CS197101B1 - Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof - Google Patents
Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CS197101B1 CS197101B1 CS532177A CS532177A CS197101B1 CS 197101 B1 CS197101 B1 CS 197101B1 CS 532177 A CS532177 A CS 532177A CS 532177 A CS532177 A CS 532177A CS 197101 B1 CS197101 B1 CS 197101B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- aggregates
- activity
- enzyme
- wet
- Prior art date
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims description 10
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 84
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 22
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 137
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 109
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 11
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N deuterio(phenyl)methanone Chemical compound [2H]C(=O)C1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N 0.000 claims 1
- 239000003502 gasoline Substances 0.000 claims 1
- 150000005171 halobenzenes Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010955 niobium Substances 0.000 claims 1
- GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N niobium atom Chemical compound [Nb] GUCVJGMIXFAOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 7
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 abstract description 6
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 abstract description 6
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 abstract description 3
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 abstract 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 60
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 17
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 16
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- FCPVYOBCFFNJFS-UHFFFAOYSA-N sodium;3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound [Na+].O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 2
- 241000187419 Streptomyces rimosus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1-phenylpropan-2-one Chemical compound CC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCFUWBOSXMKGIP-UHFFFAOYSA-N 2-benzylpyridine Chemical compound C=1C=CC=NC=1CC1=CC=CC=C1 PCFUWBOSXMKGIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N D-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- ZYZWOSIRFVIBRH-UHFFFAOYSA-N chloroform;cyclohexane Chemical compound ClC(Cl)Cl.C1CCCCC1 ZYZWOSIRFVIBRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010409 ironing Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- CKHOZVOPYJLCNY-UHFFFAOYSA-N methanol;prop-2-enal Chemical compound OC.C=CC=O CKHOZVOPYJLCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 description 1
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/16—Enzymes or microbial cells immobilised on or in a biological cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/06—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by desacylation of the substituent in the 6 position
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(54) Mikr.Oiální buněčné agregáty k přeměně penicilínu na kyselinu
6-aminopen.iiiliánovou a způsob jejich přípravy
Vynález se týká mikrobiálních buněčných agregátůfobsahujících buňky s vysokým obsahem enzymu penicilinliylázy,rteré jsou vázány navzájem nebo na buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou buá celé,neporušené anebo fyzirálně,chemicky či biochemicky ošetřené buňky nebo jejich nerozpustné fragmenty>chemiikk,koovlentní vazbou a způsobu jejich přípr^fi^vy.Mi^i^r^l^J^é^lní buněčné agregáty jsou použitelné k přípravě 6-lminopeniciliгmové kyseliny enzymovou hydrolýzou penicilínu,zjjména bank^ení-cilínu, přččemi jejich vllstnosti,zjjménl chemicky vysoce stabilizovaná enzymová aktivita,dobré sedimentační a mechanliré vlastnosti,dovoluj jejich dlouhodobé pobití na principu enzymového reakto:iui,v8ákoov<é nebo kontinuálním způsobem,podle volby technologie enzymové hydrolýz.ytresp.volby typu reaktoru^ následnou izolací 6-^^^6^0iliánové kyseliny úpravou pH a teploty z čiré rapplinyyresužtujíií po jejich snadném oddělení.
Běžně známé způsoby přípravy 6-amino oceli iliEmové kyseliny ^-APK^kkerá je důležité meziproduktem pro připraví tzo.polovyitetcckých penňcilínů,jsou v podssatě čtyř základních typů, priČemi každý z nich má své výhody a nevýhody a tím ekonorněckílimity.
Jednorázové pouužCí nativních buněk eikroorganiseύfoOivahjjcíih aktivní enzym penicClCiacylázu k enzymové přeměně nebo fenoxymthylpeniiilínu na 6-APK; např.NCR patentový spis č.l 114 766 uvádí jednorázové pouužtí nativních buněk E.coli ke štěpení benzylp^i^í^c^íIí^í^u. .
Podstatnou nevýhodou vyiužtí tohoto postupu v praxi je požadavek stálé a opakované přípravy těchto buněk novou kultivací ve velkokapacitním fermentačním zařízení,nebot buňky se nedají
197 101
197 101 použít op akovvai ^nehledě na skutečnost kontaminace produktu bílkovinami z autolysovaných buněk a zbytky kultivační kapaliny a z toho vypllýrvjící složitosti volby vhodného izolačního postupu.
Chemický způsob přípravy б-APK z penicilínu; . tento způsobjdiskuitovímý např.v přehledném článku TRCcrringtona (Proč.R. Soc.Lond.B. 179. 321-333· 1871)je ekonomicky velice náročný^zejména pro nutnost chemického chránění skupin lenicilíiž,dále pro nutnost pobití velmi nízkých 'teplot reakční směsi při chemické hydrolýze (kolem -50 °C)„v neposlední řadě pro pobití velkého mnnoisví organických rozpouštědel s omezenou moonnosí jejich regenerace a konečně pro použití agresivních látek,které-přispívají ke značnému a rychlému opotřebení výrobní aparatury vlivem koroze.Výhodou tohoto postupu však je moonoet přípravy kvalitní 6-APKtniobiaahžící balastní bílkovinné příměsi a možnost hydrolýzy vysokých ^^β^^οί lenicilíiž s dobrý výtěžkem v izolačním stupni.
Způsob přípravy б-APK fyzikálně nebo chemicky zmobilizovanou lenlcllinaβylázož na nejrůznější anorganické, umělé organické nebo přírodní m^at^e^riály.Pr^o vazbu na tyto nosiče je používáno do různého stupně čištěných preparátů penicilinacylázy,zíkaných z buněk mikroorganismů relati^ně drahý ó,s ložit ými a hlavně ztráoovýi postupy.Tak napRČs. patentový spis 6.145 849 uvádí postup čištění lenicilliaβylázy a její vazby na ncsi^Tato mnibootulňboá příprava končí ziskem cca 30 % . původního mrnossví enzymu o Čistotě technického preparátu peniciliiaLβylázy 10 ai 20 .,vztaženo na čistý enzym.Tento technický preparát enzymu pak slouží k vazbě na některé nosiče např.ρolysaβharidového typu (komerčně dostupné pod názvem Sepharose) po jejich předchozí chemické aktivaci bromkyanem.
Nosiče tohoto a podobných typů jsou velice drahé,které náklady na vázaný enzym zvyš^í do té míryrie jen cca 200 násobné pobití vázaného enzymu ve srovnání s jednorázový použitím nativních buněk přináší lepší efektioost.Lioitžjícíoi ekonomickými faktory při.tomto způsobu výroby jsou tedy cena a dostupnost nosiče^em zaurnuící aktivaci nebo moíi^ik^i^:! nosiče a technologie izolačního postupu enzymu (cena preparátu) ve vztahu k dlouhodobé stabilitě a účinnooti opakovaně nebo kontinuálně využívaného zmobilizovaného enzymu pro přípravu 6-AMGPři tomto způsobu výroby je předností dobrá kvaHta 6-AJPKprosté biologických příoOstttrbonateliá s chemickým způsobem výroby a - podle některých údajů z časopisecké a patentové literatury,také jednoduchá izolace a dobrý výtěžek produktu.
Příprava б-APK fyzikálně nebo chemicky imobilizooanlýi buňkami produkčních mikroorganismů obsa^ícími penicilínacylázu. Tento způsob je zatím ne jméně prozkoumán a pokud je známOozatím není ve výrobním měřítku vyšíván.0 způsob vybití ioobilizovaných enzymově aktivních buněk jako biokatalyzátorů je zejména v několika posledních letech nebývalý zájem (E.J.Vnnamfme,Chem. Ií1..1076· 1976) a to z evidentních ekonomických důvodй,ieio:L při tomto způsobu odpadá především náročná a ztrátová technologie čištěni a izolace enzymu a větší ztráty jeho - aktivity během im^o^íi^:izace.
Je popsáno fyzikální uzavření m^i^k^(^l^i^i^:Lních buněk ob aaarn ujcích leniciliiacylázž^a to nati v» nich nebo částečně narušených toluenem^ agarboýoh granulí (^.patentový spis . Č.113 soehdále nativních buněk do poly(akrylmzdového) gelu (TS^^to, T.Tosa· I.Chibata, Europeeal.J.Appl·MicrbííoI.,2, 153· 197i6) nebo do vláken triacetátu celulosy (D.Dinneli· - Pro^Biochem. J, 9, 1972)·
Uvedené způsoby nejsou výhodné z hlediska průmyslového vybití,nebbí při tomto způsobu je rychlost enzymové reakce silně limitována difúzí dvojí difuzní bariérou (gel a buněčná stěna),
197 101 dochází k nepříznivému vytvoření gradientu pH lokální .kumižací produktů reakce (6-APK a kyseliny fenyloctové) a tím k inhikici reakce,v důsledku čehož se snižuje reakční rychlost a stupen hydrolýzy penicilínu a reakce se zastavuje obvykle na nízkém absolutním . výtěžku (40 až 70 %) při poměrně nízkých koncentracích štěpeného penicilínu (1 až 4 £).Další nevýhodou fyzikálního uzavření nativních buněk do gelové matrice je^že buňky v průběhu opakovaného použití lysují, takže se z nich enzym spolu s balastními bílkovinami uvolňuje,čímž se snižuje rychlost a účinnost enzymové transfomace a také CvO-ita produktu v důsledku obsažených bílkovin.
