 50 ml of an aqueous suspension containing 10 g of wet mass as described by the aggregates described above, 2 repeated conversions of a 5% (w / v) solution of NaOH-benobenzene solution were performed under the same conditions as in the previous example, except that the preparation was .conversion separated by filtration through a broadly porous filter paper and aspirated; the efficiency of the first conversion was 87.5% in 2 hours and the second conversion was 90.4% of the theoretical yield of 6-APK in 1 1/2 hour.
Příklad 15Example 15
Z 800 .g vlhké nepromyté odpadní pasty buněk Sacch.carlsbergensis po výrobě feoylacetyltarbioolu bylo připraveno 2000 ml suspenneekterá byla hommoenizována na mechanickém desintegrátoru o2000 ml of suspension was prepared from 800 .mu.g of unswashed waste paste of Sacch.carlsbergensis cells after the production of feoylacetyltarbiool.
Mяa0on-Gaalio 10ti násobnou recyklací při tlaku 520 kp/cm .Mяa0on-Gaalio 10 times recycling at 520 kp / cm.
Směs 2,5 ml takto připravené suspenze fragmentů kvasničných buněk a 2 g vlhké pasty buněk E. coli obí^ta^h^ájících penicilinahyláeu byla doplněna vodou na celkový objem 10 ml,po dokonalém rozmíchání bylo upraveno pH suspenze na hodnotu ·7,6.Poté bylo vmícháno 0,8 ml 25% roztoku glutardiaddehydu a směs rozzita na Petrího misku o průměru 9,5 cm a ponechána stát 15 minut při laboratorní teplotě.Reakční směs byla poté umístěna do mrsaicího boxu a při teplotě -20 °C ponechána po dobu 3 hodin; po této době byla umístěna na 16 hodin při teplotě +8 °C do komorové leloihe.Vzniklá houbovvtá hmota byla rozřezána,, homogenizována velmi intenzi Trním mícháním ocelovém vrtuov^m míchaHem po dobu 1 minuty a 2x promyta 150 ml vody; agregáty ' byly vždy odstředěny (500 G, 5 min).A mixture of 2.5 ml of a suspension of yeast cell fragments thus prepared and 2 g of a wet paste of E. coli cells containing penicillin ethyl alcohol was made up to a total volume of 10 ml with water, after thorough mixing the pH of the suspension was adjusted to · 7.6 Thereafter, 0.8 ml of a 25% glutardiaddehyde solution was stirred in and the mixture was spread on a 9.5 cm diameter Peter's dish and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. The reaction mixture was then placed in a hatching box at -20 ° C. 3 hours; after this time, it was placed in a chamber-leach for 16 hours at +8 ° C. The resulting spongy mass was cut, homogenized very intensively by shaking with a steel well for 1 minute and washed twice with 150 ml of water; the aggregates were always centrifuged (500 G, 5 min).
Zachycená aktivita penicilioahylάzy u získaných vlhkých agregátů činila 20,7 % a specifická akkivita enzymu byla 1,07 j/mg vlhké hmoty.U agregátů v suspenzi 4,1 g/100 ml byla sledována stabilita enzymové aktivity stejnějak je uvedeno v příkladu 8.Aktvita sedimentu klesla po 30ti dnech nepřetržitého míchíání na 84,3 % původní aktivity enzymu; supenaatant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.The captured activity of penicilioahylase in the obtained wet aggregates was 20.7% and the specific activity of the enzyme was 1.07 j / mg wet mass. The stability of the enzyme activity was monitored for the aggregates in suspension of 4.1 g / 100 ml as described in Example 8.Activity sediment decreased after 30 days of continuous mixing to 84.3% of the original enzyme activity; the supenaatant was clear and its enzyme activity was zero.
