CS195451B1 - Process for the separation and purification of proteins - Google Patents
Process for the separation and purification of proteins Download PDFInfo
- Publication number
- CS195451B1 CS195451B1 CS11477A CS11477A CS195451B1 CS 195451 B1 CS195451 B1 CS 195451B1 CS 11477 A CS11477 A CS 11477A CS 11477 A CS11477 A CS 11477A CS 195451 B1 CS195451 B1 CS 195451B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- proteins
- imidazole
- separation
- column
- purification
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 125000005397 methacrylic acid ester group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 8
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 8
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 7
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 108010085838 cytochrome P420 Proteins 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 102200020326 rs121908517 Human genes 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu dělení a čištění proteinů, s výhodou hemoproteidů. Postup je použitelný v chemickém, farmaceutickém a biochemickém průmyslu, jakož i v klinické chemii, analytice a diagnostice.The invention relates to a process for the separation and purification of proteins, preferably hemoproteids. The process is applicable in the chemical, pharmaceutical and biochemical industries as well as in clinical chemistry, analytics and diagnostics.
K dělení, resp. čištění proteinů se používá různých metod, které využívají rozdílů ve fyzikálních a biochemických vlastnostech proteinů, které, se mají rozdělit, jako je · rozpustnost, stálost, velikost molekuly, elektrický náboj atd. /N. REHFELD, D. REICi-JELT: Analytische und práparative Methoden der klinísche.n Biochemie, Akad . Verlag Berlin 1972, S. SCHWIMMER a A. B. PARDEK: Adv. ín Enzyinology 14, 375/. Tyto způsoby jsou zčásti časově velmi náročné a materiálově nákladné a dostatečné čistoty lze často dosáhnout j -·- η z n v y s o k ý c. b ztrát n a v ý t ě ž k u V poslední době získávají rostoucí vý2 znám postupy afinitní chromato^rafíe, které spočívají na tvorbě specifických bioařinních proteinových komplexů. Tak je např. popsáno oddělení hemoglobinu /Hb/ na základě tvorby komplexu s haptoglobinem /m. KLEIN a C. ÍKAESCO: Biochem. biophys. Res. Commun. 52,For division, respectively. Protein purification is used by various methods which exploit differences in the physical and biochemical properties of the proteins to be separated, such as solubility, stability, molecular size, electrical charge, etc. / N. REHFELD, D. REICi-JELT: Analytical and Comparative Methoden der Klinische.n Biochemistry, Akad. Verlag Berlin 1972, S. SCHWIMMER and A. B. PARDEK: Adv. Enzyinology 14, 375]. These processes are in part very time consuming and materially expensive, and sufficient purity can often be achieved. B. specific bio-active protein complexes. For example, separation of hemoglobin (Hb) by complexing with haptoglobin / m is described. KLEIN and C. IKAESCO: Biochem. biophys. Res. Commun. 52,
774 /1973/7'a s ímidazolem, popř. jeho deriváty.774/1973 / 7'a with imidazole, respectively. its derivatives.
Předmětem vynálezu je způsob dělení a čistění proteinů, jehož podstatou je, že se vodný roztok obsahující proteiny při\’ede do styku s imidazolovým sorbentem, který obsahuje imidazolový derivát vázaný na makromolekul ár n im ve vodě nerozpustném nosiči, přičemž nosičem jsou bud polymery esterů kyseliny methakryiové sírované ethylendimethakryláfcem obecného vzorce ISUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a process for separating and purifying proteins, comprising contacting an aqueous solution containing the proteins with an imidazole sorbent comprising an imidazole derivative bound to a macromolecule and a water insoluble macromolecule, the carrier being either ester polymers methacrylic acid sulfurated with ethylenedimethacrylate of formula I
CH„CH "
CH..-C-CO-OCH CHo-0-C-NH- (CH ) -N=CH-(CH? ) m-Cll=N-N~CH.,-CH ,-r——iN ’ IIC ..- CH-CO-O-CH about -0-C-NH- (CH) -N = CH- (CH?) M -CLL = NN ~ CH., - CH -r - IN 'II
NH kd e n /1/ nebo obecného vzorce IINH 2 n (1) or (II)
CH0 CH 0
I 2 ,I 2 ,
CH.-C-C- O-CH,~CH. 3 I li ' 2 2CH-C-C-O-CH, -CH. 3 I li '2 2
kde n 1 až· 3 nebo polysachar idy jako celulóza nebo agaróza nebo sírované dextrany, a t:o při pK 7 až 11, popřípadě v přítomnosti detergentů nebo glycerinu při teplotě 0 až 30 °C, s výhodou při. teplotě místností, načež se proteiny obsažené v roztoku izolují.wherein n 1 to 3 or polysaccharides such as cellulose or agarose or sulfur dextrans, and at a pK of 7 to 11, optionally in the presence of detergents or glycerin at a temperature of 0 to 30 ° C, preferably at. the proteins contained in the solution are isolated.