Dále je popsán chemický způsob ' imooilizace buněk mikroorganismů pro dudlících p^t^Cc^ííLícacylázu na umělé organické Vazba buněk na organický polymer syntetického původu se ' provádí smíšením s následnou chemickou reakcí buněk ve vodné suspenzi s cejčastěji sfércck^fai částicemi polymeru (získanými cíleně vedenou polymeraí ),jenž obsahuje skupiny chemicky aktivní ke skupinám povrchu bшΊtk.Renužluží polym mírní částic^Cteré nesou'celé buňky připojené chemicky» pravděpodobně kovaaentní vazbou^hemický způsob imobíiizace buněk různých mikroorganismů na umělé organické ^a^S<^]r4^1y vedoucí k preparátů^ použitelných k nejiůznějším enzymovým transformacím je popsán v NSR patentovém spisu DOS 2 513 929 a rovněž je známý výhradně k přípravě 6-APK.
Postup imooilizace enzymově aktivních buněk podle NSR patentového spisu DOS 2 513 929 spočívá v reakci buněk s reakti^nTÍm monomerem a v následné polymeraci nebo kopolymeraci nebo s glycidylmnthaCrylátivým polymeremtpopřípadě v kombinaci s kovalentní fixací enzymů uv^n^ltř buněk vhodným bifunkčním činidlem.
Známý postup přípravy a využití pevného biokatalyzátoru k přeměně ienzzCpuntiilinž na 6-APK spočívá ve vazbě hyperprodukčních mmlant J.coli obsíanuících vysoké mno^v! ^№.0111^acylázy na sférické částice syntetických polymerů především na bázi mmehí-acrylaldehydu (aktivní aldehydové skupiny^glycidylmethakrylátu (aktivní epoxidové skupiny) apod.,a to tak^e se polymer nejprve ošeuří amineimčímž se převede na příslušný abinopolyber a následné navázání buněk na povrch částice se provede pomocí bifimkčního činidla. Dlžlhlodlbá enzymová stabilita a účinnost získaných preparátu zmobilizovaných buněk při opakovaném použití pro hydrolýzu 7% (hmotai/objem) vodných roztoků solí na 6-APK v míchaném reaktoru a dobré sedimentační a mmehírnické vlastnosti u^c^Orí^^žjí průmzslové vyžití.
Zjistilo se супС^п pro vazbu buněk s vysoký^ obsahem pentcilitlαcylázy lze použit nejrůznějších mikroorganismů nebo jejich fragbentй,ktnré lze pro daný účel připravit cílenou СлИ^гЕvací. S výhodou lze použžt odpadních m.ae^i^r.álů mikroorganismů (odpadní biomasy) po fermentačních výrobách jakéhokoliv drUhu.Naαu.lzn použít odpadních kvasinek po výrobě piva,odpadního mrcceia při výrobě antibioiCk,mϊCnokytnltn,tzc;mU nebo ' odpadního buněčného maatriálu v podstatě po jakékoliv průmyslové biltrιnt80omιaci·Poslupem podle vynálezu lze tak mnohonásobně ekonomizovat výrobu 6-APK tímto způsobem^ebol cena buněk mikroorganismů jako c^íču je z«^<^<^I^í^S(^:lná ve srovnání s ja^ký^^^cOiLv uměle připravcnjfa nosičem syntetického nebo přírodního původu,v případě po^lžtí odpadní mikrobiální biomasy po většině výrob je převážně nullvá,nnboí s likvidací buněčného odpadu mmaí výrobní uoddtkcczviáště farbasenžické,čatto řeší odvozem těchto mmaeriálů do zemmačlských podniků ke hnojení polí čí k přidávání do krmných smměí, popřípadě spalováním.
Podesata vynálezu spočívá ve vyžiti mikrobiálních buněk a jejich fragmentů jako nerozpuit197 101 nýoh nosičů pro vazbu . mikrobiálních buněk obalujících požadovaný enzy^prostřednictvím do reakce vstupujícího bifunkčního činidla,glutrrdialdehydu.Kovalentní vazba mezi buňkou vázanou a buňkou nebo jejím fragmentem mmjící charakter nerozpustného noí^:iče,v^zniká převážně reakcí aminoskupin povrchu jedné buňky nebo jejíhi fragmentu s bifinxkčním činidlem na jedné straně a tímto činidlem s aminoskupinou druhé buňky na straně rruhé,rřieemž dojde ke kovalentnímu zesítění a fixaci bílkovin a tím i požadovaného - enzymu v takto vzniklém mikrobiálním agregátu.
KoovLlentní vazba je tady uskutečněna bifrnikčním činidlem,které reaguje především s aminoskupinami přirozeně se vyskyhuuících amincpolymerů tvořících povrchové struktury mikrobiální buňky (buněčná stěna,chstorlasmatická membrááia).U rrckιarhcntnícU mikrcorgani8mй,zejména bakterií, se této reakce účwtní především mukopolymer (miueen)9u eukaryontních mikroorganismů především chitin a ohitoβim.Do reakce vstupují pravděpodobně i strukturální bílkoviny buněčných povrchů. Chemickou strukturu buněčných povrchů bohatou na aminoskupiny dostatečně popř-sují pro prokaryontní mikrcorganiemy,zeeména bakterie,D.A.Reavley a R. E.Burge (v Adrvn.KicroCiiC.Phy-sid., X, 2-71, ed AHRoae & AccadPress, London N.Y., 1972))pro eukaryontní organismy, zejména plísně a vyšší houby, JM-A^nsou (v The Fugi, 1, 49-76, ed. G.C. Ainsworth & A.S.Sussman, Acad.Pese, NY. & London, 1965 ).U těchto druhů crgani8mů,kde je přirozeně se vysk^^ící amincpolymer tvořící integrální eoučáet nerozpustné struktury povrchu buněk pro reakci s bifrnkcčním činidlem nedoc^tuppý,kryhrický,např.u grammeggaivních mikroorganismů (bakterií), lze buňky libovolný způsobem destnove! a získat tak nerozpustné fragmenty buněk (gnosse), které lze již pro uvedený princip reakce podle vynálezu p^v^uíí;.Stejn^ě tak je možno chemicky, např.trCehCococtovcu kyselinou předem ošeeřit některé druhy mikroorgwiismů,např.z rodu BBacilus, kde je -mureinová vrstva překryta polymerem složeným z derivátů teichoových kyselin.Rezzutují dlouhá náhá nerozpustná dutá vlákna obsíaihuící na povrchu prakticky čistý muuein,na jejichž povrch lze pak buňky prostřednictvím bifunkčního činidla kovalentně vázat.Rovněž je možno předem ošeeřit buněčný nosič biochemicky, enzymový natrávením,např.hyczhmemchitináoou.Konečně je možné prostřednictvím vhodného fl·ckulačníhc činidla nebo jiných látek,účastnících se reakce s glutardLiarehhydem,kovdentně vázat buňky navzájem.
Postupem podle vynálezu rezuutují dobře зerimeettjícítnerczrlstné,kcvalentně zesítěné mikrobiální agregáty tvořící integrální jednotky s vysokým stupněm zachycené požadované enzymové akkivith,které lze opakovaně pouHt pro enzymovou katalýzu.
Předmětem vynálezu jsou mikrobiální buněčné agregáty obsíaiuuící buňky s vysokfa rnioostvím enzymu r®nicilinachlázh k přeměně penicilínu,zejména benzyhprniiClínu na kyselinu 6-aminopenioilínovou, vyznačené stím,že sestávají z enzymově aktivních mikroorganismů chemicky vázaných prostřednictvím polyfunkčních aldehydů,s výhodou glutjrrliarehhydu,navzeeem nebo na jiné buňky různých druhů organismů,kterýMi jsou buí celě,nercrušené,nativní anebo fhzikálněchhemickh 61 biochemicky ošetřené buňky . či nerozpustné fragmenty proka^o^ních nebo eukaryontních buněk různé moofologie.
Mlikodální buněčné agregáty podle vynálezu jsou dále vyznačeny tím,že celé,nercrušeně,nativní anebo fyzikálněiChemickyiči biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty rrokaryontních nebo eukaryontních buněk jsou ve tvaru vlákentkulcvitých,elirscirnícUf-popřípadě jinýoh útvarů o rozměrech 1,1 až 1 000 —- - či buněčných fragmentů těchto buněk vzniklých samovolnou
197 101 nebo uměle navozenou autolýzoufČi jakýmkoliv jinifa způsobemfnavozenam rozrušením.
Při výrobě mikrobiálních buněčných agregátů se podle vynálezu postupuje tak,že se nechají reagovat celé nepoouěenéfnativní anebo fyzikálnětchemicky či biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty prokaryontních nebo eukaryontních buněk různé moofologie s enzymově aktivními buňkami s penicilénacyláoovou aktivitou a polyfunkčním aldehydem.
Reakci lze provádět v přítorniooti flokulačního činidla s výhodou.flokulačního čiéillt,Oteré má nejméně dvě primárně anebo sekundárně aminové skupiny vstupující do reakce.
Způsobem podle vynálezu lze postupovat také tak^e se enzymově aktivní ' . buňky s penicilinacylázovou aktivitou ne^l^fi^;jí reagovat s polyfunkčním aldehydem,s výhodou glutadLaaieehďeem v přítomnooti flokulačního činidla.
Výhodné je použít flokulační činiHoikteré má nejméně dvě primární anebo sek.tminltkupCny vstupující do reakce.