197 101197 101
Příklad 16Example 16
Vlhké odpadní mycelium dřevokazné basidiomycety Oudemmisiella mucida, 1 litr kašovité biomasy, po výrobě antibiotika mmcldinu,bylo vakuově Zfiirovváno na skleněné fritě S1 a 3« promyto 2,5 1 vody,čímž byl získán vlhký koláč dobře odsátých vláken vegetativního mmcelia.K · 10 g vlhké hmoty tohoto myceHa bylo přidáno 20 g vlhké hmoty buněk E.eoli obsíandíeíeh penicilinaeylázc a směs byla homooenizována ve vodě na objem 200 ml; pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,1 a pMoist waste mycelium of wood-destroying basidiomycetes Oudemmisiella mucida, 1 liter of pulp biomass, after the production of the antibiotic mmcldin, was vacuum dried on a glass frit S1 and washed 3 times with 2.5 liters of water to obtain a wet cake of well drained fibers of vegetative mmcelia. wet mass of this wash 20 g wet mass of E. coli cells containing penicillin was added and the mixture was homogenized in water to a volume of 200 ml; The pH of the suspension was adjusted to 7.1 and p
vmleháno 10 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru' KA a suspenze poneohána flokulovat 30 minut stáním při laboratorní teplotě.Když bylo pH vyvločkované suspenze upraveno na hodnotu 7,5,byla suspenze smíehána se 16 ml 25% roztoku gldtareiaedehcdd a umístěna na reeiproký třepaeí stroj (200 kyvů/min); reakee probíhala 1 1/2 hodiny při teplotě 28 °C. Po přidání 100 ml vody byla zředěná směs odstředěna (500 G, 5 mn)t9eei^me^,t promyt 250 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).Popsinýfa způsobem byla získána vlhká pasta mikrobíálníeh agreg^jejichž zaehyeená enzymová aktivita činila 61,5 %specifieká aktivita peniciliiaocltzc byla 1,71 j/mg vlhké hmoty a průměrná velikost agregátů činila 550/^. K úplné а^^е^ас! agregátů ve vodné suspenzi (5 g/lOOml)· stačilo stání v odměrném válei po dobu 10 minut.10 ml of a 10% (w / v) aqueous solution of Sedipur 'KA was added and the suspension was flocculated for 30 minutes at room temperature. When the flocculated suspension was adjusted to pH 7.5, the suspension was mixed with 16 ml of 25% gldtareiaedehcdd solution and placed. on a re-step shaker (200 rpm); The reaction was allowed to proceed for 1 1/2 hours at 28 ° C. After adding 100 ml of water was diluted mixture was centrifuged (500 g for 5 mn) 9eei t ^ Me ^ t washed with 250 ml of water, and centrifuged again (5000 G, 15 min) to afford .Popsinýfa wet paste mikrobíálníeh UNIT ^ whose enzymatic zaehyeená the activity was 61.5% the specific activity of penicillinocltzc was 1.71 U / mg wet mass and the average aggregate size was 550 µl. K complete а ^^ е ^ ас! of aggregates in aqueous suspension (5 g / 100 ml) · standing in a measuring cylinder for 10 minutes was sufficient.
Stejně jako v příkladu 6 byla eledována stabilita enzymové ·účinnosti agregátů a po 91 dneeh byl zjištěn pokles aktivity peniciliiaeclázc v sedimentu na 77 % aktivity původ^^^^mž supernatant byl čirý a měl nulovou enzymovou aktivitu.As in Example 6, the stability of the enzyme activity of the aggregates was eluted, and after 91 days, a decrease in the activity of penicillin-lime in the sediment was found to 77% of the activity of origin, the supernatant being clear and having no enzyme activity.