Metoda podle vynálezu slouží zejména k dělení hemoglobinu od myoglobinu nebo cytochromu P 450 od cytochromu P 420 .In particular, the method according to the invention serves to separate hemoglobin from myoglobin or cytochrome P 450 from cytochrome P 420.
Základem vynálezu je využití, tvorby specifických bioafinních proteinových komplexů a nalezení vhodného způsobu dělení na bázi afinitní chromatografie. Jedná se o jednoduchý a obecně použitelný způsob dělení a Čištění proteinů, s výhodou hemoproteidů, který je použitelný analyticky i preparativně a dosahuje dobrých výtěžků.The invention is based on the use, formation of specific bioaffin protein complexes and finding a suitable method of affinity chromatography separation. It is a simple and generally applicable method of protein separation and purification, preferably of hemoproteins, which can be used analytically and preparatively and achieves good yields.
Imidazol nebo jeho derivát se váže na nosič přímo nebo prostřednictvím spacerů. Styčnými místy jsou kruhový dusík v poloze -2 nebo 4 /5/ ímidazolového kruhu.Imidazole or a derivative thereof binds to the carrier directly or via spacers. The points of contact are the ring nitrogen at the -2 or 4 (5) imidazole ring position.
Výroba těchto imidazolových sorbentů spočívá na známých postupech. K realizací vynálezu lze použít imidazolové sorbenty připravené podle autorského osvědčení č. 186 929:The preparation of these imidazole sorbents is based on known processes. Imidazole sorbents prepared according to the author's certificate No. 186 929 can be used for the implementation of the invention:
a/ imidazolový sorbent se vnese do roztoku obsahujícího proteiny a po době potřebné k adsorpci, asi po 1 až 24 hodinách se filtrací opět oddělí /postup vsádkový/;a) the imidazole sorbent is introduced into a solution containing the proteins and after a period of time for adsorption, after about 1 to 24 hours, is separated again by filtration (batch process);
b/ imidazolový sorbent je ve sloupci /v koloně/, na který se přivádí roztok obsahující proteiny /sloupcový způsob/.b) the imidazole sorbent is in a column (column) to which a protein-containing solution (column method) is fed.
V sád kovy postup je zvláště výhodný pro čisticí operace, tj. při oddělování nečistot. Po provedení tohoto způsobu zůstane jeden z proteinů vázaný na sorbentů, kdežto ostatní zůstanou v roztoku, který se má izolovat. Proteiň se izoluje z roztoku zahuštěním nebo vysrážením známým způsobem. Sloupcový způsob je zvláště výhodný pro dělicí operace, jsou-li proteiny vázány na sorbent různě silně, ale ne pevně. Roztok obsahující proteiny se přivádí na sloupec pH 7 až 10, popřípadě v přítomnosti detergentů nebo glycerinu, při teplotách 0 až 30 °C, s výhodou při teplotě místnosti. Potom se za týchž podmínek eluuje, přičemž proteiny se postupně objevují v eluční kapalině na základě různě pevné vazby k sorbentů. Odpovídající frakce se odebírají a izolace získaných čistých proteinů se provádí známým způsobem.In metal kits, the process is particularly advantageous for cleaning operations, i.e., for separating impurities. Following this process, one of the proteins will remain bound to the sorbents, while the others will remain in the solution to be isolated. The protein is isolated from the solution by concentration or precipitation in a known manner. The column method is particularly advantageous for separation operations when the proteins are bound to the sorbent differently but not firmly. The protein-containing solution is fed to a column of pH 7 to 10, optionally in the presence of detergents or glycerin, at temperatures of 0 to 30 ° C, preferably at room temperature. It is then eluted under the same conditions, whereby the proteins gradually appear in the elution liquid on the basis of different strength binding to the sorbents. The appropriate fractions are collected and the obtained pure proteins are recovered in a known manner.