Způsob podle vynálezu je dále vyznačený tímfíe po reakci s polyfunkčním aldehydem,s výhodou glutardtaleehddem se získané agregáty promyjí organickém rozpouštědlem neznale tčvujícím peéCiiiéαihyláuu,hibαéým ze tOuppcιéjθeetávvjíií z ChCllenxιaéUjbenéznéjbinéZnUjtlluenu,xhleéu, trichOometeαéuttettiehOoraetetnuttr,iehOoreetéuu,diehlorethéuшt cOlirbenzéuutmethylesoiutylketléulChilleexιaéooéjbiUyhacetátufplpřípjLlě jejich směsi.
Při výrobě mikrobiálních buněčných agregátů podle vynálezu je možné pouuítí odpadních buněk organismů nebo nerozpustných fragmentů z nich předem připravených či samovolně vzniklých.
Dále předmětem vynálezu je způsob přípravy miкrobiáléíce buněčných agregátů vyznačený tím, že se enzymově aktivní buňky s peniiClénacyláoovlu aktivitou smLísí s polyfunkčním aldehydem, s výhodou glutardtαleehddem,éαčeí se zchladí pod teplotu tání.
Při tomto způsobu lze s výhodou pouužt enzymově aktivních buněk s penicilénacytzoovou aktivitou Částečně autolyzovaných.
Dále je způsob přípravy mikrobiálních buněčných agregátů podle vynález^vyznačený tím,že se po^íje polyfunkčního aldehydu v mnnožtví 0,1 až 10 % hmolnéltníih (w/v).
MiCкoliální buněčné agregáty podle vynálezu obeplují buňky s vysokým mužstvím enzymu peéiiilénaihlázh, k přeměně peniiilénu,zejmééα bnnzyhpenéciliéu na kyselinu 6-tminopenécililnюvou, přičemž jsou enzymově aktivní mikroorganismy chemicky vázány navzájem nebo na jiné buňky různých druhů orgaéitmй,kterými jsou buá ielé,énplrušené,nativéí anebo fhzCkálněiehemCckh, či biochemicky ošetřené buňky či jejich nerozpustné fragmenty,přičemž vlastnosti těchto agregát^zejména chemicky vysoce ttαbilZoovjnt enzymová ak^^vita a dobré sedimentační a mecheaéiiOé vlastnosti, d^^^c^ol^;jí dlouhodobé opakované nebo konéiéuáléí pouužtí na proncipu enzymového reaktoru, podle libovolné volby technologie s následnou izolací 6-aminooenécilitnové kyseliny úpravou pH a teploty z čiré Oapatinyjrezzžtujíií po jejich snadném oddělení z reakční směěi.
U mikrobiálních buněčných agregátů podle našeho vynálezu jsou enzymově aktivní buňky mikroorganismů anebo jejich enzymově aktivní nerozpustné glutаrdtid.nehddem chemicky navázány na povrch celýce,éeplrušenýci,natCvéích anebo fhzCktléěiehemCcky . či biochemicky předem ošetřených prokaryontních nebo eukaryontních buněk různé molfolooie,či fragmentů těchto buněk, vzniklých samovolnou nebo uměle navozenou autolýzouiči jakýmkoOiv jin^m způsobem navozený rozrušením, čímž dojde nejen ke kovalentní vazbě mezi buňkami majícími charakter nosičetnýbrž i ke kovalentnímu zesítění vnitlobшlěčnéhl obsahu celého buněčného agregátu a tím i k chemické fi
197 101 б
xaci a stabilizaci penicilinacylázy a zamezení kontaminace vzniklé 6-aminopěniciliánové kyseliny biologickými příměsemi,zvláště bílkovinného charakteru.
Pro jejich přípravu lze použít buněk organismů nebo nerozpustných fragmentů z nich předem připravených či samovolně vzniklých,patřících mezi bakterie,zvláště grampositivní,gramnegativní a aktinomycety,nižší a vyšší houby,zejména plísně,kvasinky a vegetativní mycelia některých basidiomycet,vyjímaje všechny pathogenní mikroorganismy,rickettsie,mykoplasmata a viry.
Velik08t,8edimantaČní vlastnosti a stupen zachycené enzymové aktivity penicilinacylázy kovalentně zesítěných agregátů buněk jsou řízeny hmotnostním poměrem vázaných buněk ku buňkám nosiče Či jejich nerozpustným fragmentům,přítomností či nepřítomností flokulačního Činidla v reakční směsi,jeho kvalitou a koncentrací,dobou stání buněčné suspense v přítomnosti flokulantu,hodnotou pH reakční směsi a reakční teplotou a použitou technikou kovalentniho zesitění buněk glutardialdehydem,zahrnující stání,míchání o různé intenzitě,mražení a následné pomalé roz-i mrazování,lyofilizaci,sušení,nebo kombinaci těchto technik.
Obsahuje-li látka schopná způsobit flokulaci buněk nejméně dvě primární anebo sekundární aminoskupiny,vstupuje do reakce zprostředkované glutardialdehydem a má funkci mezibuněčné prostorové spojky.
>o reakci s glutardialdehydem získané buněčné agregáty se promyjí organickým rozpouštědlem neinaktivujícím penicilinacylázu v zesítěných agregátech.čímž dojde к vyplavení nezreagovaných lipoidních látek,které jsou součástí struktury buněčných povrchů,buněčných stěn a cytoplasmatických membrán,a tím ke zdokonalení difuzních vlastností těchto agregátů.
Způsobem podle vynálezu bylo použito к přípravě mikrobiálních buněčných agregátů hyperprodukční mutanty Escherichia coli - 77 obsahující vysoké množství penicilinacylázy,která byla získána genetickou manipulací postupem podle čs.autorského osvědčení č.162 274; kmen je chráněn podle čs.autorského osvědčení č.188 631.Je samozřejmé,že použitím jiného produkčního mikroorganismu (kmene) lze podle vynálezu připravit agregáty s odlišným kvalitativním a kvantitativním zastoupením enzymových aktivit.
Velikost mikrobiálních agregátů byla posuzována mikroskopicky (optickým mikroskopem) в použitím kalibrovaného měrného okuláru při různém zvětšení.Některé agregáty byly posuzovány scann-elektronovým mikroskopem.Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny buí centrifugací při definované relativní centrifugační síle a době (obvykle 500 G, 5 min.a méně),nebo použitím sedimentační hematologické soupravy běžně užívané při vyšetřování sedimentace krevních tělísek po odběru krve v humánní medicíně (FW test),popřípádě sedimentací stáním v odměrném válci.
Stabilita enzymové aktivity mikrobiálních agregátů byla hodnocena dlouhodobým třepáním vodné suspenze těchto agregátů (obvykle 10 g vlhké hmoty/100 ml) při teplotě 30 °C v 500 ml varných baňkách umístěných na rotačním třepacím stroji o počtu otáček 240/min.Ve zvolených časových intervalech byly odebírány vzorky suspenze a hodnocena enzymová aktivita v sedimentu a supe mat antu.
V některých případech byly hodnoceny mechanické vlastnosti mikrobiálních agregátů dlouhodobým třepáním vodné suspenze těchto agregátů za výše uvedených podmínek s tím rozdílem,že banky byly opatřeny jedním nebo několika vlisy (zarážkami).Mimo enzymovou aktivitu sedimentu a supematantu byla měřená rychlost sedimentace a průměrná velikost agregátů po vystavení mechanickým vlivům.
197 101
Aktivita penicilinacylázy byla hodnocena spektrofotometricky barevnou reakcí p-dimethylaminobenzaldehydu a 6-APK podle čs.patentového spisu δ.116 959 v modifikaci podle Balasinghama a sp.(Biochim.Biophys. Acta, 276. 250, 1972),při 42 °C a hodnotě pH 7,6 v oblasti reakční kinetiky nultého řadu.Jednotka enzymové aktivity je takové množství enzymu,které katalýzuje vznik jednoho <umolu 6-APK z benzylpenicilinu,respektive jeho solí za hodinu.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení,aniž by se jimi omezoval.
Příklady provedení
Příklad 1
Submerzní kultivací asporogenního kmene Bacillus megatherium CCM 2037 ve 150 1 fermentačním tanku při teplotě v rozmezí 40 až 48 °C v přítomnosti vysokých koncentrací aminokyselin (ve formě kukuřičného extraktu) postupem podle J.Chaloupky a sp.,(Biotechnol.and Biosng.Symp.No. 4, 985 až 993# 1974) bylo získáno přibližně 3 000 g buněčné hmoty.Tímto způsobem bylo docíleno tvorby velmi dlouhých vláken uvedeného kmene.
000 g takto získané nativní buněčné hmoty bylo suspendováno ve 2 000 ml vody,za míchání zahřát o na 64 °C a přidáno 4 000 ml 10% (w/v) kyseliny trichloroctové předehřáté na 62 °C.Směs byla za míchání ohřátá na 80 °C a při této teplotě zahřívána 20 minut.Poté byla směs ochlazena na 30 °C,suspenze buněk odstředěna a buněčná hmota promyta 25 1 vody.Takto bylo získáno 1010 g vlhké buněčné hmoty ve formě pasty; velikost vláken se pohybovala v rozmezí 15 až 30 лип.
