CN2203301Y - 一种蛋白纯化、浓缩装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型是一种蛋白分离、纯化、浓缩装置。 即在电解槽中间置入两片渗透膜，控制膜间距在0.2 ～2cm之间，待侧样品从膜间进入，通过置换膜两侧 不同溶液介质，膜间样品和溶液介质与膜两侧溶液介 质不断从两个方向泵入对流，待测样品在膜间和膜两 侧扩散平衡。达到分离、纯化目的。也可将分离、纯 化和浓缩三装置串联一体，使待测样品从分离到浓缩 一步完成。该装置简单易作，能分离已知等电点的蛋 白质，去除两性电介质并浓缩蛋白。

Description

本实用新型是一种生物工程中蛋白分离、纯化、浓缩装置。

目前已有的蛋白纯化、浓缩较多用的等电聚焦装置、透析装置和蛋白浓缩装置都存在时间长、效率低的不足之处，如用于分离不同等电点蛋白质的等电聚焦装置，它是利用电场的作用力将两性电介质排列成连续的PH梯度，当蛋白质分子泳动到它等电点PH处时蛋白质不带电荷，也不再继续泳动，反之蛋白质就会不断的迁移。因此不同等电点的蛋白质分子聚集于不同的位置，达到分离的目的。这种方法为了提高分辨率就要使PH梯度间距扩大，形成平衡时间延长，短则4～6小时，长则24小时，这样长的时间蛋白质分子处于两性电介质中易使蛋白质分子变性；又如传统的透析装置是在无电场存在下进行的，透析是将透析袋浸在烧杯中进行，袋内外离子的平衡仅靠扩散力的作用，因此完成一次透析时间较长，蛋白质分子长期处于这种透析状态下容易发生变性；透析除去两性电解质后的分离蛋白浓度较低，需经多步浓缩后方能使用。一般的浓缩处理也是在透析袋中进行，同样道理由于透析袋的表面积小，需长时间的平衡，而且浓缩是在非流动状态下进行，透析袋内部水分子难以扩散。这些不足均存在于传统的蛋白质分离、纯化、浓缩过程中。对现有装置进行改进，可以提高纯化，制备蛋白质的效率。

本实用新型的目的是改进现有的等电聚焦装置结构，制作成一种能高效、快速分离、纯化、浓缩蛋白质的装置。

本实用新型的蛋白质分离、纯化、浓缩装置主要是电解槽，渗透膜和适当溶液组成，其主要特点是电解槽可制作成长方体或园柱体，电解槽内电极、离子交换膜和电解液组成电解槽，两片渗透膜以一定的膜间距置于电解槽正中，渗透膜之间分别有待收集蛋白的入口和分离、纯化、浓缩后蛋白的出口，渗透膜两侧分别有溶液电介质的出口和入口，渗透膜间流动着样品与溶液介质混合物，渗透膜两侧流动着溶液介质，它们的流动方向向反。根据分离、纯化或浓缩的不同要求更换不同的渗透膜，并在渗透膜两侧注入不同的溶液介质。

电解槽内的渗透膜置于阳离子交换膜和阴离子交换膜中间，如果将渗透膜置换成能通过大分子的渗透膜，膜间距范围0.2cm～2.0cm，大分子的渗透膜是能使蛋白质大分子通过而不会使两性电介质溶液通过的渗透膜，在膜的两侧分别注入略高于或略低于待收集蛋白等电点的两性电解质，渗透膜中间腔内是与待收集蛋白质等电点相同的两性电解质和欲分离蛋白的混合物，开始分离时使蛋白质、两性电解质混合物流过有电场作用的中间腔，高于或低于待收集蛋白等电点的两侧两性电解质通过迎头对流而流向渗透膜两侧，两渗透膜中间腔内的杂蛋白根据各自不同的等电点向两侧中的一侧泳动，最后中间腔内剩下即是所需分离的蛋白质。该装置的电动泵不断将待收集蛋白泵入渗透膜间通道，将溶液介质与蛋白入口反方向泵入渗透膜两侧通道，使溶液介质与待收集蛋白对流泳动，这样可大量纯化制备已知等电点的蛋白质。

电解槽内渗透膜换成半透性薄膜，用透析液置换电解液，接上电源即成为该装置的第二种使用形式－电透析装置，该过程使离子的平衡在扩散的同时又加上电场力的作用，因此大大缩短了平衡时间。本实用新型设计中两半透膜之间距离与膜面积相比是膜间距窄而表面积大，且是隔着透析膜迎头对流，加快了平衡时间。半透膜选择恰当，经过短时间的平衡后，两性电解质可基本分离，得到单一等电点无杂质的蛋白质。