Míožsví 50' ml suspenze agregtů,která obsahovala 200 mg vlhké hnoy/ml bylo pobito k enzymové hydrolýze 7,5% (w/v) roztoku Na-8oSi benizCpplnieliid na 6-APK za podmínek uvedenýeh v příkladu 4. Jednorázová konverze proběhla za 1 1/2 hodiny s 73.9 % teoreteckého výtěžku 6-APK.An amount of 50 'ml aggregate suspension containing 200 mg wet manure / ml was killed to enzymatic hydrolysis of a 7.5% (w / v) solution of Na-8oSi benizCpplnieliid to 6-APK under the conditions of Example 4. 1/2 hour with 73.9% theoretic yield 6-APK.
Příklad 17Example 17
Nepromyté odpadní dřevokazné houby Οχ^ι^^ΙοΙ^ lmcOdaJps výrobě muuidinu včetně zbytků ferroentační kapaliny (kašovitá suspenze) bylo iiíšssví 300 g této suspenze smleháno se 600 ml vody^měs byla za míchání zahřáta na teplotu 60 °C a přidáno 300 ml 20% (w/v) roztoku kyseliny trichlorsotsvé,přlelhřtté na teplotu 75 °C,načež byla teplota suspenze zvýšena na 80 °C a při této teplotě zahřívána ještě 13 m.i^n^l;.Po,té byla směs ochlazena po přídavku 800 ml studené vody na teplotu 30 °C, odstředěna (5000 G, 15 min) a sediment rozmíehán ve 2 1 vody na homogeenní tdsppliZ,je jíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,3.OOetředěníl při 5000 G po dobu 30 mindt bylo získáno 230 g vlhké hmoty ošetřpnýeh · vláken.Unwashed wood decaying fungi were added to produce muuidine, including residual ferroentation liquid (slurry), and 300 g of this suspension were mixed with 600 ml of water. The mixture was heated to 60 ° C with stirring and 300 ml of 20% added. (w / v) solution of trichlorsotsvé, přlelhřtté at 75 ° C, then the temperature was raised suspension to 80 ° C and heated at this temperature for further 13 mi ≤ n ≤ L; .After, the mixture was cooled after the addition of 800 ml of cold of water to 30 ° C, centrifuged (5000 G, 15 min) and the sediment was slurried in 2 L of water to homogeneous tdsppliZ, which was adjusted to pH 7.3. Centrifugation at 5000 G for 30 mindt yielded 230 g wet fibers.
K homogenní suspenzi obstOmjícií 2,5 g vlhké hmaty této pasty a 10 g vlhké hmoty buněk Eci^l-i s penieil·inaoylázovsd aktivitou o výsledném objemu 200 ml bylo přidáno·po úpravě pH na hodnotu 7,3 8 ml 25% roztoku gldtardiaelhhyed,načež byla směs míehána stejně jako v příkladu 16, avšak 10 hodin při teplotě 25 °C a po této době stennim způsobem zpraeována.To a homogeneous suspension containing 2.5 g of the wet weight of this paste and 10 g of the wet mass of Eci? Li cells with a peniailoyl activity of a final volume of 200 ml was added after adjusting the pH to 7.3 8 ml of 25% gldtardiaelhhyed solution. The mixture was agitated as in Example 16, but at 25 ° C for 10 hours, after which time it was worked up in the wall.
Takto byly získány agregáty o zaehyeené aktivitě enzymu 35,4 % a specifieké aktivitě 2,29 j/ /mg vlhké hn^y. SSabllita jejieh enzymové ^lii^^ty byla · testována stejnějak je uvedeno v přikladu 16. Po 51 dneeh se v sdpernatantu objevilo 21»4 % výchozí aktivity penicilinaeclázc.Aggregates with a deteriorated enzyme activity of 35.4% and a specific activity of 2.29 U / mg wet slurry were obtained. The enzymatic stability of these enzymes was tested as described in Example 16. After 51 days, 21.4% of the initial penicillin aclase activity appeared in the supernatant.