7.5 g vlhké hmoty popsaným způsobem získané a ošetřené buněčné pasty B.megatherium bylo spolu s 15 g vlhké hmoty buněk E.coli - 77 obsahujících penicilinacylázu suspendováno v 50 ml O,1M fosfátového pufru, pH 7,0 v erlenmayerově baňce a přidány 4 ml 50% roztoku glutardialdehydu. Baňka s reakční směBÍ byla umístěna na reciproký třepací stroj o počtu kyvů 200/min. při teplotě 27,5 °C po dobu 3 hodin.Poté byla reakční směs zředěna 6x vodou,odstředěna (1000 G,5 min.) a sediment suspendován do 250 ml vody a suspenze znovu odstředěna (5000 G, 10 min.)· Popsaným postupem bylo získáno 23 g vlhké hmoty (ve formě pasty) mikrobiálních agregátů obsahujících 4%4 % původní aktivity penicilinacylázy o specifické aktivitě enzymu 2,32 j/mg vlhké hmoty preparátu.Velikost agregátů činila průměrně 25 Лип.
2.5 g vlhké hmoty agregátů suspendované v 50 ml vody kvantitativně eedimentoval· při 100 G,5 min. (Čirý supematant).
Vodná suspenze získaných agregátů (15 g pasty/50 ml) byla emulgována ve 100 ml toluenu v poměru Ií4 (v/v) obsahujícím 2 % (v/v) smáčedla (SPAN-85) a tato emulze byla míchána v 500 ml varné baňce se třemi vlisy (zarážkami) na rotačním třepacím stroji (240 ot/min.) 3 hodiny při 28 °C.Emulze byla odstředěna (5000 G, 10 min.) a sediment byl 2x promyt 50 ml 10% (v/v) vodného roztoku smáčedla (Tween-20) a 2x 250 ml vody; suspenze odstředěna vždy 15 minut při 5000 G. Specifická aktivina enzymu popsaným způsobem ošetřených agregátů činila 3,45 j/mg vlhké hmoty, tj. 149 % hodnoty specifické aktivity neošetřených agregátů.
197 101
Příklad 2
Za 300 g vlhké pasty nativních (neošetřených) buněk Bacillus megatheriím získané kultivací podle príkladi 1 bylo připraveno 1000 ml suspenze v , 0,05 '$> (w/v) NaCl a její pH upraveno - na hodnotu 7,0.Po ohřátí suspenze na 36 °C bylo přidáno 0,2 g vaječného a směs při této teplotě míchána 30 minuu,poté byla hodnota pH upravena na 9,0 25% roztokem NaOH a směs prudce ohřáta na 80 °C a zahřívána ještě 10 minut při této teplotě.Bměs byla ochlazena na 30 °C a hodnota pH upravena konc.kyselinou chlorovodíkovou na 7,0.
Z 10 g této suspenze a 10 g vlhké -pasty buněk E.coli - 77 ob8íalhlíiích penicilinacylázu bylo připraveno 50 ml vodné suspenze a její pH upraveno na hodnotu 7,6 - 50% (w/v) roztokem NaOH a přidány 2 ml 50% roztoku glutardiaieehydu.Reakční směs byla míchána na reciprokém třepacím stroji (200 kmiiů/min.) 6 hodin při teplotě 29 °C,poté zředěna 2x vodou a odstředěna (500 G, 10 min.); sediment byl rozmíchán ve 200 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min. ).
Popsaným způsobem získaná vlhká pasta agregátů obsahovala ' 24,9 % původní aktivity pěníciliiCLiylázy; specifická akivitc enzymu činila 1,44 j/mg vlhké hmoty preparátu.Agregáty vykazovaly průměrnou velikost HOftum a k jejich úplné sednminiaci vedlo odstředění při 500 G po dobu 10 minut (čirý supe]maClaΊi).
Příklad 3
Buněčná pasta B.megatheriím ošetřená - kyselinou t.richrooocrovru podle příkladu l,bylc v mnořství 10 g vlhké hmoty smíchána s 20 g - pasty buněk E.cooi rb81Clelíiíie penicilinciyLázu a ze směsi připraveno 200 ml vodné s^peene^o jíž hodnota pH byla upravena na 7,9 50% roztokem NaOH.K suspenzi bylo přidáno 20 ml 10% vodného roztoku (w/v) Sedipuru* ^zamícháno a poněcháno 18 hodin stát při teplotě +8°C.Po této době bylc hodnota pH upravena nc 7,4 25% roztokem NaOH a do suspenze vmícháno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu; směs ponechána stát 3 hodiny při teplotě
24,5 °C,poté bylo přidáno 100 ml vody,suspenze odstředěna (500 G 10 min.) a sediment 'uuspendován v 1000 ml vody a zfilmován přes silonovou tkaninu- o velikosti ok 500fum.Aggegáty zachycené na filtn byly suspendovány ve 200 ml vody a odstředěny (5000 G, 15 min.).
Získaný preparát (56,2 g vlhké hmoty) obsahoval agregáty o velikosti průměrně 1400<Um o specifické ckkivitě enzymu 0,99 j/mg vlhké hmooy; zachycená ck;ivitc činila 30,5 % původní aktivity peniciLiiciyLázy.Stií vodné suspenze (10 g/100 ml) agregátů v odměmiém válci vedlo ke kvcanitctivní sedimeniaci během 5ti minut.
U popsaným způsobem získaných agregátů byla testována stabilita enzymové aktivity spolu s mechanickými vlastnostmi při dlouhodobém míchání vodné suspenze 10 g vlhké . - hmoty agregátů (100 ml v 500 ml varné bance) opatřené jedním vlisem (zarážkou) tck,jck je uvedeno v popisu vynálezu. Za 60 dní klesle počáteční aktivita sedimentu nc 98,5 % a v supernatantu se olovil slabý zákal; zc uvedenou dobu nepřetržitého míchání činila velikost agregátů průměrně 1000<um a - rychlost sedimentace byla o něco pomalejší, (čirý supe та ten t rezultovel stáním v odměmém válci ze 10 minuu).
Příklad 4
Buněčná - paste E.coli ^βι^^οί peniciLinaiylázu byla suspendována ve vodě nc hodnotu 400 mg vlhké hmooy/ml a teto suspenze byla deelntegrována čtyřnásobnou recyklací ne mechanickém des197 101 integrátoru Manton-Gaulin při tlaku 340 kp/cm při laboratorní teplotě.Homogenát byl odstředěn (5000 G/1 h).
g vlhké hmoty fragmentů E.coli bylo ve směsi a 20 g vlhké hmoty neporušených buněk E.coli téhož kmene obsahujících penicilinacylázu suspendováno ve vodě na výsledný objem 200 ml.Hodnota pH suspenze byla upravena 25% roztokem NaOH na 7,5 a suspenze byla po smíšení s 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu vpravena do 500 ml varné baňky a umístěna na rotační třepací stroj.Reakce probíhala za míchání (240 ot/min) 3 hodiny při teplotě 26 °C.Poté byla reakční směs zředěna 100 ml vody a odstředěna (500 G, 5 min),sediment promyt 250 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).
V takto získaném preparátu mikrobiálních agregátů (41,5 g vlhké hmoty) bylo zachyceno 81 % původní aktivity penicilinacylázy,specifická aktivita enzymu činila 1,80 j/mg vlh é hmoty preparátu. Velikost agregátů byla průměrně 320/um a jejich úplné sedimentace bylo docíleno stáním suspenze ve válci (5 g vlhké hmoty agregátů/100 ml) po dobu 10 minut.Dále byla sledována stabilita enzymové účinnosti agregátů podobně jako v příkladu 3; baňka nebyla však opatřena vlisem.Po 40 dnech nepřetržitého míchání nedošlo к poklesu enzymové aktivity v sedimentu a čirý supematant vykazoval nulovou aktivitu.
Katalytická účinnost mikrobiálních agregátů byla ověřena při opakovaně prováděné hydrolýze benzylpenicilinu.Množství 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem připravených agregátů bylo vpraveno do 100 ml míchaného reaktoru a doplněno na 50 ml vodou.Teplota během enzymové hydrolýzy byla udržována na 37 °C a prováděna kontinuální úprava pH na hodnotu 7,6 čpavkovou vodou.Agregáty byly vždy odděleny z reakční směsi odstředěním (500 G, 5 min) a použity pro další opakovaný cyklus enzymové konverze.Za uvedených podmínek byla účinnost konverze 6,25% roztoku Na-eoli benzylpenicilinu na 6-APK 82,3 % za 1 1/2 hodiny pro první cyklus, 81,5 % za 1 1/2 hodiny pro
2.cyklus a 82,6 % za 1 1/2 hodiny pro 3·cyklus opakovaného použití.
Příklad 5
Z 10 g vlhké hmoty nativních buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu a 5 g vlhké hmoty fragmentů buněk E.coli téhož kmene získaných postupem uvedeným v příkladu 4,bylo připraveno 50 ml vodné suspenze,jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,5. К této suspenzi bylo přidáno 2 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru KA a vmícháno 4 ml 25% roztoku glutardialdehydu a směs nalita na kovový tác z nerezové oceli v tenké vrstvě.Vrstva byla ponechána 15 minut při laboratorní teplotě,dále pak 3 hodiny při teplotě -20 °C a nakonec pomalu rozmrazována 16 hodin pří teplotě 8 °C.Získaná hmota byla za vlhka rozřezána a útvary smíchány se 100 ml vody.Poté byly částice homogenizovány 1 minutu velmi intenzivním mícháním ocelovým vrtulovým míchadlem a homogenát odstředěn (500 G, 5 min).Sediment byl suspendován v 500 ml vody a filtrován přes kovové síto z nerezové oceli (průměr ok 0,7 mm).Zachycené agregáty byly ze síta smyty 250 ml vody a odstředěny (5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem získané mikrobiální agregáty vykazovaly průměrnou velikost 1750rum a kvantitativně eedimentovaly při stání suspenze (2,5 g vlhké hmoty agregátů/50 ml) za 5 minut.Zachycená enzymová aktivita preparátu byla 34,3 % při specifické aktivitě 1,23 j/mg vlhké hmoty.