电解槽内装置不变，仅将透析膜两侧的液体置换成一定浓度的聚乙二醇溶液，不通电源，即为蛋白浓缩装置，经过透析除去两性电解质后的蛋白浓度很低，需多步浓缩。传统的浓缩处理也能在透析袋中进行，但是透析袋表面积较小，难于快速平衡，且非流动状态下使用会造成透析袋内表面的蛋白很快被吸干并粘附于袋表面，此时内部水分子更难扩散出来。本设计采用流动脱水，即待浓缩蛋白液用泵从膜间一侧进入，聚乙二醇从反方向泵入透析膜两侧，两者对流使蛋白脱水，这样可使分离蛋白液体均匀脱水而不至于发生表面蛋白过浓中间难于脱水的情况，这样的脱水过程既安全又高效。

本实用新型的电解槽可以是长方体或园柱体，长方体尺寸或园柱体尺寸可参照传统等电聚焦装置，或者比之小些。由于本装置是预置梯度，即欲收集的是已知等电点PH值的蛋白，大于或小于该PH值的蛋白均泳向渗透膜两侧，这样就比传统装置距离缩短许多，不必象传统装置那样有完整的PH梯度展开。

本实用新型渗透膜间距不可太大，太大了要增大平衡时间，一般在0.2～2cm范围内较为合适。电极面积可根据膜间距调节，以既不使电流过大而又使分辨率提高为准。电介槽材料可用玻璃或其它不导电材料制作。

本设计可按分离、纯化、浓缩要求分别制成三个装置，然后串联起来，集分离、纯化、浓缩于一体，有效地达到三者合一的目的。

本实用新型是在传统的等电聚焦装置基础上改建而成，改革了连续PH梯度带来的长时间电泳，缩短现有装置的距离，能有效地分离已知等电点的蛋白质。该设计的装置只要适当更换渗透膜和置换溶液介质，即可分别作为分离、纯化、浓缩蛋白质的装置。也可将分离、纯化、浓缩三种方法融于一体，连续操作。与已有的分别用于分离、纯化、浓缩的三种装置相比，等电聚焦分离具有下列效果：

（1）传统的制备型等电聚焦装置两极间的距离较长（约数十厘米），目的是拉开梯度以求达到好的分辨率，这样做的结果是使电泳时间延长；但如果缩短间距又会引起分离效率下降。因本设计为单一组份纯化，所以极间距可短至数毫米，使蛋白质分子的平衡在极短的时间内完成。

（2）传统的等电聚焦装置运行时是向其中加入一定PH范围的两性电解质，然后在电场的作用下形成稳定的pH梯度，这就使蛋白质分子的分离时间大大延长。本设计为预置梯度式，三个pH梯度在一开始电泳就已形成，能大大缩短分离时间，也避免了因长时间电泳而引起的种种问题。

（3）由于本设计电极间面积与膜间距相比很大，使散热面积大，更由于流动过程中泵入的是预冷的混合物（中间腔内）与两性电解质（膜两侧），可进一步防止过热现象的产生。这种设计允许使用较大的电场强度，能使平衡时间进一步缩短。短时间内完成电泳能防止蛋白质分子因长期暴露于电场中而引起的变性，也能防止长时间电泳引起两性电解质降解，降解的结果将导致pH梯度的飘动。

（4）传统的等电聚焦是在封闭的系统中进行，当达到聚焦平衡后（指一定长的时间后电压及电流不再改变时）样品的纯度就已经被确定了。而本设计用隔着薄膜的迎头对流形式，分离蛋白的纯度就会随着电泳的进行越来越高，迎头对流的另一个特点是越是干净的两侧电解质将碰到越是干净的分离蛋白，反之也反之。这样的结果是两侧电解质吸除杂蛋白有着最大的容量与最高的效率。

（5）传统的等电聚焦收集蛋白质组份时都要去除所加的电场，尽管收集以很快的速度进行仍不可避免地会引起分离条带的扩散，使分离效率下降。本设计为流动收集样品，不需停电操作，不存在因去除电场而引起的样品扩散问题。

（6）传统的制备型等电聚焦的样品容量只能事先根据实验确定，一旦开始电泳就不能进行调整。等电聚焦时若是加入蛋白量不足就会浪费很多容量，若是加入蛋白量过多又会引起分离效率的下降。本设计为流动式电泳及收集，能连续加样并保证收集到的样品纯度，且不必为制备容量操心。

（7）传统的制备型等电聚焦中蛋白沉淀是造成实验失败的原因之一，为避免蛋白沉淀又要引进如尿素、表面活性剂等化学物质，这些化学物质往往会使蛋白变性，最终这类实验将因两种因素的相互牵制而不能顺利进行。本设计中将混合物与欲分离蛋白相同等电点的两性电解质混合后在中间腔内运行，即使有蛋白沉淀也不会影响分离效果，况且随着电泳的进行由于蛋白过浓而引起的沉淀还会自行消失；至于由于到达等电点而形成的沉淀也不会对分离效率造成影响。