Překlad 18Translation 18
Sdspenze 10 g kašovitého odpadního ly,celia OoC.mlcOde,jak je uvedeno v příkladu ^fbylo zře197 101 děno vodou na celkový objem 100 ml a suspenze byla desintegrována aonikácí 15 minut při laboratorní teplotě (Soniprobe ВАКЕ, Ltd.,Anglie).Homogenizováná suspenze byla zředěna 5x vodou a odstředěna (5000 G, 20 min).Získaná vlhká pasta fragmentů mycelia byla v množství 5 g smíchána a 15 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu,doplněna vodou na objem 200 ml. Po úoravě pH na hodnotu 7,7 bylo к homogenní suepenzi přidáno za míchání 20 ml 25% roztoku glutardialdehydu a dále bylo postupováno jak je uvedeno v příkladu 16 s tím rozdílem,Že míchání probíhalo 3 hodiny při teplotě 19,5 °C.A slurry of 10 g of slurry , C0 OC.mlcOde, as exemplified, was diluted with water to a total volume of 100 ml and the suspension was disintegrated and applied for 15 minutes at room temperature (Soniprobe ВАКЕ, Ltd., England). The resulting wet paste of mycelium fragments was mixed in an amount of 5 g and 15 g of the wet paste of penicillin aclase-containing E.coli cells, made up to 200 ml with water. After the pH was adjusted to 7.7, 20 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added to the homogeneous suepension, followed by the procedure of Example 16 except that stirring was carried out for 3 hours at 19.5 ° C.
Získané vlhké agregáty měly specifickou aktivitu penicilinacylázy 2,53 j/mg vlhké hmoty při zachycené aktivitě enzymu 25,5 %·The obtained wet aggregates had a specific penicillin acylase activity of 2.53 J / mg wet mass with a captured enzyme activity of 25.5% ·
Dále byla sledována katalytická účinnost agregátů při konverzi benzylpenicilinu provedené postupem, který je uveden v příkladu 6. Za 1 1/2 hodiny bylo dosaženo 71,9 % teoretické účinnosti hydrolýzy penicilínu na 6-APK.Furthermore, the catalytic activity of the aggregates in the conversion of benzylpenicillin according to the procedure described in Example 6 was monitored. 71.9% of the theoretical efficiency of penicillin hydrolysis to 6-APK was achieved in 1 1/2 hour.
Příklad 19Example 19
Ve 40 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu bylo připraveno 200 ml vodné suspenze.Po úpravě pH na hodnotu 7,5 bylo do homogenní suspenze vmícháno 20 ml 10% (w/v) vodného roztoku flokulantu (Sedipur KA),načež probíhalo vločkování při stání suspenze při laboratorní teplotě po dobu 25 minut. pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,5 a po přidání 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu byla reakční směs míchána 3 hodiny při teplotě 26 °C na rotačním třepacím stroji (240 ot/min).Směs byla zředěna 2x vodou a odstředěna (500 G, 5 min); sediment byl promyt 350 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).In a 40 g wet paste of E.coli cells containing penicillin acylase, 200 ml of an aqueous suspension was prepared. After adjusting the pH to 7.5, 20 ml of a 10% (w / v) aqueous flocculant solution (Sedipur KA) was stirred into the homogeneous suspension. flocculation by standing the suspension at room temperature for 25 minutes. The pH of the suspension was adjusted to 7.5 and after addition of 16 ml of a 25% glutardialdehyde solution, the reaction mixture was stirred for 3 hours at 26 ° C on a rotary shaker (240 rpm). The mixture was diluted 2X with water and centrifuged (500 G). , 5 min); the sediment was washed with 350 ml of water and centrifuged again (5000 G, 15 min).
Získaná vlhká pasta obsahovala agregáty navzájem vázaných enzymově aktivních buněk o průměrné velikosti 400/um.Zachycená aktivita penicilinacylázy byla 34,4 % a specifická aktivita enzymu 1,40 j/mg vlhké hmoty.Agregáty kvantitativně sedimentovalу stáním suspenze v odměmém válci (5 g/100 ml) za 10 minut.The obtained wet paste contained aggregates of bound enzyme-active cells with an average size of 400 µm. The captured activity of penicillin acylase was 34.4% and the specific activity of the enzyme was 1.40 J / mg wet mass. The aggregates quantitatively sedimented by standing the suspension in a measuring cylinder 100 ml) in 10 minutes.