5,5 g vlhké hmoty těchto agregátů bylo suspendováno ve vodě na celkový objem 100 ml a vpraveno do 500 ml varné baňky 8 jedním vlisem a způsobem uvedeným v příkladu 3 byla sledována stabilita
197 101 aktivity penicilinacylázy a mechanické vlastnosti agregátů.Po 30ti dnech nepoklesla enzymová aktivita v sedimentu; slabě opalescentní supematant nevykazoval enzymovou aktivitu a agregáty o průměrné velikosti 1200/um sedimentovaly za výše uvedených podmínek zcela za 10 minut.
Příklad 6
Vlhký odpadní buněčný materiál Streptomyces rimosus po výrobě oxytetracyklinu (1500 g vlhké hmoty) byl promyt 20ti litry vody a odstředěn na poloprovozní centrifuze Sharples s výtěžkem 1300 g vlhké hmoty tohoto materálu.
g vlhké hmoty těchto nativních promytých buněk a 20 g vlhké hmoty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu bylo rozmícháno ve vodě na celkový objem 200 ml; к suspenzi bylo přidáno 16 ml 25$ roztoku glutařdialdehydu.Reakční směs byla pomalu míchána kovovým vrtulovým míchadlem (400 ot/min) 3 hodiny při teplotě 20,5 °C,přičemž bylo pH reakční směsi udržováno 10$ roztokem NaOH pomocí pH-statu na hodnotě 7,0.Po této době byla suspenze zředěna přidáním 100 ml vody a odstředěna (500 0, 5 min); sediment byl dvakrát promyt 250 ml vody a odstředěn (5000 G, 15 min). Popsaným způsobem bylo získáno 24,2 g vlhké hmoty mikrobiálních agregátů·Zachycená aktivita penicilinacylázy v tomto preparátu činila 28,6 $, specifická aktivita enzymu byla 1,52 j/mg vlhké hmoty preparátu.Agregáty ve vodné suspenzi 5 g vlhké hmoty/100 ml kvantitativně sedimentovaly po 5ti minutách stání; jejich velikost se pohybovala průměrně okolo 450<um.
Za podmínek uvedených v příkladu 3 byla testována stabilita enzymu u těchto agregátů s tím rozdílem,že varná banka nebyla opatřena vlisem.PO 28 dnech míchání nebyl zjištěn pokles aktivity enzymu v sedimentu,přičemž ve slabě zakaleném supematantu bylo zjištěno 5,9 $ výchozí enzymové aktivity suspenze.
Dále bylo použito 50 ml suspenze,která obsahovala 5 g vlhké hmoty agregátu ve vodě к jednorázové enzymové hydrolýze 6,25 $ (w/v) roztoku Na-soli benzylpenicilinu na 6-APK, za podmínek u* vedených v příkladu 4 s teoretickým výtěžkem 73· 5 $ 6-APK za 2 hodiny.
Příklad 7
Vlhká pasta buněk Streptomyces rimosus získaná promytím odpadního buněčného materálu,jak je uvedeno v příkladu 6,byla v množství 900 g rozmíchána v 1100 ml vody a po ohřítí této suspenze na 30 °C bylo přidáno 2000 ml 10$ (w/v) roztoku kyseliny trichloroctové předehřáté na teplotu 80 °C; směs byla zahřáta na teplotu 80 °C za pomalého míchání a při této teplotě udržována ještě 15 minut.Ke směsi byly přidány 4 1 studené vody a buňky separovány odstředěním na poloprovozní odstředivce Sharples.Buněčná hmota byla promyta 20 1 vody a odstředěna na témže zařízení do formy buněčné pasty.
2,5 g vlhké hmoty této pasty a 5 g vlhké pasty buněk E.coli s pěnicilinacylázovou aktivitou bylo suspendováno ve vodě na celkový objem 50 ml; hodnota pH suspenze byla upravena na 7,25 a přidán 10$ (w/v) vodný roztok Sedipuru KA tak,aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi byla 0,5 $ w/v.Směs byla krátce pomalu zamíchána a poté při stání po dobu 30ti minut probíhala flokulасе.Hodnota pH flokulované suspenze byla opět upravena na 7,25 a přidáno 2 ml 50$ roztoku glutardialdehydu a reakční směs byla umístěna na reciproký třepací stroj (200 kyvů/min);
,reakce probíhala 4 1/2 hodiny při teplotě 29 °C.Po této době byla reakční směs zředěna 2x vodou a odstředěna (500 g, 10 min),sediment byl suspendován ve 200 ml vody a znovu odstředěn
197 101 (5000 d, 15 min).
Popsaný^ způsobem bylo získáno 18,6 g vlhké hmoty agregátů; zachycená aktivita pěnícilinacylázy činila 67 % specifická aktivita enzymu byla 1,35 j/mg vlhké hmoty prepwrátu.Velitost agregátů se pohybovala přibližně okolo 300 rum a při navážce 2,5 g vlhké hmoty agregátů/50 ml vody byla jejich sedimentační rychlost měřená pomocí haematologické soupravy (MPW - 01, Poleko),
15,5 ' mm/min.
Příklad 8
Ze 2 g vlhké hmoty buněk E.coli obsíanUících penicilinacylázu a 1 g vlhké hmoty promytého odpadního buněčného (nativní biomasy) Stmptomyces rimoeus.bylo připrvvene ’ 10 ml vodné su8pennzfje jíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,6 a .přidáno 0,8 ml 25% roztoku glutard i aldehydu.
Směs byla po zamíchání nalita na Petriho misku o průměru 9,5 cm.ponechána stát 15 minut při laboratorní teplotě.pak 3 hodiny při teplotě -20° C a poté ponechána 16 hodin při teplotě +8 °C stát.Po této době byla hmooa rozrušena velmi intenzi^niím mícháním ve 150 ml vody ocelo-^ým . vrtulovým míchaHem 1 minutu a odstředěna (500 g, 5 min^sediment suspendován ve stenném objemu vody a znovu odstředěn (5000 0, 10 min).
Získaný preparát mikrobiálních agregátů o specifické !^1^:Ív:Ltě penicilinacylázy 2,22 j/mg vlhké hmoty a o zachycené !^t^:Lv:Ltě enzymu 34,2 % byl umístěn ve vodné suspenzi (3,8 g vlhké hmoty agregátů/100 ml) do 500 ml varné baňky bez vlisu a testována stabilita. enzymové aktivity jak je uvedeno v příkladu 3«Po 14 dnech nepřetržitého míchání klesla aktivita sedimentu .na 93,3 % původní enzymové aktivity; supematant byl .čirý a aktivita penicilinacylázy v něm byla nulová.
Příklad 9
Odpadní buněčný mmlteiiál. (5 1 řídké suspenze) Penicillúm chrysogenum po výrobě penicilínu byl prom. 25 1 vody a vlhký koláč dobře .odsát.Bylo získáno 550 g vlhké pasty buněčného maaaríálu.
Z 10 g této vlhké pasty .a 30 g vlhké pasty buněk E.coli obsstnjících penicilinacylázu bylo připraveno 200 ml suspenze v 0,1 M fosfátovém pufrui.pH 7,5· K homogenní suspenzi bylo přidáno 16 ml 50% roztoku glutardialdehylu a mícháno 1,5 hodiny při teplotě 24 ’ °C na rotačním třepacím stroji (?40 ot/min).Reakční směs byla zředěna vodou na dvojnásobek objemu a odstředěna (500 G, 5 min); sediment byl suspendován v 300 ml vody a opět odstředěn (5000 G. 15 min).
Popsaným způsobem získaný preparát vykazoval specifickou aktivitu enzymu 2,20 j/mg vlhké hmoty, zachycená aktivita penicilinlcylázy byla 43,5 %.Velikost agregátů se pohybována průměrně okolo 220<um . a k úplné θι^^ι^οι agregátů (suspenze 100 mg vlhké hmooy/mÍ.) vedlo k odstředění při 500 G (5 min).
Testování stability penicilinacylázy u získaných agregátů (5 g vlhké hm0^/100 ml) probíhalo stejně.jak je uvedeno v příkladu 8.Po 20ti dnech nepřetržitého mícháni nedošlo k poklesu enzymové· aktivity sedimentu; v čirém supernatantu nebyla nalezena žádná enzymová aktivita.
Vlhká pasta agregátů o hmotě 15 g byla ošetřena směsným organickým rozpouštědlem,podobně jako v příkladu 1. Tentokrát však 50 mi butylacetátu obsahnuicího 1 % (v/v) smááedla (SPÁN 85) a s tím rozdílea^e třepání emulze probíhalo 2 hodiny a že sediment byl promyt 1x100 ml 2,5% (v/v) roztoku smááedla (TWEEN 20) a 3x250 ml vody.OOetřené agregáty měly specifickou aktivitu penicilínacylázy 3»67 j/mg vlhké hmoy,ttj167 % specifické aktivity neošetřených agregátů.