（8）传统的制备型等电聚焦装置收集到的分离组份都跨跃几个、甚至更多个pH单位，其中除个别组份外其余部份都是无用蛋白，这种装置既延长了电泳平衡时间又浪费了两性电解质，还花费了很多人力去收集一些不必要的组份。本设计为单组份收集装置，从开始制备时就考虑到避免不必要的浪费。

本实用新型作为透析纯化装置具有以下效果：

传统的透析是在无电场存在时进行的，由于袋内外离子的平衡仅靠扩散力的作用使平衡过程难于真正到达。而电透析过程可以使离子的平衡在扩散力的基础上再加上电场力的作用，使平衡所需时间缩短。本设计的另一个特点是使被透析液体具有非常大的接触表面。传统的透析是在柱状透析袋中进行，直径较小的袋完成一次透析需3～4小时，直径较大的袋需10小时以上，而蛋白质分子长期处于这种状态下时容易发生变性反应。本设计的中间腔很窄而表面积非常大，能使离子的扩散平衡在非常短的时间内完成。本实用新型是流动透析，传统的透析是将透析袋浸在烧杯中进行，一段时间后换去烧杯中已平衡的液体后再行透析。而本装置是隔着透析膜进行迎头对流，与静止透析不同，可使透析平衡具有最快的速度，同时使透析液的利用具有最大的效率。

本实用新型作为浓缩蛋白装置具有以下效果：

一般情况下透析除去两性电解质后的分离蛋白浓度都较低，需经多步浓缩后方能使用及长期保存。传统的浓缩处理也能在析袋中进行，同样由于透析袋的表面积小，难于很快达到平衡；而且由于非流动状态下使用会造成透析袋内表面的蛋白很快被吸干并粘附于袋面，这时内部水分子就更难扩散出来。本装置是流动脱水形式，可使分离蛋白液体均匀脱水而不发生表面蛋白过浓及中间难于脱水的情况。脱水过程安全高效。

以上是本装置的三种使用形式，其间的转换仅是更换薄膜而已，使用非常方便。此外电极、支架等装置只有一套。本设计也可将三种形式联用，即按等电聚集一透析一浓缩次序相连，这种情况下不用更换薄膜的操作就可一次性完成分离纯化及浓缩过程。

本实用新型将传统的等电聚焦装置由静态工作改为动态工作，提高了分辨率和分离效率，同时将展开的pH梯度减至欲收集pH值及其上、下两个pH值，缩短了分析时间，既可用于分离已知pH值的蛋白，也可用于纯化、浓缩蛋白。

图1是本装置的示意图。

实施例：用玻璃制成尺寸为3×7×10（cm）的电解槽槽的两侧安置阴、阳电极和离子交换膜，在电极与离子交换膜之间注入相应的电解液。中间置入两片渗透膜，膜间距控制在0.3cm范围，渗透膜两侧与离子交换膜之间的距离在0.3－0.4cm之间，电解槽的对应两侧分别开有待分离和已分离蛋白的出口、入口，样品的出、入口可连接微量泵连续进行。

Claims (4)

1、一种蛋白分离、纯化、浓缩装置，由电解槽、渗透膜和适当溶液组成，其特征在于电极(1)离子交换膜(2)和电解液(3)组成电解槽，两片渗透膜(4)以一定的膜间距在电解槽中间，电解槽渗透膜之间分别有待收集蛋白的入口(5)和纯化浓缩后蛋白的出口(6)，渗透膜两侧分别有溶液电介质的出口(7)和入口(8)，渗透膜间是流动着的样品与溶液介质混合物，渗透膜两侧是流动的溶液介质，渗透膜之间与渗透膜两侧浓液介质的流动方向向反，渗透膜与溶液介质可以是下列的一种：

(1)渗透膜可以是大分子渗透膜，膜两侧溶液介质是略高于或略低于待收集蛋白等电点的两性电解质；

(2)渗透膜可以是半透性薄膜，膜两侧溶液介质也可以是透析液；

(3)半透性薄膜两侧的溶液介质是聚乙二醇溶液。

2、根据权利要求1所述的蛋白分离、纯化、浓缩装置，其特征在于电解槽可以是园柱体、长方体。

3、根据权利要求1所述的蛋白分离、纯化、浓缩装置，其特征在于电解槽内膜间距在0.2～2cm范围内较佳。

4、根据权利要求1所述的蛋白分离、纯化、浓缩装置，其特征在于可以是分离、纯化、浓缩串联一体的装置。

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