Za podmínek uvedených v příkladu 6 byla testována stabilita enzymové aktivity popsaným způsobem získaných agregátů.Po 40 dnech nepřetržitého míchání zůstala aktivita enzymu v sedimentu zachována,přičemž supematant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.Under the conditions of Example 6, the stability of the enzyme activity was tested as described above. After 40 days of continuous agitation, the enzyme activity in the sediment was maintained, the supernatant being clear and its enzyme activity zero.
Za podmínek uvedených v příkladu 4 byla provedena jednorázová hydrolýza 6,25 % (w/v) roztoku Na-soli benzylpenicilinu na 6-APK 8 výsledkem 79,1 % teoretické účinnosti za 1 hodinu.Under the conditions of Example 4, a one-time hydrolysis of a 6.25% (w / v) solution of benzylpenicillin Na-salt to 6-APK 8 was performed resulting in 79.1% of theoretical activity over 1 hour.
Příklad 20Example 20
К 9,6 ml homogenní suspenze o pH 7,5 obsahující 0,5 g vlhké pasty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou a 0,25 g vlhké pasty buněk Bac.megatherium ošetřených trichloroctovou kyselinou, jejíž příprava je popsána v příkladu l,bylo přidáno 0,4 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Po promíchání byla suspenze lyofilizována.Hmota,která po lyofilizaci vznikla,byla promyta vodou, mechanicky rozrušena a odstředěna 1 minutu při 1200 G.9.6 ml of a homogeneous suspension of pH 7.5 containing 0.5 g of wet paste of E. coli cells with penicillin acylase activity and 0.25 g of wet paste of trichloroacetic acid-treated Bac.megatherium cells, the preparation of which is described in Example 1, was 0.4 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added. After stirring, the suspension was lyophilized. The mass formed after lyophilization was washed with water, mechanically disrupted and centrifuged for 1 minute at 1200 G.
V takto získaných agregátech o specifické aktivitě 0,4 j/mg vlhké hmoty,bylo obsaženo 14 % výchozí aktivity penicilinacylázy.In the aggregates thus obtained having a specific activity of 0.4 µg / mg wet mass, 14% of the initial activity of penicillin acylase was contained.
Příklad 21Example 21
К 9,2 ml homogenní vodné suspenze o pH 7»5,obsahující 3 g vlhké,částečně samovolně autolysovanéК 9.2 ml of homogeneous aqueous suspension, pH 7 »5, containing 3 g wet, partially self-lysed
197 101 pasty Ecc^l^ 8 penicilinacylázovou aktivitou,bylo přidáno 0,8 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Suspenze byla promíohána a přelita na Petriho misku o . průměru 9,5 cm.Po 15 minutách stání za laboratorní teploty byla miska přenesena na 3 , hodiny lo mrazicího prostoru při teplotě -20 °C a poté uložena 16 hodin při teplotě +8 °C. Vznnklá hmota navzájem vázaných buněk E.coli byla mechsoiicky rozrušena,promyta vodou a odstředěna 5 minut při 5000 G. '197 101 paste of Ecc ^ 18 with penicillin acylase activity, 0.8 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added. The suspension was mixed and poured onto a Petri dish at. After standing for 15 minutes at room temperature, the dish was transferred to 3 hours of freezer at -20 ° C and then stored at +8 ° C for 16 hours. The resulting mass of bound E. coli cells was mechanically disrupted, washed with water and centrifuged at 5000 G for 5 minutes.