; ' -'L'··:
197 101
Příklad 10
Ke 200 ml homogenní vodné suspenze obsahující 20 g vlhké hmoty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou a 10 g vlhké hmoty promytých odpadních buněk Penicillium chrysogenum bylo přip dáno po úpravě pH na hodnotu 6,8 10 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru KA.Za pomalého míchání ponecháno flokulovat 25 minut,poté bylo pH upraveno na hodnotu 7,1 a přidáno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu; následné míchání probíhalo na reciprokém třepacím stroji (200 kyvů/ /min) 6 hodin při teplotě 28 °C. Po této době bylo к suspenzi přidáno 100 ml vody a dále postupováno stejným způsobem,jak je uvedeno v příkladu 9.
Bylo získáno 62,4 g vlhké hmoty agregátů,v nichž zachycená enzymová aktivita činila 52,6 % a jejich specifická aktivita byla 1,24 j/mg vlhké hmoty preparátu.Velikost agregátů se pohybovala průměrně okolo 350л®,přičemž к jejich úplné sedimentaci,provedené stáním suspenze 5 g vlhké hmoty/100 ml v odměmém válci,došlo za 20 minut.
Stabilita enzymové aktivity agregátů (suspenze 15 g vlhké hmoty/100 ml) byla sledována etejně jako v příkladu 9; po 60ti dnech nepřetržitého míchání nedošlo к poklesu aktivity penicilinacylázy v sedimentu, supematant byl Čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.
Příklad 11
Směs vlhkých past buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu (10 g) a odpadních promytých buněk Penicillium chrysogenum (10 g),byla doplněna vodou na objem 200 ml a po homogenizaci upravena hodnota pH suspenze na 7,1. К této suspenzi bylo přidáno 20 ml 2% (w/v) vodného roztoku n
Praestolu 444 K. Po přidání flokulantu byla suspenze intenzivně míchána a poté míchána pomalu 20 minut.Po této době bylo upraveno pH flokulované suspenze na hodnotu 7,4 a za míchání přidáno 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu.Reakční směs byla umístěna na reciproký třepací stroj (200 kyvů/min); reakce probíhala při teplotě 31 °C po dobu 3 hodin.Po této době byla suspenze zředěna 100 ml vody a odstředěna (5000 G, 10 min).Sediment byl rozmíchán v 500 ml vody a homogenní suspenze filtrována přes středně porézní filtrační papír;vlhký koláč byl intenzivně vakuově odsát.
Popsaným způsobem získané agregáty měly specifickou aktivitu penicilinacylázy 1,05 j/mg vlhké hmoty při zachycené aktivivě enzymu 55,5 %; jejich velikost činila průměrně 650run a ke kvantitativní sedimentaci došlo stáním suspenze (10 g vlhké hmoty/100 ml) v odměmém válci za 20 minut.Agregáty bylo možno velmi dobře oddělit filtrací přes středně nebo široko porézní filtrační papír.
Test stability enzymové aktivity agregátů byl prováděn za podmínek uvedených v předchozích příkladech (příklady 8,9 a 10).Po 30ti dnech nepřetržitého míchání suspenze agregátů (15 g vlhké hmoty/200 ml) byl supematant čirý,neopalescentní,в nulovou enzymovou aktivitou.K poklesu aktivity penicilinacylázy v sedimentu nedošlo.
Příklad 12
Přibližně 1000 g odpadního buněčného materiálu Saccharomyoes carlsbergensis po výrobě fenylacetylkarbinolu bylo suspendováno v 10 1 vody a po 15 minutách míchání byl materiál odstředěn; bylo získáno 600 g vlhké hmoty promytých odpadních kvasinek.
Ze 2,5 g této vlhké pasty a 7 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu bylo
197 101 připraveno 50 ml homogenní suspenze,jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,4.Do této suspenze byl přidán 1 ml 50% roztoku glutardialdehydu a směs míchána 6 hodin na reciprokém třepacím stroji (200 kyvů/min) při teplotě 29,5 °C.Potom byla směs zředěna 2x vodou,odstředěna (500 G, 10 min),, sediment suspendován v 200 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).
Specifická aktivita penicilinacylázy u tohoto preparátu byla 2,28 j/mg vlhké hmoty a zachycená aktivita enzymu činila 60,4 %.Sedimentační rychlost agregátů o jejích průměrné velikosti 450/im, měřená sedimentací suspenze agregátů (0,05 g vlhké hmoty/ml) pomocí haematologické soupravy (MPW-01, Polsko),byla 16,5 Mi/min.
Vodná suspenze (10 g vlhké hmoty agragátů/25 ml) byla emulgována ve 100 ml směsného rozpouštědla chloroform-cyklohexan 1:4 (v/v) obsahující 2 % (v/v) smáčedla (Spán 85) a emulze intenzivně míchána 3 hodiny pří laboratorní teplotě.Po této době byla emulze odstředěna (5000 G,10 min) a sediment důkladně promyt 100 ml 10% (v/v) vodného roztoku smáčedla (Tween 20).Po oddělení roztoku smáčedla byl sediment 2x promyt 250 ml vody a vždy odstředěn (500 g, 5 min.a 5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem bylo získáno 6.2 g vlhké hmoty ošetřených agregátů,jejichž specifická aktivita Činila 131 % aktivity původní (2,98 j/mg vlhké hmoty).
Příklad 13
V homogenní suspenzi o objemu 200 ml obsahující 10 g vlhké pasty odpadních buněk Sacch.carlsbergensis zÍBkané a promyté jak je uvedeno v příkladu 12,a 40 g vlhké pasty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou,bylo upraveno pH na hodnotu 7,7 a vmícháno 20 ml 10% (w/v) vodného roztoku SedipuruR KA.Suspenze ponechána flokulovat 20 hodin při teplotě 8 °C a potom pH upraveno na hodnotu 7,8. Po přidání 32 ml 25% roztoku glutardialdehydu byla směs míchána na rotačním třepacím stroji (240 ot/min) 3 hodiny při teplotě 28 °C.Po této době byla reakční směs zředěna 100 ml vody a odstředěna (500 G, 5 min),sediment byl rozmíchán v 1000 ml vody a suspenze filtrována přes silonovou tkaninu o velikosti ok 350 <um.Agregáty byly z povrchu tkaniny smyty 200 ml vody a suspenze odstředěna (5000 G, 15 min).
Popsaným způsobem bylo získáno 86,8 g vlhké hmoty agregátů o zachycené aktivitě penicilinacylázy 34,8 %,specifické aktivitě enzymu 2,1 j/mg vlhké hmoty a o jejich průměrné velikosti 750б-ит.
Z 10 g vlhké hmoty agregátů bylo připraveno 100 ml suspenze ve vodě a vpraveno do 500 ml banky opatřené třemi vlisy (zarážkami).Stabilita enzymové aktivity a mechanické vlastnosti byly zjišťovány jak je uvedeno v příkladu 3· Za 36 dní nepřetržitého míchání nepoklesla aktivita sedimentu, supematant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.Průměrná velikost agregátů činila 600 sedimentační vlastnosti zůstaly zachovány (10 g vlhké hmoty agregátů kvantitativně sedimentovalo stáním v odměmém válci za 5 minut).
Dále byla u popsaným způsobem získaných agregátu zjišťována katalytická účinnost při opakovaně provedené hydrolýze benzylpenicilinu na 6-APK tak,jak je uvedeno v příkladu 4,8 tím rozdílem, že bylo použito suspenze agregátů 13,5 g vlhké hmoty/50 ml vody a že výchozí koncentrace Na-soli benzylpenicilinu činila 7 % (w-v).Za těchto podmínek proběhl 1.cyklus konverze za 1 1/2 hodinu s účinností 89,1 % a 2.cyklus e účinností 91,4 % teoretického výtěžku 6-APK za 2 hodiny.
197 101
Příklad 14
Nepromjytý odpadní buněčný materiál Sacch.carlabergenais po výrobě piva ve formě vlhké pasty, v moŽaSví 20 g spolu se 40 g vlhké pasty buněk EcolLi obsítiujících penicilinacylázu byl použit k přípravě 400 ml směsné auspeenzejejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7.55.K této homogeemí p suspenzi bylo přidáno 40 ml 2% (w/v) vodného roztoku flokulantu Praestoln 444 K a směs byla pomsaLu míchána 20 minut.Potom bylo přidáno 32 ml 25% roztoku glutardialdehydu a za pomalého míchání míchadlem s ocelovou vrtulí bylo pH reakční směsi udržováno 10¾ (w/v) roztokem NaOH pomocí pH--tatu na hodnotě 6,9 po dobu 26 hodin při teplotě 10 °C.P0 této době byla reakční směs zředěna 250 ml vody a odstředěna (500 0, 5 min); sediment byl suspendován v 600 ml vody a opět odstředěn (5000 G, 15 min).
Takto připravené agregáty obsahovaly v celkovém možaaví 90,4 g vlhké hmoty 52 % zachycené aktivity penOiilioacylázy,jejich specifická aktivita enzymu byla 1,14 j/mg vlhké hmoty a . jejich velikost byla průměrně 870 лшъ
V suspenzi 10 g vlhké hmoty agregátů/100 ml vody došlo ke kvÉaLnttativní sed^eenai^ stáním v odměrném válci za 10 minut.Se suspenzí těchto agregátů (15 g/200 ml) byl proveden test stability enzymové aktivity stejně jak je uvedeno v příkladu 11,Po 60ti dnech nepřetržitého míchání nedošlo k poklesu aktivity sedimentu a aktivita čiréhOjneopaleaceotoího su^ť^i^i^ta^tu byla nulová.