. Způsob podle vynálezu je jednoduchý svým provedením a je s výhodou obecně použitelný. Proteiny, které se mají dělit, resp. čistit, se získají v dobrých výtěžcích a ve vysoké čistotě. Tak např. ze směsi hemoglobinu a myoglobinu byl získán sloupcovým způsobem chromaLografícky čistý myoglobin s výtěžkem nad 90 %. Ze směsi cyto~ chrómu P45O a cytochromu P42O byl vsádkovým postupem odstraněn cytochrom P42O z 85 Z. Použité nosiče lze, popřípadě po jejich regeneraci, opakovaně použít.. The process according to the invention is simple in its implementation and is preferably generally applicable. Proteins to be separated, respectively. they are obtained in good yields and in high purity. For example, from a mixture of hemoglobin and myoglobin, a chromatographically pure myoglobin was obtained in a column manner with a yield of over 90%. Cytochrome P42O from 85 Z was removed in a batch process from a mixture of cytochrome P45O and cytochrome P42O by a batch process.
Vynález je osvětlen na několika příkladech, které jej ovsem nijak neomezují.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.
Příklad 1Example 1
CHCH
CH „-C-CO-OCH . CH o-0-C-NH - ÍCH-N=CH-(CH. 3 i 2 2 j| k 2' n '2CH 2 -C-CO-OCH. Of CH -0-C-NH - ICH-N = CH- (CH. 3 i 2 j 2 | k 2 'n 2
I NHI NH
-CH=N-CHO-CH m 2-CH = N-CH O -CH m 2
/1/ n x 6 m - 3 se uvede ve sloupci s 0.1 M pufrem pH 8 do rovnovážného stavu. Na sloupec se přidá 1 ml roztoku hemoglobinu a myoglobinu /hovězí/ - koncentrace každého hemoproteidu 2,5.10“^ val - a potom se eluuje na sběrači frakcí pufrem pH 8.(1) n x 6 m - 3 equilibrate in a column of 0.1 M pH 8 buffer. 1 ml of hemoglobin and myoglobin (bovine) solution - each hemoproteid concentration of 2.5 x 10 6 - were added to the column and then eluted on the fraction collector with pH 8 buffer.
V eluátu se získá přes 90 7, myoglobinu, kdežto hemoglobin zůstává adsorbován na sorbentů. Takto získaný myoglobin je gelchromatograficky jednotný.Over 90% of myoglobin is recovered in the eluate, while hemoglobin remains adsorbed on sorbents. The myoglobin thus obtained is gelchromatographically uniform.
Příklad2Example2
3,0 g imidazolového sorbentů se strukturní jednotkou obecného vzorce II /n - 1,2/ Vzorec II:3.0 g of imidazole sorbents having a structural unit of the formula II / n - 1.2 / Formula II:
se uvede do rovnovážného stavu s pufrem pH 8 na sloupci. Na sloupec se nadávkuje 1 ml směsí hemoglobinu /hovězí/ a myogloH binu /hovězí/ 1 : 1 s celkovou koncentrací 4-5.10-4 val/1 a potom se eluuje pufrem pH 8 na sběrači frakcí.equilibrate with a pH 8 buffer on the column. 1 ml of a 1: 1 mixture of hemoglobin (bovine) and myoglobulin (bovine) with a total concentration of 4-5 x 10 -4 val / l was added to the column and then eluted with pH 8 buffer on the fraction collector.
Ge1chromatografické stanovení proteinových frakcí ukazuje, že při použití imídazolového sorbentů, kde n = 2, se eluuje čistý myoglobin a v případě n = 1 se myoglobin v porovnání s hemoglobinem silně obohatí.Geochemical determination of protein fractions shows that using imidazole sorbents, where n = 2, elutes pure myoglobin and in the case of n = 1 myoglobin is strongly enriched compared to hemoglobin.