Takto připravené agregáty obsahovaly 34,5 % výchozí enzymové Octi.ity a jejich specifická aktivita byla 3,3 j/mg vlhké hmoty.SSabilita enzymové aktivity agregátů (4 g/100 ml vody) byla hodnocena, jak je uvedeno v příkladu 8. Po 14 dnech nebyl pozorován pokles aktivity penícilinacyHzy v sedimentu^ akijivita enzymu ve slabě zakaleném supeematantu činila 10 % výcHozí aktivity penicilinacylázy. ,The aggregates thus prepared contained 34.5% of the starting enzyme Octitite and their specific activity was 3.3 J / mg wet mass. The stability of the enzyme activity of the aggregates (4 g / 100 ml of water) was evaluated as shown in Example 8. No decrease in the activity of the penicillin acylase in the sediment was observed at 14 days. The enzyme activity in the slightly turbid supernatant was 10% of the training activity of the penicillin acylase. ,
Claims (12)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
| DE19782833071 DE2833071A1 (en) | 1977-08-11 | 1978-07-27 | Microbial cell aggregate with penicillin acylase activity - consists of cells chemically bonded to carrier cells, useful for 6-amino-penicillanic acid prodn. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS197101B1 true CS197101B1 (en) | 1980-04-30 |
Family
ID=5397888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS197101B1 (en) |
| DE (1) | DE2833071A1 (en) |
-
1977
- 1977-08-11 CS CS532177A patent/CS197101B1/en unknown
-
1978
- 1978-07-27 DE DE19782833071 patent/DE2833071A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2833071A1 (en) | 1979-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhushan et al. | Immobilization of lipase by entrapment in Ca-alginate beads | |
| EP0034609B1 (en) | Immobilized enzyme(s) and microorganism(s) and their production | |
| Kath et al. | Mild enzymatic isolation of mannan and glucan from yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| JPH0218070B2 (en) | ||
| Champluvier et al. | Immobilization of β-galactosidase retained in yeast: adhesion of the cells on a support | |
| Knorr et al. | Chitosan immobilization and permeabilization of Amaranthus tricolor cells | |
| EP0594125A2 (en) | Carrier for supporting microorganisms, soil remediating agent using carrier, and method for remediating soil | |
| US5739015A (en) | Biotransformation of chitin to chitosan | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| RU2043995C1 (en) | Method of preparing glucane-chitosan complex | |
| Okita et al. | Covalent coupling of microorganisms to a cellulosic support | |
| El Menoufy et al. | Comparative studies of free and immobilized partially purified lipase from NRRL-599 produced from solid-state fermentation using gelatin-coated titanium nanoparticles and its application in textile industry | |
| CS197101B1 (en) | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof | |
| Kluge et al. | Production of 6-aminopenicillanic acid by immobilized Pleurotus ostreatus | |
| Iqbal et al. | Vegetable sponge as a matrix to immobilize micro‐organisms: a trial study for hyphal fungi, yeast and bacteria | |
| RAMÍREZ-LEÍN et al. | Hydrolysis of walls and formation of sphaeroplasts in Mucor rouxii | |
| DE3301102C2 (en) | ||
| West et al. | Polysaccharide production by sponge‐immobilized cells of the fungus Aureobasidium pullulans | |
| CN1059759A (en) | The preparation method of complex solidifying enzyme | |
| Förster et al. | Immobilization of citrate-producing Yarrowia lipolytica cells in polyelectrolyte complex capsules | |
| Dobreva et al. | Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable α-amylase, on polymer membranes | |
| Makins et al. | Co-synthesis of penicillin following treatment of mutants of Aspergillus nidulans impaired in antibiotic production with lytic enzymes | |
| EP0494950B1 (en) | Fungal cell wall material with flocculant properties, method for its production | |
| US4757008A (en) | Enzyme immobilization in a macroporous non-ionic resin | |
| JPH0372879A (en) | Manufacturing method of microorganism-immobilized fiber |