S 50 ml vodné suspenze obsíalhjící 10 g vlhké hmoty popsaným způsobem získaných agregátů byly provedeny 2 opakované konverze 5% (w/v) roztoku Naa-ooi benoyУpenOičliou za stejných podmínek jako v předchozím příkladu,vyjma toho,že preparát byl z reakční směsi po 1.konvvrzi oddělen filtrací přes široko porézní filtrační papír a odsát; účinnost 1.konverze byla 87,5 % za 2 hodiny a 2.konverze 90,4 % teoretického výtěžku 6-APK za 1 1/2 hodiny.
Příklad 15
Z 800 .g vlhké nepromyté odpadní pasty buněk Sacch.carlsbergensis po výrobě feoylacetyltarbioolu bylo připraveno 2000 ml suspenneekterá byla hommoenizována na mechanickém desintegrátoru o
Mяa0on-Gaalio 10ti násobnou recyklací při tlaku 520 kp/cm .
Směs 2,5 ml takto připravené suspenze fragmentů kvasničných buněk a 2 g vlhké pasty buněk E. coli obí^ta^h^ájících penicilinahyláeu byla doplněna vodou na celkový objem 10 ml,po dokonalém rozmíchání bylo upraveno pH suspenze na hodnotu ·7,6.Poté bylo vmícháno 0,8 ml 25% roztoku glutardiaddehydu a směs rozzita na Petrího misku o průměru 9,5 cm a ponechána stát 15 minut při laboratorní teplotě.Reakční směs byla poté umístěna do mrsaicího boxu a při teplotě -20 °C ponechána po dobu 3 hodin; po této době byla umístěna na 16 hodin při teplotě +8 °C do komorové leloihe.Vzniklá houbovvtá hmota byla rozřezána,, homogenizována velmi intenzi Trním mícháním ocelovém vrtuov^m míchaHem po dobu 1 minuty a 2x promyta 150 ml vody; agregáty ' byly vždy odstředěny (500 G, 5 min).
Zachycená aktivita penicilioahylάzy u získaných vlhkých agregátů činila 20,7 % a specifická akkivita enzymu byla 1,07 j/mg vlhké hmoty.U agregátů v suspenzi 4,1 g/100 ml byla sledována stabilita enzymové aktivity stejnějak je uvedeno v příkladu 8.Aktvita sedimentu klesla po 30ti dnech nepřetržitého míchíání na 84,3 % původní aktivity enzymu; supenaatant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.
197 101
Příklad 16
Vlhké odpadní mycelium dřevokazné basidiomycety Oudemmisiella mucida, 1 litr kašovité biomasy, po výrobě antibiotika mmcldinu,bylo vakuově Zfiirovváno na skleněné fritě S1 a 3« promyto 2,5 1 vody,čímž byl získán vlhký koláč dobře odsátých vláken vegetativního mmcelia.K · 10 g vlhké hmoty tohoto myceHa bylo přidáno 20 g vlhké hmoty buněk E.eoli obsíandíeíeh penicilinaeylázc a směs byla homooenizována ve vodě na objem 200 ml; pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,1 a p
vmleháno 10 ml 10% (w/v) vodného roztoku Sedipuru' KA a suspenze poneohána flokulovat 30 minut stáním při laboratorní teplotě.Když bylo pH vyvločkované suspenze upraveno na hodnotu 7,5,byla suspenze smíehána se 16 ml 25% roztoku gldtareiaedehcdd a umístěna na reeiproký třepaeí stroj (200 kyvů/min); reakee probíhala 1 1/2 hodiny při teplotě 28 °C. Po přidání 100 ml vody byla zředěná směs odstředěna (500 G, 5 mn)t9eei^me^,t promyt 250 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).Popsinýfa způsobem byla získána vlhká pasta mikrobíálníeh agreg^jejichž zaehyeená enzymová aktivita činila 61,5 %specifieká aktivita peniciliiaocltzc byla 1,71 j/mg vlhké hmoty a průměrná velikost agregátů činila 550/^. K úplné а^^е^ас! agregátů ve vodné suspenzi (5 g/lOOml)· stačilo stání v odměrném válei po dobu 10 minut.
Stejně jako v příkladu 6 byla eledována stabilita enzymové ·účinnosti agregátů a po 91 dneeh byl zjištěn pokles aktivity peniciliiaeclázc v sedimentu na 77 % aktivity původ^^^^mž supernatant byl čirý a měl nulovou enzymovou aktivitu.
Míožsví 50' ml suspenze agregtů,která obsahovala 200 mg vlhké hnoy/ml bylo pobito k enzymové hydrolýze 7,5% (w/v) roztoku Na-8oSi benizCpplnieliid na 6-APK za podmínek uvedenýeh v příkladu 4. Jednorázová konverze proběhla za 1 1/2 hodiny s 73.9 % teoreteckého výtěžku 6-APK.
Příklad 17
Nepromyté odpadní dřevokazné houby Οχ^ι^^ΙοΙ^ lmcOdaJps výrobě muuidinu včetně zbytků ferroentační kapaliny (kašovitá suspenze) bylo iiíšssví 300 g této suspenze smleháno se 600 ml vody^měs byla za míchání zahřáta na teplotu 60 °C a přidáno 300 ml 20% (w/v) roztoku kyseliny trichlorsotsvé,přlelhřtté na teplotu 75 °C,načež byla teplota suspenze zvýšena na 80 °C a při této teplotě zahřívána ještě 13 m.i^n^l;.Po,té byla směs ochlazena po přídavku 800 ml studené vody na teplotu 30 °C, odstředěna (5000 G, 15 min) a sediment rozmíehán ve 2 1 vody na homogeenní tdsppliZ,je jíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,3.OOetředěníl při 5000 G po dobu 30 mindt bylo získáno 230 g vlhké hmoty ošetřpnýeh · vláken.
K homogenní suspenzi obstOmjícií 2,5 g vlhké hmaty této pasty a 10 g vlhké hmoty buněk Eci^l-i s penieil·inaoylázovsd aktivitou o výsledném objemu 200 ml bylo přidáno·po úpravě pH na hodnotu 7,3 8 ml 25% roztoku gldtardiaelhhyed,načež byla směs míehána stejně jako v příkladu 16, avšak 10 hodin při teplotě 25 °C a po této době stennim způsobem zpraeována.
Takto byly získány agregáty o zaehyeené aktivitě enzymu 35,4 % a specifieké aktivitě 2,29 j/ /mg vlhké hn^y. SSabllita jejieh enzymové ^lii^^ty byla · testována stejnějak je uvedeno v přikladu 16. Po 51 dneeh se v sdpernatantu objevilo 21»4 % výchozí aktivity penicilinaeclázc.
Překlad 18
Sdspenze 10 g kašovitého odpadního ly,celia OoC.mlcOde,jak je uvedeno v příkladu ^fbylo zře197 101 děno vodou na celkový objem 100 ml a suspenze byla desintegrována aonikácí 15 minut při laboratorní teplotě (Soniprobe ВАКЕ, Ltd.,Anglie).Homogenizováná suspenze byla zředěna 5x vodou a odstředěna (5000 G, 20 min).Získaná vlhká pasta fragmentů mycelia byla v množství 5 g smíchána a 15 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu,doplněna vodou na objem 200 ml. Po úoravě pH na hodnotu 7,7 bylo к homogenní suepenzi přidáno za míchání 20 ml 25% roztoku glutardialdehydu a dále bylo postupováno jak je uvedeno v příkladu 16 s tím rozdílem,Že míchání probíhalo 3 hodiny při teplotě 19,5 °C.
Získané vlhké agregáty měly specifickou aktivitu penicilinacylázy 2,53 j/mg vlhké hmoty při zachycené aktivitě enzymu 25,5 %·
Dále byla sledována katalytická účinnost agregátů při konverzi benzylpenicilinu provedené postupem, který je uveden v příkladu 6. Za 1 1/2 hodiny bylo dosaženo 71,9 % teoretické účinnosti hydrolýzy penicilínu na 6-APK.
Příklad 19
Ve 40 g vlhké pasty buněk E.coli obsahujících penicilinacylázu bylo připraveno 200 ml vodné suspenze.Po úpravě pH na hodnotu 7,5 bylo do homogenní suspenze vmícháno 20 ml 10% (w/v) vodného roztoku flokulantu (Sedipur KA),načež probíhalo vločkování při stání suspenze při laboratorní teplotě po dobu 25 minut. pH suspenze bylo upraveno na hodnotu 7,5 a po přidání 16 ml 25% roztoku glutardialdehydu byla reakční směs míchána 3 hodiny při teplotě 26 °C na rotačním třepacím stroji (240 ot/min).Směs byla zředěna 2x vodou a odstředěna (500 G, 5 min); sediment byl promyt 350 ml vody a znovu odstředěn (5000 G, 15 min).
Získaná vlhká pasta obsahovala agregáty navzájem vázaných enzymově aktivních buněk o průměrné velikosti 400/um.Zachycená aktivita penicilinacylázy byla 34,4 % a specifická aktivita enzymu 1,40 j/mg vlhké hmoty.Agregáty kvantitativně sedimentovalу stáním suspenze v odměmém válci (5 g/100 ml) za 10 minut.
Za podmínek uvedených v příkladu 6 byla testována stabilita enzymové aktivity popsaným způsobem získaných agregátů.Po 40 dnech nepřetržitého míchání zůstala aktivita enzymu v sedimentu zachována,přičemž supematant byl čirý a jeho enzymová aktivita byla nulová.