Příklad 3Example 3
100 mg, resp. 1 ml zbotnalého imidazolového sorbentů obecného vzorce II, kde n » 1 nebo 2, se uvede do rovnovážného stavu s pufrem pH 7,4, 0,1 M fosfátem, 6%ním cholátem sodným, 1 mM ethylendiamintetraocto vou kyselinou /EDTA/, 1 mM dithioer ythr i.tem, popřípadě 20% glycerinem. Přidá se 1 ml roztoku obsahujícího z králičích jater izolovaný Cyt P45Q/P42O /koncentrace 80 až 150 san, 13 až 36 % P 420/ a vzorek se třepe 18 hodin při 4 °C nebo dvě hodiny při teplute misLnosti. V e1u a l u je obsah Cyt P42O až z 87 % výchozí hodnoty odstraněn.100 mg, respectively. 1 ml of the swollen imidazole sorbents of formula II, wherein n »1 or 2, is equilibrated with a pH 7.4 buffer, 0.1 M phosphate, 6% sodium cholate, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1 mM dithioer yttrem, optionally 20% glycerin. Add 1 ml of a solution containing Cyt P45Q / P42O (concentration 80-150 san, 13-36% P 420) isolated from rabbit liver and shake the sample for 18 hours at 4 ° C or for two hours at room temperature. In e1u and lu, the Cyt P42O content is removed up to 87% of the baseline value.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS11477A CS195451B1 (en) | 1977-01-07 | 1977-01-07 | Process for the separation and purification of proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS11477A CS195451B1 (en) | 1977-01-07 | 1977-01-07 | Process for the separation and purification of proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS195451B1 true CS195451B1 (en) | 1980-02-29 |
Family
ID=5332714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS11477A CS195451B1 (en) | 1977-01-07 | 1977-01-07 | Process for the separation and purification of proteins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS195451B1 (en) |
-
1977
- 1977-01-07 CS CS11477A patent/CS195451B1/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7449116B2 (en) | Methods and systems for protein separation | |
| Harris et al. | QUANTITATIVE CHROMATOGRAPHIC METHODS: PART 7. ISOLATION OF AMINO ACIDS FROM SERUM AND OTHER FLUIDS | |
| JP2016538264A (en) | Purification method of recombinant protein | |
| SU1523046A3 (en) | Method of purifying human beta-interferon | |
| RU2001135838A (en) | DNA purification methods and purified DNA | |
| Davison | Chromatography of histones | |
| Grinberg et al. | Protein aggregation in high-performance liquid chromatography: hydrophobic interaction chromatography of. beta.-lactoglobulin A | |
| Lam et al. | Stereoselective D-and L-amino acid analysis by high-performance liquid chromatography | |
| CN1175105C (en) | Purification of vitamin K-dependent proteins by means of membrane chromatography | |
| US5480542A (en) | Packings combining protein to a support via a spacer | |
| US3976767A (en) | Purification of hepatitis B surface antigen by chromatography on agarose containing aminoalkyl residues | |
| JP2573467B2 (en) | Pharmaceutical compositions suitable for therapeutic use containing factor IX protein | |
| CA2024250A1 (en) | Method for purifying low molecular weight compounds of peptide of pseudo-peptide structure | |
| GB1597182A (en) | Soluble complex former for the affinity specific separation of macromolecular substances its preparation and its use | |
| CS195451B1 (en) | Process for the separation and purification of proteins | |
| CN101575370A (en) | Method for enriching low-abundance protein in serum | |
| JP2010522696A (en) | Chiral selector that separates enantiomers of compounds | |
| JP2007502970A (en) | Method for detecting tropolone comprising complexing tropolone with Cu (II) | |
| JP2010148442A (en) | Method for concentrating glycopeptide having sulfated sugar chain and kit therefor | |
| JP6343675B2 (en) | Purification of organic compounds by preparative HPLC mediated by surfactants. | |
| JP4013150B2 (en) | Purification method of phosphopeptide derived from natural sample using titania column | |
| Cochet et al. | Chromatography of human immunoglobulin G on immobilized Drimarene Rubine R/K-5BL Study of mild, efficient elution procedures | |
| Shen et al. | Hydrazide as a ligand moiety in immobilized metal ion affinity chromatography: Separation of BO–IMI and BODIPY–hydrazide | |
| JP2005189104A (en) | Protein or peptide concentration separation method | |
| JP2001056326A (en) | Purification method and measurement method of serotonin and 5-hydroxyindoleacetic acid |