Za podmínek uvedených v příkladu 4 byla provedena jednorázová hydrolýza 6,25 % (w/v) roztoku Na-soli benzylpenicilinu na 6-APK 8 výsledkem 79,1 % teoretické účinnosti za 1 hodinu.
Příklad 20
К 9,6 ml homogenní suspenze o pH 7,5 obsahující 0,5 g vlhké pasty buněk E.coli s penicilinacylázovou aktivitou a 0,25 g vlhké pasty buněk Bac.megatherium ošetřených trichloroctovou kyselinou, jejíž příprava je popsána v příkladu l,bylo přidáno 0,4 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Po promíchání byla suspenze lyofilizována.Hmota,která po lyofilizaci vznikla,byla promyta vodou, mechanicky rozrušena a odstředěna 1 minutu při 1200 G.
V takto získaných agregátech o specifické aktivitě 0,4 j/mg vlhké hmoty,bylo obsaženo 14 % výchozí aktivity penicilinacylázy.
Příklad 21
К 9,2 ml homogenní vodné suspenze o pH 7»5,obsahující 3 g vlhké,částečně samovolně autolysované
197 101 pasty Ecc^l^ 8 penicilinacylázovou aktivitou,bylo přidáno 0,8 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Suspenze byla promíohána a přelita na Petriho misku o . průměru 9,5 cm.Po 15 minutách stání za laboratorní teploty byla miska přenesena na 3 , hodiny lo mrazicího prostoru při teplotě -20 °C a poté uložena 16 hodin při teplotě +8 °C. Vznnklá hmota navzájem vázaných buněk E.coli byla mechsoiicky rozrušena,promyta vodou a odstředěna 5 minut při 5000 G. '
Takto připravené agregáty obsahovaly 34,5 % výchozí enzymové Octi.ity a jejich specifická aktivita byla 3,3 j/mg vlhké hmoty.SSabilita enzymové aktivity agregátů (4 g/100 ml vody) byla hodnocena, jak je uvedeno v příkladu 8. Po 14 dnech nebyl pozorován pokles aktivity penícilinacyHzy v sedimentu^ akijivita enzymu ve slabě zakaleném supeematantu činila 10 % výcHozí aktivity penicilinacylázy. ,
Claims (12)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Mikfooiální buněčné agregáty,tb88úhλjící buňky s vysokým 'rnioostvím enzymu penicilinacylázy k přeměně peniciinnu,z©jména ienoyУpenniiliou na kyselinu 6-aminopěniciliónovou,vyznačené Ηο,ζι sestávají z enzymově aktivních mikroorganismů chemicky vázaných prostřednictvím polyfunkčních aldehydů^ výhodou glutanlialehhydu,navzáleo nebo na jiné buňky různých druhů organismů ^tným i jsou buč cllé,olptrušené,nativoí anebo fyzitálně,hheoicky či biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty proka^o^ních nebo lukaryontoích buněk různé moofologie.
- 2. МкгоШЫ buněčné agregáty podle bodu 1,vyznačené Ηο,ζι cllé,n.lptrušloé,oativoíj0leit fyzikál.ně,hheoicky či biochemicky tšl't^'^oé buňky či nerozpustné fragmenty prokaryontních nebo eukaryontních buněk jsou ve tvaru vlákln,tajltvitých·,llipscilLoích,popřípadě jiných útvarů o rozměrech 1,0 až · 1000<uo,čí buněčných fragmentů těchto buněk vzniklých samovolnou nebo uměle navozenou autdýzou,či jjkýoOttiv jin;m způsobem navozeném rozrušením.
- 3. Způsob přípravy oiktr:)biáloích agre^tů podle bodů 1 a 2,vyznačený tím^e se nechají reagovat celé olponλšenO,nativoí,ιmeio fyzikálně,hheoicty či biochemicky ošetřené buňky či nerozpustné fragmenty prokaryontních nebo lukaryontoích buněk různé morfologie s enzymově aktivními buňkami s peniciinnacyláz čivou aktivitou a polyfunkčním aldehydem.
- 4. Způsob přípravy oikroOiáloích agregátů podle bodu 3tvyznačený t:m,že reakce se provádí v přítoonotSi fltkulačoíhLt činidla.
- 5. Způsob podle bodu ^^vyznačený tím,že fl^okulační činidlo má nejméně dvě primární anebo sekundární aminové skupiny vstupující do reakce.
- 6. Způsob přípravy oikrobiáloích buněčných agregátů podle bodů 1 a 2,vyzoačloý Ηο,ζι se enzymově aktivní buňky s peniciinnacylázovou aktivitou nechájí reagovat s polyfunkčním aldehydem, s výhodou glutaldiifldehУdleo v přítomno o si fl oblačního činidla.
- 7. Způsob podle bodu ^rvyznačený Ηο,ζι fl^okulační činidlo má nejména dvě primární anebo197 101 sekundární aminoskupiny vstupující do reakce.
- 8. Způsob podle bodů 3 a 6,vyznačený tím,že po reakoi e polyfunkčním aldehydem,s výhodou glutardialdehydem se získané agregáty promyjí organickým rozpouštědlem neinaktivujícím penioilinaoylázu vybraným ze skupiny sestávající z cyclohexanu, benzenu, benzinu, toluenu, xylenu, triohlormethanu, tetraohlormethanu, triohlorethanu ,diohlorethanu, ohlorbenzenu,methylieobutylketonu, oyolohexsnonu, butylaoetátu, popřípadě jejich směsi.л
- 9. Způeob podle bodu 39vyznačený tím,že ee používá odpadních buněk organismů nebo - nerozpustných fragmentů z niob předem připravených či samovolně vzniklýoh.
- 10. Způsob přípravy mikrobiálníoh buněčnýoh agregátů podle bodu 1,vyznačený tím,že se enzymově aktivní buňky a penioilinaoylázovou akttotou - smíeí e polyfunkčním aldehydem9B výhodou glutardialdehydom,načež se zchladí pod bod tání. *
- 11. Způeob podle bodu 109vyznačený . tím,že se použije enzymově aktivních buněk в penioilinaoyláaovou aktivitou částečně autolyzovanýoh.
- 12. Způeob přípravy mikrobiálníoh agregátů podle bodů 3,C a 10,vyznačený tím,že- ee použije polyfunkčního aldehydu v množství 0,1 až 10 j hmotnostníoh.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
| DE19782833071 DE2833071A1 (de) | 1977-08-11 | 1978-07-27 | Mikrobielle zellaggregate zur umwandlung von penicillinen in 6-aminopenicillansaeure und verfahren zu ihrer herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS197101B1 true CS197101B1 (en) | 1980-04-30 |
Family
ID=5397888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS532177A CS197101B1 (en) | 1977-08-11 | 1977-08-11 | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS197101B1 (cs) |
| DE (1) | DE2833071A1 (cs) |
-
1977
- 1977-08-11 CS CS532177A patent/CS197101B1/cs unknown
-
1978
- 1978-07-27 DE DE19782833071 patent/DE2833071A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2833071A1 (de) | 1979-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhushan et al. | Immobilization of lipase by entrapment in Ca-alginate beads | |
| EP0034609B1 (en) | Immobilized enzyme(s) and microorganism(s) and their production | |
| Kath et al. | Mild enzymatic isolation of mannan and glucan from yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| Knorr et al. | Chitosan immobilization and permeabilization of Amaranthus tricolor cells | |
| JPH0218070B2 (cs) | ||
| Champluvier et al. | Immobilization of β-galactosidase retained in yeast: adhesion of the cells on a support | |
| EP0594125A2 (en) | Carrier for supporting microorganisms, soil remediating agent using carrier, and method for remediating soil | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| Okita et al. | Covalent coupling of microorganisms to a cellulosic support | |
| RU2043995C1 (ru) | Способ получения глюкан-хитозанового комплекса | |
| Khan et al. | Genetic transformation in yeasts | |
| CS197101B1 (en) | Microbial cellular aggregates for the transformation of peniciline into 6-aminopenicilanic acid and process for preparing thereof | |
| Kluge et al. | Production of 6-aminopenicillanic acid by immobilized Pleurotus ostreatus | |
| El Menoufy et al. | Comparative studies of free and immobilized partially purified lipase from NRRL-599 produced from solid-state fermentation using gelatin-coated titanium nanoparticles and its application in textile industry | |
| DE3301102C2 (cs) | ||
| Iqbal et al. | Vegetable sponge as a matrix to immobilize micro‐organisms: a trial study for hyphal fungi, yeast and bacteria | |
| CN1059759A (zh) | 复合固定化酶的制备方法 | |
| Förster et al. | Immobilization of citrate-producing Yarrowia lipolytica cells in polyelectrolyte complex capsules | |
| West et al. | Polysaccharide production by sponge‐immobilized cells of the fungus Aureobasidium pullulans | |
| Dobreva et al. | Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable α-amylase, on polymer membranes | |
| EP0494950B1 (en) | Fungal cell wall material with flocculant properties, method for its production | |
| AU2007328063B2 (en) | Microbial process for production of enzymes | |
| US4757008A (en) | Enzyme immobilization in a macroporous non-ionic resin | |
| JPH0372879A (ja) | 微生物固定化繊維の製造法 | |
| RU2144079C1 (ru) | Штамм бактерий pseudomonas cepacia вдк вкпм в-7559 - деструктор фенола и формальдегида |